コロラドジャガイモ甲虫の自然環境下での冬眠に関する実験的研究

コロラド州のジャガイモのカブトムシLeptinotarsa decemlineata Say(CPB)は、ナス科植物、主にジャガイモSolanum tuberosum Lの重要な害虫です。この種の地理的範囲は1600万^km2以上であり、常に拡大しています¹。CPBは通性冬季休眠があり、温帯では冬眠が義務付けられています。休眠は短日日長によって誘発され、温度¹によって調節される。成虫期には土に穴を掘って越冬します。緯度が上がるにつれて、冬眠期間が長くなります。温帯、特にその範囲の北方領土では、越冬は8月から9月までの5月から6月までの9か月間続きます(Noskovら、個人的な観察)。この期間中、CPBは、温帯の他の昆虫と同様に、不利な冬の条件にさらされ、耐寒性を高める必要があります。同時に、カブトムシが土壌と接触すると、さまざまな日和見微生物や病原性微生物による感染のリスク^{が高まります2}。そのため、これらのカブトムシは冬眠中に一定レベルの免疫系活動を維持する必要があり、これもエネルギー的にコストがかかります。それにもかかわらず、昆虫が感染を生き延びたとしても、病気はその耐寒性を低下させる^{可能性があります3。}低温がCPBの冬の死亡率の唯一の理由ではないことに注意する必要があります。酸素の欠乏も重要な役割を果たしており、条件によっては、冬の死亡率の主な要因となる可能性があります^4,5。

CPBの冬季の自然死亡率は非常に高く、粘土質ローム土壌では100%に達することが知られています⁶。したがって、越冬はCPBライフサイクルにおいて最も重要な時期の1つです。それにもかかわらず、自然条件下でのCPB冬眠の生理機能、免疫系活性、生存率、およびその他のパラメータに関するデータはまだ限られています。休眠中およびコールドショックに応答するCPB成人の遺伝子発現の違いとさまざまな生理学的パラメーターに関する研究があります7,8,9,10,11,12;しかし、これらの分析は、主に、温度、湿度、および固有の病原体負荷の自然な変動のない実験室条件下での休眠または寒冷ストレスの誘発によって行われてきました。しかし、自然条件下で土壌から発掘して採取したこれらの甲虫の生理学に関する研究は重要です。1970年代から1980年代にかけて、自然条件下でのCPB越冬のさまざまな側面が活発に研究されました^{13,14,15,16,17,18}。一方、これらの研究は、冬季の土壌からのCPB掘削を含みませんでした。また、CPBの冬眠を制御するための技術やケージの説明については、詳細には説明されていません。したがって、自然環境で越冬するCPBの生理機能の調査が必要である¹⁹。

この研究の目的は、自然条件下でCPB成虫の冬眠を制御する方法を開発し、テストすることでした。提案手法は、大陸性気候の野外条件下での冬眠中に、微生物学的、免疫学的、およびその他のアッセイのために所望の数のCPB個体を得ることを可能にします。この方法は、雪の下の土壌で越冬する他の昆虫種にも適用できます。

1.冬眠用ケージの説明

注:実験の目的に応じて、ケージの数は異なります。サンプリング日ごとに少なくとも3つのケージを使用してください。羽化するカブトムシの数を見積もるには、春まで土から取り出さない少なくとも3つの追加のケージを準備します。

1. ケージは、25×25×40cm(L × W × H)のサイズの硬い木製フレームで作られたものを使用してください。
2. ケージのフレームを作るには、厚さ2cm以上、幅4cm以上の木製スラットを使用します。
3. ケージの内側を、5 mm×3 mm以下の開口部のサイズのステンレス鋼メッシュで覆います。木のホッチキスを使用してメッシュを固定します。
4. ステンレスメッシュをホッチキスで底の外側に固定します。
5. ケージの内側を密度60 g / m²の黒い合成ジオテキスタイルで裏打ちします。
   注:ジオテキスタイルは、カブトムシの脱出を防ぐための追加のバリアとして機能します。活発に動く昆虫病原体や寄生虫に関連する実験には使用しないでください。
6. 高さ約60cmの合成半透明の通気性生地のチューブをケージの上部にしっかりと取り付けます。
7. ケージの底に2本の強力なロープを交差させて固定し、必要に応じて土から引き出します。

