がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

サマリー

このプロトコルは、ハイスループットの基礎およびトランスレーショナルヒトがん研究を実行し、薬物スクリーニング、疾患モデリング、および個別化医療アプローチを進歩させるための生理学的に関連性のある腫瘍オンチップモデルを提示し、ローディング、メンテナンス、および評価手順を説明します。

要約

固形がんの腫瘍微小環境を in vitro で再現する検証済みのがんモデルの欠如は、前臨床がん研究および治療法開発の大きなボトルネックのままです。この問題を解決するために、私たちは、複雑なヒトの腫瘍微小環境を現実的にモデル化する微小生理学的システムである血管新生微小腫瘍(VMT)、または腫瘍チップを開発しました。VMTは、動的で生理学的フロー条件下で複数のヒト細胞タイプを共培養することにより、マイクロ流体プラットフォーム内で de novo を形成します。この組織工学的微小腫瘍コンストラクトは、生体内で新たに形成された血管と同様に、成長する腫瘍量をサポートする生きた灌流血管ネットワークを組み 込んでいます。重要なことは、薬物や免疫細胞が腫瘍に到達するには内皮層を通過する必要があり、治療の送達と有効性に対する in vivo の生理学的障壁をモデル化することです。VMTプラットフォームは光学的に透過性であるため、組織内の蛍光標識細胞を直接可視化することで、免疫細胞の血管外漏出や転移などの動的プロセスの高解像度イメージングを実現できます。さらに、VMTは、 in vivo 腫瘍の不均一性、遺伝子発現シグネチャー、および薬物応答を保持します。ほぼすべての腫瘍タイプをプラットフォームに適応させることができ、新鮮な手術組織からの初代細胞が増殖し、VMTでの薬物治療に反応し、真に個別化された医療への道を開きます。ここでは、VMTを確立し、腫瘍学研究に活用するための方法について概説します。この革新的なアプローチは、腫瘍と薬物反応の研究に新たな可能性を開き、研究者にがん研究を前進させるための強力なツールを提供します。

概要

がんは依然として世界的に大きな健康上の懸念事項であり、米国では死因の第2位となっています。国立保健統計センターは、2023年だけでも、米国で190万人以上の新規がん患者と60万人以上のがん死亡者が発生すると予想し^ており1、効果的な治療アプローチの緊急の必要性が浮き彫りになっています。しかし、現在、臨床試験に入った抗がん剤のうち、最終的にFDAの承認を得るのはわずか5.1%です。有望な候補が臨床試験を成功裏に進められないのは、前臨床^{医薬品開発中に}2D培養やスフェロイド培養などの非生理学的モデルシステムを使用することに部分的に起因している可能性があります2。これらの古典的ながんモデルには、治療抵抗性や疾患進行の重要な決定要因である間質ニッチ、関連する免疫細胞、灌流血管系など、腫瘍微小環境の本質的な構成要素が欠けています。したがって、前臨床所見の臨床的翻訳を改善するためには、ヒト のin vivo 腫瘍微小環境をよりよく模倣する新しいモデルシステムが必要です。

組織工学の分野は急速に進歩しており、実験室でヒトの疾患を研究するためのより良い方法を提供しています。重要な進展の1つは、臓器チップまたは組織チップとしても知られる微小生理学的システム(MPS)の出現であり、これは、健康な状態または病気の状態を再現できる機能的で小型化された人間の臓器です^3,4,5。これに関連して、3次元マイクロ流体ベースのin vitroヒト腫瘍モデルである腫瘍チップが、腫瘍学研究用に開発されました2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 .これらの高度なモデルは、動的な腫瘍微小環境内に生化学的および生物物理学的な手がかりを組み込んでおり、研究者はより生理学的に適切な状況で腫瘍の挙動と治療への反応を研究することができます。しかし、これらの進歩にもかかわらず、生きた機能的な血管系、特に生理学的流れに応答して自己パターン化する血管系をうまく組み込んだグループはほとんどありません^3,4,5,6。機能的な血管ネットワークを含めることは、薬物や細胞の送達、異なる微小環境への細胞のホーミング、腫瘍細胞、間質細胞、免疫細胞の経内皮的移動に影響を与える物理的障壁のモデル化を可能にするため、非常に重要です。この特徴を含むことにより、腫瘍チップは、in vivo腫瘍微小環境で観察される複雑さをよりよく表現することができる。

