方法論記事

複合ニキビのラットモデル

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DOI：

10.3791/65859

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2024年11月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 2School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、オレイン酸と Cutibacterium acnesを使用してラットの皮膚ににきびの炎症を誘発する手順を概説しています。

要約

尋常性ざ瘡は、顔、首、胸に面皰、丘疹、膿疱が存在することを特徴とする一般的な慢性皮膚疾患です。尋常性ざ瘡の炎症をシミュレートするために、このプロトコルでは、オレイン酸と Cutibacterium acnes (C.acnes)を使用してラットの耳ににきびの炎症を誘発することにより、複合にきびげっ歯類モデルを確立するアプローチについて詳しく説明します。ラットを4つのグループにランダムに分けました:正常対照群(NC)、オレイン酸群(OA)で治療された耳、 アクネス菌 グループ(C.アクネス)で治療された耳、オレイン酸と アクネ菌 (OA+ アクネス)で治療された耳。過剰な皮脂産生を模倣するために、オレイン酸をOAおよびOA+ C.acnes グループのラットの耳に25日間塗りました。

21日目から25日目にかけて、 アクネ菌 懸濁液を アクネ菌 群およびOA+ アクネス 菌群のラットの耳に皮内注射し、ニキビの炎症を悪化させた。耳の厚さは、炎症の重症度の尺度として毎週測定されました。肉眼観察、ヘマトキシリンとエオシンの染色、免疫組織化学(IHC)を行った結果、OA群と OA+アクネス菌 群の耳が肥厚して硬直し、紅斑や面皰の存在を伴ったことが示された。さらに、丘疹は C.acnes およびOA+ C.acnes グループで観察されました。組織病理学は、OAおよびOA+ C.アクネス 群の毛包の角質増殖および拡張を示した。炎症細胞および膿瘍の浸潤は 、アクネ菌 およびOA+ アクネス菌 群の真皮に認められた。IHCの結果により、 C.acnes およびOA+ C.acnes グループの真皮における腫瘍壊死因子(TNF)-αのレベルの増加が確認されました。上記のすべての結果は、複合にきびげっ歯類モデルの成功した確立をまとめて示しています。

概要

尋常性ざ瘡は、顔面、首、胸部に面皰、丘疹、膿疱が存在することを特徴とする一般的な慢性皮膚疾患であり、重症の場合、結節、嚢胞、永久的な瘢痕に進行する可能性があります1。疫学研究によると、にきびは世界人口の9.4%に影響を及ぼし、その結果生じる症状は深刻な身体的および心理社会的課題をもたらします2,3。

にきびの病因は多因子性であり、皮脂の過剰産生、面皰形成、皮膚微生物叢による卵胞のコロニー形成、および毛様皮脂腺ユニットの周囲の炎症性メディエーターの放出という4つの重要なプロセスが含まれます4,5。皮脂分泌の増加により、過剰な不飽和遊離脂肪酸(UFA)が蓄積すると、ゲノム研究で示されているように、皮膚微生物叢(その1つがアクネ菌)の異常な繁殖に寄与します6。一方、皮膚微生物叢は皮脂を分解し、UFFAの濃度を高めることで、悪循環に陥ります7。さらに、過剰なUFFAは毛包の角質増殖を引き起こし、それが次ににきび8を引き起こします。皮膚微生物叢と皮脂の増加はどちらもToll様受容体(TLR)を活性化し、インターロイキン(IL)-1やTNF-αなどの複数の炎症誘発性サイトカインを産生します9,10。この炎症のカスケードは、皮脂の増加と微生物の異常増殖と相まって、毛包の顕著な角質増殖症とにきびの発症につながります11。