2.ケージの設置

1. 土に40cmの深さの穴を掘り、中にケージを置きます。
2. 穴に枯れ草や干し草を置きます。
3. 干し草や枯れ草がケージの壁と土の間に来るようにケージを内側に置きます。
4. 昆虫が集められたのと同じジャガイモ畑の土でケージを満たします。
5. 防水温度および湿度データロガーをケージ内の必要な深さに設置します。
   注意: どのメーカーのデータロガーでも使用でき、低温で動作できる必要があります。
6. 甲虫の導入の3〜4週間前に各ケージ内にジャガイモの苗を植え、適度に水をやります。
7. 合成繊維のチューブをケージの外側に取り付けられた素材の棒に垂直に固定します。

3. 越冬前の昆虫の飼育

1. ジャガイモの植生の終わりに向かって無農薬のジャガイモ畑で成虫のカブトムシを手作業で集めます。
   注:成虫のカブトムシは幼虫とは大きく異なり、縞模様の鞘翅が特徴ですが、幼虫は赤です。
2. 集めたカブトムシを、昆虫に餌を与えるためのジャガイモのてっぺんが入った15〜20Lのプラスチックバケツ(バケツあたり最大200個)に入れてからケージに入れます。
3. 通気性のある布でバケツを覆います。
   注意: 昆虫をバケツに12時間以上保管しないでください。バケツの底にカブトムシが蓄積するのを防ぐために、十分な大きさのジャガイモの上部を使用してください。
4. 合成繊維メッシュで覆われたジャガイモの植物に200個以下のCPB個体を配置します。
5. ポテトトップスが消費されたら、水の入ったプラスチックの瓶にセットされた新しいものを追加し、その後毎日ポテトトップを交換します。
   注意: 瓶に茎を固定するには、脱脂綿とパラフィルムを使用します。古い茎を取り除くときは、カブトムシがないか注意深くチェックしてください。
6. すべてのカブトムシが越冬のために土に穴を掘ったら、棒から合成繊維のチューブをほどき、布を置きます。

4.冬季の昆虫採集

1. ケージの表面の上の雪を取り除きます。
2. 強力なシャベルで両側のケージを緩めます。
3. ロープを使ってケージを土から引き出します。
4. ケージをラボに持参します。
   注:実験の目的によっては、冬眠中のカブトムシを分析前に不活性にする必要がある場合があります。この場合、カブトムシを土壌から分離する際の実験室の温度は、2~5°Cでなければなりません。
5. 箱から土を少しずつ取り出し、大きな土を慎重に砕き、ピンセットでカブトムシを隔離します。
6. 生きたカブトムシを死体から分離します。生きている健康なカブトムシは、周囲にコンパクトな土壌を作り、空気空洞(いわゆるクレードル)を形成するため、土壌から簡単に分離できます。真菌によって殺されたカブトムシは、ミイラ化しているか、表面に菌糸体が見えます。バクテリアで分解する昆虫は暗いです。
7. ふるいを通して土をふるいにかけ、すべてのカブトムシが孤立し、損傷していないことを確認します。
8. 真菌感染または細菌分解の症状のある死体は、将来の識別のために、個々の滅菌15 mL遠心チューブに入れます。
9. 生きたカブトムシは、湿らせた綿球が入った密閉された換気容器で分析するまで、0〜2°Cの温度で冷蔵庫に保管してください。