このアンメットニーズに応えるため、マイクロ流体デバイス内で微小血管ネットワークを形成できる新しい薬物スクリーニングプラットフォームを開発しました8,9,10,11,12,13,14,15,16。血管新生マイクロオルガン(VMO)と呼ばれるこのベース臓器チッププラットフォームは、ほぼすべての臓器システムに適合させて、疾患モデリング、薬物スクリーニング、個別化医療アプリケーションのために元の組織生理学を再現することができます。VMOは、内皮コロニー形成細胞由来内皮細胞(ECFC-EC)、HUVEC、IPSC-EC(以下EC)と、マトリックスをリモデリングする正常ヒト肺線維芽細胞(NHLF)や血管を包み込んで安定化させる周皮細胞など、チャンバー内の複数の間質細胞を共培養することによって成立します。VMOは、腫瘍細胞と関連する間質を共培養して血管新生微小腫瘍(VMT)8,9,10,11,12,13、または腫瘍チップモデルを作成することにより、がんモデルシステムとして確立することもできます。ダイナミックフロー環境における複数の細胞タイプの共培養を通じて、灌流微小血管ネットワークはデバイスの組織チャンバー内にde novoを形成し、そこで血管新生は間質流量によって密接に調節される^14,15。培地は、in vivoの毛細血管に見られるものと同様に、1.2 x ^10-7 cm / sの透過係数で、微小血管を介してのみ組織チャンバーの周囲の細胞に栄養素を供給する静水圧ヘッドによってデバイスのマイクロ流体チャネルを介して駆動^{されます8。}

自己組織化微小血管のVMTモデルへの組み込みは、次の理由から重要なブレークスルーを表しています:1)in vivoでの血管新生腫瘍塊の構造と機能を模倣します。2)腫瘍と内皮および間質細胞の相互作用を含む転移の重要なステップをモデル化できます。3)栄養素と薬物送達のための生理学的に選択的な障壁を確立し、医薬品スクリーニングを改善します。4)抗血管新生および抗転移能力を有する薬物の直接評価を可能にする。VMO/VMTプラットフォームは、複雑な3D微小環境において栄養素、薬物、免疫細胞のin vivo送達を再現することにより、薬物スクリーニングの実施や、がん、血管、臓器特異的な生物学の研究に使用できる生理学的に関連性の高いモデルです。重要なことに、VMTは、結腸がん、黒色腫、乳がん、膠芽腫、肺がん、腹膜がん、卵巣がん、膵臓がんなど、さまざまな種類の腫瘍の成長をサポートします8,9,10,11,12,13。マイクロ流体プラットフォームは、低コストで、簡単に確立でき、ハイスループット実験用に配列できることに加えて、腫瘍間質相互作用のリアルタイム画像解析や、刺激や治療薬に対する反応に完全に光学的に対応しています。システム内の各細胞タイプは、異なる蛍光マーカーで標識されており、実験全体を通して細胞の挙動を直接可視化および追跡することができ、動的な腫瘍微小環境への窓を作成します。VMTは、標準的な培養モダリティよりもin vivoでの腫瘍増殖、構造、不均一性、遺伝子発現シグネチャー、および薬物応答をより忠実にモデル化することを以前に示しました¹⁰。重要なことに、VMTは、がん細胞を含む患者由来細胞の増殖と研究をサポートし、標準的なスフェロイド培養よりも親腫瘍の病理学をよりよくモデル化し、個別化医療の取り組みをさらに前進させます¹¹。この原稿では、VMTを確立するための方法を概説し、ヒトのがんを研究するためのVMTの有用性を紹介します。