にきび研究および関連した臨床条件の分野の急速な開発はラットの耳、ラットまたはマウスの背部およびウサギの耳12,13,14,15のにきびの炎症の一連の動物モデルの作成を運転した。方法には、Cの皮内注射が含まれます。にきび、皮脂腺の異常な分泌と角質増殖をシミュレートするための皮膚への油の塗布、または皮膚の炎症を加速してにきび16,17,18,19を形成するための両方の組み合わせ。ただし、化学薬品や生物剤の使用法と投与量は以前の研究によって異なり、適切なにきびモデルを確立しようとする研究者を混乱させる可能性があります。この研究は、複合にきびげっ歯類モデルを形成するための操作が簡単で効果的な方法を確立し、尋常性ざ瘡を研究する研究者にモデルリファレンスを提供することを目的としています。

プロトコル

このプロトコールは、北京中医薬大学(No.2023033103-1183)から倫理承認を受けています。このプロトコルでは、12匹の雄のSprague-Dawleyラット(体重、208g±5g)を使用し、NC群(n = 3)、OA群(n = 3)、 C.acnes 群(n = 3)およびOA+ C.acnes 群(n = 3)の4つのグループに分けました。

1. ニキビモデルの開発

  1. モデリングの前に、電子ノギス( 材料の表を参照)を使用してラットの耳の厚さを測定し、記録します。
    1. 電子ノギスの外側の顎を耳の外縁の中点に置き、外耳道に伸ばします。線に沿って 2/3 ポイントの太さと 1/2 ポイントの太さを記録します。各ポイントを3回測定し、耳の厚さと見なされる2つのポイントの厚さの平均値を計算します。
  2. ラットの頭を片側に傾け、耳を上に向けて、50μLのオレイン酸( 材料の表を参照)を耳の腹側と背側に1日1回、25日間均等に塗布します。
  3. 21日目から25日目まで、オレイン酸を塗布する毎日前に、4%イソフルランを使用してラットに麻酔をかけ、次に50μLの1×107 CFU C.アクネス 懸濁液( 材料の表を参照)を、34Gまたは36Gの針を備えた1mLシリンジを使用して耳の腹面に皮内に注射します( 材料の表を参照)。.
    注:皮内注射の際は、耳の血管に血管が入らないように注意してください。34Gまたは36Gの針が付いたマイクロシリンジが必要です( 材料の表を参照)。適切な皮内注射を確実にするために、針は10〜15度の角度で、深さは約1mmで穴を開ける必要があります。
  4. 25日目に、ステップ1.1で説明したように、耳の厚さを測定して記録します。
    注:OA群は、ステップ1.2で説明したようにオレイン酸のみを塗抹し、21日目から25日目まで生理食塩水を注射しました。 C. acnes グループは、ステップ 1.3 で説明したように、 C. acnes 懸 ?? 液によって皮内注射されただけです。.OA+ アクネ菌 群を、ステップ1.2および1.3に記載したように、オレイン酸および アクネ菌 懸濁液で処理した。

2. 組織採取・解析

  1. 26日目に、ラットが制度的に承認された方法を使用して人道的に安楽死させられた後、8mmリングドリルで両側の耳に固定サイズをドリルします。
  2. 耳の組織を4%パラホルムアルデヒドに24時間浸し、続いてパラフィンを包埋し、厚さ5μmのスライスに切片化してヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色20を行う。光学顕微鏡で切片を観察し、病理学的変化を記録して、病理医によるフォローアップ評価を行います。 表 1 に従って病理学的変化にスコアを割り当てます ( 図 1 も参照)。
  3. 抗原賦活化のために切片を脱パラフィンし、再水和し、加熱します。内因性ペルオキシダーゼを不活性化するには、0.3% H2O2 とメタノール中で室温で 15 分間インキュベートします。
  4. 切片をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、3% BSAと室温で30分間インキュベートします。
  5. 切片をTNF-αモノクローナル抗体(希釈率1:800)( 材料表を参照)と4°Cで一晩インキュベートします。
  6. 切片を再びPBSで洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体( 材料表を参照)と50分間インキュベートします。
  7. 別のPBS洗浄後、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)混合物をスライドに塗布し、顕微鏡で染色プロセスをモニターし、所望の強度に達したらPBSとの反応を停止します。
  8. 切片をマイヤーのヘマトキシリンで1分間対比染色し、流水ですすぎ、切片を脱水してマウントします。切片を顕微鏡で観察し、病理学的変化を記録して、病理医によるフォローアップ評価を行います。