5. 臓器・組織サンプルの調製

1. 血リンパ液を採取するには、インスリン針を使用して鞘翅の下の腹部の外側部分に穿刺します。
   注:越冬中は血リンパ液の量が大幅に減少し、この液体を採取することが困難になります。
2. 腸を分離するには、ヘッドカプセルを切り取り、すべての内容物をリン酸緩衝液を含むペトリ皿に絞り出し、腸を分離し、脂肪とマルピーギ血管を浄化します。
3. 前腸、中腸、後腸など、腸の目的の部分を分離します。
4. 脂肪体を分離するには、腸を分離した後、他の組織から分離します。
   注:単離された組織は、抗酸化酵素や解毒酵素の活性の測定(例:補足 図1)、免疫シグナル伝達経路遺伝子の調節の解析(例: 補足図2)、昆虫の腸内容物のメタバーコーディングなどに使用できます。

6.死体からの微生物の分離

1. 昆虫病原性真菌を死体から分離するには、ミイラ化した昆虫を滅菌湿度チャンバーに入れます。
2. カブトムシの内部内容物からの空中分生子(利用可能な場合)または菌核を使用して、0.4%乳酸を含むSabouraudデキストロース寒天にめっきします。
   注意: 菌糸体と分生子を備えたカブトムシは、すぐにメッキに使用してください(湿度チャンバーに入れないでください)。
3. 細菌分解の症状がある死体から細菌を分離します。
4. カブトムシの頭を切り落とし、内部の内容物を絞り出し、チューブに集めて、バクテリアの培地(ルリア・ベルタニ寒天培地、エンド寒天培地、胆汁エスクリン寒天培地)にめっきします。
   注:顕微鏡と分子学的方法を使用して、病原体の属と種を特定します。必要に応じて、他の寄生虫の存在についての分析を行うことができます。

以下の越冬CPBの結果は、土壌温度、生存率、感染性を示しています。

土壌温度のダイナミクス。
11月下旬から4月上旬にかけて、水深30cmのケージ内の氷点下の気温を記録しました(図1)。この期間の平均気温はマイナス3.3°C±0.1°C(標準誤差±平均)でした。最低気温は2月中旬のマイナス7.9°Cでした。

越冬CPBの生存。
昆虫の死亡率は冬眠中に見られ、羽化前の春に最大に達しました。当初のカブトムシ数は2000頭で、5月末までに1470頭が生き残った。冬眠中のカブトムシの生存率は61%でした(図2)。

越冬CPBの感染。
530匹のカブトムシの死骸を分析したところ、冬眠期間中、53%に細菌分解の症状があり、25%に真菌感染症の症状がありました(図3)。 Beauveria は、昆虫病原性真菌の孤立した培養物の中で優勢(45の分離株)でした。 Metarhizium、冬虫夏草 (=Isaria)、 およびLecanicillium ははるかに一般的ではありませんでした(それぞれ2つの分離株)。細菌分解の症状を呈した死体から分離された細菌(n=30)のうち、バチルス属、ス フィンゴバクテリウム属、ペリバチルス属、シュードモナス属、セラチア属、ラネ ラ属および グルタミシバクター 属に属する種が同定された(付表1)。

図1:地温の動態 水深30cmに設置された防水温度データロガーで測定した地温動。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:冬眠期間の違いによる越冬中のコロラドジャガイモ甲虫の生存率。 ケージを掘り出し、11月、1月、4月、5月に生き残ったカブトムシと死んだカブトムシを数えました。ひげは標準誤差を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:越冬中のコロラドジャガイモ甲虫の死体における感染。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足資料:以下の補足ファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 

補足図1.冬眠中のCPBの中腸における非特異的エステラーゼの活性。 ひげは標準誤差を示します。異なる文字は、時点間の有意差を示します(Dunnの検定、P < 0.05)。

補足図2:冬眠中のCPBの腸および脂肪体における転写因子NFκB(IMD経路)の発現の変化。データは、8 月の時点に対する倍数の変化として表示されます。Rp4、Rp18、およびArf19を参照遺伝子として使用しました。 ひげは標準誤差を示します。

補足表1:冬眠中に死んだCPBから分離された細菌の16S rRNA(~800 bp)遺伝子配列の推定同定。

著者らは、競合する利害関係はないと宣言しています。