プロトコル

1.設計と製造

1. デバイス設計
   1. マイクロ流体デバイスの製造では、Siウェーハ上にスピンコートされた200μmのSU-8層(RCA-1洗浄、2%フッ化水素(HF)処理)を使用してSU-8モールドを作成し、その後^{、前述のように}シングルマスクフォトリソグラフィステップを実行します^8,9。
   2. SU-8金型から厚さ4mmのポリジメチルシロキサン(PDMS)レプリカを鋳造し、下流の製造ステップ用の耐久性のあるポリウレタン金型を生成します。^{8、9、10、11、12、13、14、15}のさまざまな設計反復を使用できます。
   3. 現在のイテレーションでは、マイクロ流体デバイスを標準の96ウェルプレートフォーマットにカスタムフィットし、底面に薄い(1/16インチ)透明ポリマー膜層で囲まれた12個のマイクロ流体デバイスユニットを備えた厚さ2mmのPDMSフィーチャー層で構成されるように設計します(図1A)。
   4. 個々の組織ユニットが、ゲルローディング入口(L1)と出口(L2)、圧力調整器(PR)¹⁶、および両側の2つの培地の入口と出口(M1-M2、M3-M4; 図1B)。
   5. 各入口と出口を、媒体リザーバーとして機能する単一のウェル内に配置して、マイクロ流体チャネル全体の静水圧(10 mm H₂O)を確立します。外側のチャネルで血管ネットワークの吻合を可能にするには、幅50 μmの通信孔(上部に6つ、下部に6つ)を介してマイクロ流体チャネルを組織チャンバーに接続します。
      注:マイクロ流体抵抗器は、血管ネットワークが完全に形成されると管腔内になる組織チャンバー全体に5 mm H₂O間質圧勾配を作成します^8,10。その後の手順は、完全に組み立てられたハイスループットプレートから始まります。

図 1.マイクロ流体プラットフォーム設計。 (A)プラットフォームアセンブリの概略図は、底なしの96ウェルプレートに接着され、薄い透明ポリマー膜で封止された12個のデバイスユニットを備えたPDMSフィーチャー層を示しています。各デバイスユニットは、プレート上のウェルの列を占有します。赤で囲まれた単一デバイスユニットは、(B)に詳細とともに示されています。(b)1つのデバイスユニットの概略図は、96ウェルプレートの1つのウェル内に配置された単一の組織チャンバーと、細胞とマトリックスの混合物を導入するためにパンチされた入口および出口(L1〜L2)穴を備えた2つのローディングポートを示しています。培地の入口と出口(M1-M2、M3-M4)は穴あけされ、培地リザーバーとして機能するウェル内に配置されます。異なる量の媒体は、分離されたマイクロ流体チャネルを介して組織チャンバー全体に静水圧勾配を確立します。圧力調整器(PR)ユニットは、ゲル破裂バルブとして機能し、ローディングの容易さを高めます。デバイスの深さは200μmで、組織チャンバーは2mm x 6mmです。 この 図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