3. 統計分析

  1. 統計分析を実行します。
  2. データを平均±標準偏差として表示します。Shapro-Wilke検定を使用して、すべてのデータの正規性にアクセスします。正規分布に従う場合は、一元配置分散分析を使用して有意差を評価します。非正規分布データの場合は、Kruskal-Wallis 検定を適用し、その後に Dunn の多重比較を適用します。0.05未満の p値は、統計的に有意であると見なされます。

結果

厚さと肌の外観
7日目から21日目にかけて、OA群とOA+ アクネ菌 群の耳は、NC群と アクネス菌 群よりも有意に厚かった。25日目には、OA群、 C.acnes 群、OA+ C.acnes 群の耳はNC群よりも有意に厚かった(p < 0.05)。実験中の耳の平均厚さを 図2 と 表2に示します。

7日目から25日目にかけて、OA群とOA+ C.アクネス 群の耳は肥厚し、硬直し、紅斑、鱗屑、面皰を伴った。ネズミは時々耳を引っ掻いており、出血を引き起こしていることが観察されました。25日目には、 C. acnes 群とOA + C. acnes 群の耳に丘疹が見つかりました(図3)。

病理組織学
OA群およびOA+ アクネス 菌群では、顆粒層および棘層の肥大、および耳の毛包インファンディブルの拡張とともに、毛包に不全角化症および角質増殖症が認められた。 C. acnes およびOA + C. acnes グループの真皮は、リンパ球および好中球を含む混合炎症細胞浸潤を示した。また、真皮は 、C.acnes およびOA+ C.acnes において赤血球の血管外漏出および膿瘍の顕著な存在を示した(図4)。 図5に示すように、病理学的スコアリングでは、NC群と比較して C.acnes 群とOA群が増加し、NC群とOA群よりもOA+ C.acnes 群の方がスコアが有意に高かった(p < 0.05)。

IHCの
図6に示すように、TNF-αはアクネ菌群およびOA+アクネ菌群の真皮に高発現していました。

figure-results-1
図1:病理スコアのサンプル画像。炎症細胞は赤い矢印でマークされています。 スコアリングの割り当てについては、 表 1 を参照してください。(A)スコア= 0、インファンディブルムにホーンはありません。(B) スコア = 1、上皮過形成、および卵胞管を膨張させる角の密集した一貫した蓄積、ただし重度ではない。(C)スコア= 1、卵胞の周りの少数の炎症細胞;(D)スコア= 2、真皮の炎症細胞の広範な浸潤;(E)スコア= 3、尿細眼を拡張して皮脂管にまで及ぶ密集した角の蓄積、臨床例の面皰に似ています。(F) 丘疹または膿疱を引き起こす可能性のある漏斗周囲の膿瘍の存在。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:0日目から25日目までの耳の厚さの変化傾向。 NC群は赤線、OA群は青線、 C.acnes 群は緑線、OA群と C.acnes 群は黄色線で示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:耳の全体的な外観。 面皰と丘疹は赤い矢印で示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:ラットの耳の組織学( ▲)角質増殖症;(・)不全角化症;(•)毛包の拡張したインファンディブルム;(♦)炎症細胞の浸潤。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図5:病理学的スコア @は、NC群と C. acnes 群との間に統計的に有意な差があることを示しています。#は、NCグループとOA + C.アクネス グループとの間に有意な違いがあることを示しています。*はOA+ C.アクネス 群とOA群との間に有意差を示す(p < 0.05)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図6:ラットの耳におけるTNF-α発現のIHC画像( ♦)炎症細胞の浸潤。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