2. 荷役前の準備

1. 細胞培養
   1. 加湿した37°C、5%_CO2 インキュベーターでメーカーの推奨に従って細胞を維持します。
   2. 形質導入されたEC、NHLF、またはその他の線維芽細胞/間質細胞および目的のがん細胞のT75フラスコを、ロードの3〜4日前に、メーカーおよびユーザープロトコルによって通知された密度でプレートします。このプロトコルでは、各細胞タイプのフラスコあたり1 x 10⁶ 細胞をプレートします。EC を内皮増殖培地 2 (EGM2) 完全培地で培養し、NHLF を 10% FBS を含む Dulbecco Modified Eagle 培地 (DMEM) で培養し、がん細胞を細胞の種類に応じて適切な培地で培養します。
   3. 2〜3日ごとにそれぞれの培地を投入して細胞を維持し、蛍光顕微鏡で細胞を可視化することにより、形質導入または標識効率を再確認します。ロード当日は、EC が 80%-100% コンフルエントであるのに対し、NHLF は 70%-80% のサブコンフルエントであることを確認します。
2. フィブリノーゲンの調製
   1. フィブリノーゲンの凝固率を考慮して、フィブリノーゲン溶液を所望の濃度(通常、5〜8 mg / mLが堅牢な血管網形成をサポートします)に調製します。必要なフィブリノーゲンの量は、次の式で計算します。
      フィブリノーゲン (mg) = (容量 (mL)) x (濃度 (mg/mL))/(凝固%)
   2. チューブを静かにはじいて、37°Cに加温した適切な量の内皮基底培地2(EBM2)にフィブリノーゲンを溶解します(ボルテックスしないでください)。フィブリノーゲンを37°Cのウォーターバスでインキュベートし、完全に溶液に含めます。重要なのは、完全な培地を使用しないことです。
   3. 0.22 μmフィルターと所望の容量(通常、微量遠心チューブあたり400 μL)に分注する滅菌フィルターフィブリノーゲン溶液。
      注:他のマトリックスタンパク質(コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなど)をフィブリノーゲンミックスにスパイクすることができます。

3. サンプルのローディング

注:読み込みは時間に敏感であり、最適な結果を得るには、開始(セルリフティング)から終了(デバイスへのメディアの追加)まで約1.5〜1.75時間以内に完了する必要があります。各ステップには、ユーザーが順調に進めるのに役立つ推奨タイマーが記載されています。