スコア特性
0ノンコメドジェニック。(図 1 A を参照)
1上皮過形成と角の密集した一貫した蓄積が卵胞管を広げ始めます。(図 1 B を参照)
1特に卵胞または皮脂管の周囲に、少数の炎症細胞が存在する。(図 1 C を参照)
2多数の炎症細胞の広範な浸潤。(図 1 D を参照)
3濾胞上皮の顕著な過形成とともに、インファンディブルムを膨張させ、皮脂管にまで及ぶ密な角の蓄積の存在。(図 1 E を参照)
3膿瘍の存在。(図 1 F を参照)

表1:病理学的スコアの割り当て。 サンプル イメージを 図 1 に示します。

時間NCグループ(mm)OAグループ(mm)C.アクネス グループ(mm)OA + C.アクネス グループ(mm)
0日目0.4000±0.02500.4167±0.01440.4500±0.00000.4667±0.0382
7日目0.5250±0.06610.7667±0.0878*▲0.4500±0.00000.7917±0.0764*▲
14日目0.5083±0.02890.8167±0.1233*▲0.6083±0.03820.9333±0.0804*▲
21日目0.5250±0.04331.0667±0.2241*▲0.5583±0.01440.9417±0.0722*▲
25日目0.5750±0.05000.8250±0.1392*0.9500±0.1639*1.0583±0.0804*

表2:耳の厚さ。 データは平均±標準偏差として表示されます。記号 "*" は、NC グループと比較して統計的に有意な差を示します。記号「▲」は 、アクネス菌 群と比較して統計学的に有意な差を示しています(p < 0.05)。

ディスカッション

にきびモデルの方法論と評価基準が明確ではなかったため、このプロトコルはにきびを研究する研究者に参照を提供することを目的としていました。マウスの耳のサイズが小さいことと、背中の毛の成長、脱毛クリームとシェーバーの使用によって引き起こされる干渉のために、ラットの耳はにきびのげっ歯類モデルを確立するためのより良い代替手段かもしれません。私たちは、ラットの背中の皮膚にニキビモデルを作成しようと試みましたが、効果はラットの耳で観察されたものほど良くありませんでした。

一部の研究者は、オイルを塗布したり微生物を注入したりするなど、にきびの炎症を引き起こすための単一の方法論のみを採用しています14,16。しかし、研究によると、皮脂分泌の増加は詰まった卵胞でのC.acnesの過剰な増殖を促進し、C.acnesは皮脂腺の異常な分泌を刺激します。両方の相互作用はにきびの炎症を悪化させる可能性があります。したがって、油およびアクネ菌によって誘発される化合物モデルは、ニキビ10,21,22の臨床病変とより一致している可能性があります。異なる実験群間の病理学的変化を客観的に評価するために、ケラチンの蓄積とそれに伴う毛包管の肥大と上皮増殖、真皮への炎症細胞の浸潤、さらには膿瘍のさらなる進行を含む先行研究に触発されたスコアリングシステムを考案しました(表1および図1)16、23.このスコアリング法と病理組織学的および免疫組織化学的(IHC)分析を併用したところ、アクネ菌とオレイン酸を耳に塗布すると、より顕著な皮膚障害と炎症を引き起こすことがわかりました。これらの知見は、ヒトのにきびの中等度の症例で観察される症状を反映しており、にきびの発症を模倣するこの複合モデルの価値を強調している(図4および図5)24。

モデルをより適切に評価するには、オイルと C.アクネスを塗布する前に耳の厚さを記録する必要があります。耳の外側の厚さと内側の厚さが異なることを考慮して、耳の厚さをより適切に表す結果が得られるように、2つの特定のポイントを記録し、2人のオペレーターが協力して耳を測定しました。オレイン酸を耳に塗るときは、オレイン酸の流動性がオレイン酸を外耳道に流入させやすく、ラットを刺激するという事実に注意を払う必要があります。したがって、ネズミの頭を傾けて、オレイン酸が外耳道に入るのを防ぐ必要があります。

面皰は7日目に観察され、病変は実験の終わりまで悪化し続けました。アクネ菌による刺激は、ニキビに影響を与えるもう一つの重要な要素です。アクネ菌は、皮脂腺での脂質合成を促進するだけでなく、毛包や真皮の皮脂腺周辺の炎症細胞と反応して炎症因子を誘導します。これは炎症反応をさらに悪化させます6,25。そのため、C. acnesの皮内注射を使用して炎症を加速します。ラットの耳は非常に細いことを考えると、ネズミを突き刺さないようにするためにマイクロニードルが必要です。適切な皮内注射を確実にするために、針は10〜15度の角度で、深さは約1mmで穴を開ける必要があります。また、1人のオペレーターが皮内注射を行う場合、別のオペレーターがネズミの頭部を固定して耳にピアスを開けないようにする必要があります。出血を防ぐために、注射部位はラットの表在血管を避けなければなりません。アクネ菌を注射した後、耳は著しく荒れ、赤くなり、腫れが増し、丘疹が見られました(図3)。

皮脂/皮脂成分とアクネ菌の用途は、実験によって異なります。一部の研究者は、C. acnesを一度注射し、その後皮脂を7日間塗布する方法を採用したため、ラットの背中に膿瘍、紅斑、硬結が誘発された19。他の研究者の中には、C. acnesをラットの耳に4日間注射し、30日間皮脂を塗った人もいます18。にきびの炎症は、皮脂/皮脂成分の適用、C.acnesの活性と濃度、およびモデルの組織に関連しているため、統一された基準はありません。この実験では、オレイン酸が毛包の角質化を誘発し、表皮の炎症を刺激するだけでなく、アクネス菌の増殖を促進することを考慮して、人工皮脂の代わりにオレイン酸を使用して皮脂をシミュレートしました6,7,8。実験では、オレイン酸の施用から7日後に、ラットの耳に赤みと腫れが見られました。7日目から14日目にかけて、ネズミの耳は鱗と面皰を示し始めました。15日目から21日目にかけて、面皰は増加しましたが、それ以上のにきび症状は観察されませんでした。21日目に、1 ×10 7 CFU Cの皮内注射を開始しました。にきび、以前の研究で文書化された広く使用されているアプローチ19。

最初は効果が明らかではなかったのですが、その後、 Cを注射したラットの耳に丘疹が見つかりました。 にきび。穂の厚さがグループ間で経時的に有意な変動を示さなかったことを考慮して、25日目に実験を終了することにしました(図2 および 表2)。このプロトコルにはまだいくつかの制限があります。耳の領域が小さいため、フォローアップの薬物治療に影響を与える可能性があります。にきびの病理学的過程に関与する微生物叢は C.アクネス だけではないため、ニキビを誘発するためにさまざまな細菌を使用して臨床状態を模倣する方が良いかもしれません26。

開示事項

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、中国国立自然科学基金会(No.81974572、No.82274523)および北京中医薬大学(No.202310026002)の支援を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アナロインジケーター 三菱、日本C-22
AnaeroPack三菱、日本C-11、C-41
コロンビア血液寒天プレートBeNa Cuture Collection、中国BNCC330605
恒温インキュベーター上城、中国303-0
綿棒HYNAUT、中国_
Cutibacterium acnesBeNa Cuture Collection、中国BNCC330605
Dako REAL EnVision Detection System、Peroxidase/DAB+、Rabbit/MouseDAKO、デンマークK5007
使い捨て滅菌注射針Zhejiang Oujian Medical Apparatus、China_
Electronic scaleJINXUAN、中国A017
電子ノギス、Deli、中国DL90150
オレイン酸(分析試薬、AR)Fangzheng、China_
塩化ナトリウム注射ダブルクレーン、中国Y2212241
SPSS StatisticsIBM、米国26.0
皮下注射器山東weigaoグループ医療用ポリマー、China_
TNFアルファモノクローナル抗体プロテインテックグループ、int、アメリカ60291-1-LG
CR滅菌

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