1. 資材準備(搬入当日)
   1. 以下を37°Cのウォーターバスに10〜15分間入れます:細胞、細胞解離試薬、培地(EGM2、DMEMなど)を洗浄するためのハンク平衡塩溶液(HBSS)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)
   2. 試薬は、トロンビン、ラミニン(4°Cで一晩解凍)を4°Cの冷蔵庫で保管してください。
   3. フィブリノーゲンアリコートを室温で解凍します。1.5 μL のトロンビンアリコートを 500 μL の微量遠心チューブに調製し、デバイスユニットごとに 1 本のチューブを用意します。装填を容易にするために、トロンビンアリコートが各チューブの底にあることを確認してください。
   4. UV滅菌したハイスループットプレートをロード前に少なくとも30分間デシケーターに入れ、マイクロ流体に閉じ込められた空気を取り除きます。
2. セル調製(タイマー開始=0分から開始)
   1. 4倍の倍率で顕微鏡下で細胞をチェックし、コンフルエントと形質導入効率を確認します。
   2. 細胞の各T75フラスコを5 mLのHBSSで2回洗浄し、完全に吸引します。各フラスコに解離試薬1mLを加え、37°C、5%_CO2 で1〜2分間インキュベートします。
   3. 手のひらでプレートを軽くたたき、すべての細胞が持ち上げられたことを確認します。
   4. 9 mLの適切な培地でフラスコから細胞を洗い流し、15 mLのコニカルに集めます。細胞計数用の小さなアリコートをすぐに取り出します。
   5. 細胞を300 x g で4°Cで3〜5分間遠心分離します。 細胞を遠心分離しながら、細胞を数えます。EC または NHLF のコンフルエント T75 フラスコでは、少なくとも 2 x 10⁶ 個の細胞が得られます。
   6. 遠心分離後、培地を吸引し、1 x 10⁶ 細胞/mLの濃度で適切な培地にペレットを再懸濁します。細胞を氷上に保管します。
3. 細胞とフィブリノーゲンの混合物の調製(タイマー=20分で開始)
   1. ロードするデバイスの数を決定し、ピペッティングの損失を考慮して1〜2を加算し、デバイスごとに必要なセル/フィブリノーゲン混合物の量を掛けます。これはデバイスの構成によって異なりますが、この記事で紹介するデバイス設計では、デバイスあたり6μLが必要です。
   2. 各細胞タイプの濃度は実験的に決定する必要があります。開始点として、EC を約 7 x 10⁶ cells/mL の濃度でロードし、NHLF を 3.5 x 10⁶ cells/mL の濃度でロードします。がん細胞の濃度は、増殖速度によって大きく異なりますが、通常は0.5〜2 x 10⁶ 細胞/ mLの範囲にあります。次の式を使用して、必要なセルの数を計算します。
      必要な細胞数=(フィブリン量(μL))/1000μL×(細胞濃度)
   3. 細胞を1 x 10⁶ 細胞/mLの濃度で再懸濁し、以下の式を使用して必要な細胞の量を決定します。
      必要な細胞数(μL)=(必要な細胞数)/1000
   4. EC、NHLF、およびがん細胞(VMTのみ)をコニカルチューブでそれぞれ混合し、4°Cで300 x g で3〜5分間遠心分離します。
   5. 紡糸後、培地を慎重に吸引し、ペレットの近くに残っている培地をピペッティングで除去します。ペレットを計算された量のフィブリノーゲンに穏やかに、しかし完全に再懸濁し、気泡が入らないように細心の注意を払います。氷の上に置いてください。
   6. 滅菌したプレートとトロンビンアリコートを組織培養フードに入れます。
4. ローディングデバイス(タイマー=30〜35分で開始)
   1. P20ピペットを使用して、細胞/フィブリンミックス液から容量6 μLをピペットで採取します。細胞懸濁液が均一になるように、混合物を少なくとも5回上下にピペッティングしてください。凝固を遅らせるために、ミックスを氷の上に置いておいてください。
   2. ピペットの先端をチューブの底にあるトロンビンアリコートに直接入れて、細胞/フィブリンをトロンビンの1本のチューブに静かに混合します。気泡が入らないように注意しながら、すぐに少なくとも2回ピペットで上下させます。フィブリンはトロンビンと混合されると凝固し始めるため、迅速かつ意図的にステップ3.4.3を完了します。および 3.4.4.ピペットチップでフィブリンがゲル化する前(~3秒)。
   3. ハイスループットプレートを斜めに持ち上げ、ピペットチップをデバイスのローディングポート(L1またはL2)の1つにすばやく挿入します。回路図については 、図2A を参照してください。
   4. ピペットプランジャーを滑らかで流動的な動きで最初のストップまで押し下げて、細胞とフィブリンの混合物を組織チャンバーに注入します。ゲルがチャンバーを完全に通過するのを見てください。
      注:このステップで圧力をかけすぎると、組織チャンバーの上部および/または下部にあるマイクロ流体チャネルにゲルが破裂する可能性があります。
   5. ピペットチップを取り外したり、ピペットプランジャーを外したり、ピペットを乱したりすることなく、プレートを組織培養フードに静かに平らに戻します。ピペットチップを手でひねってP20から取り外し、ローディングポートの穴に入れたままにします。イジェクタボタンを使用してチップを取り外すと、圧力がかかりすぎるため、使用しないでください。
   6. 残りのデバイスについては、手順 3.4.1 から 3.4.5 に進みます。
   7. 装填が完了したら、プレートを組織培養フードに邪魔されずに2分間放置します。
   8. ピペットチップを軽くひねり、ローディングポートから引き抜いて取り外します。プレートの蓋を元に戻します。
   9. プレート全体を37°Cのインキュベーターで15〜20分間インキュベートし、ゲルが完全に重合します。
   10. インキュベーション後、各デバイスユニットを顕微鏡で確認してください。細胞が気泡なくチャンバー全体に均等に分布していること、および図2B-Cに示すように、組織チャンバーとマイクロ流体チャネルの間にはっきりと見えるゲル界面があることを確認します。
5. ラミニンによるチャネルコーティング(タイマー=45〜50分で開始)
   1. ゲルが完全に固まったら、ラミニンをマイクロ流体チャネルに導入して、血管吻合を促進します。
   2. P20を使用して、4 μLのラミニンをデバイスの各マイクロ流体チャネル(上部と下部)に導入します。ピペットチップをM1またはM3に挿入し、ラミニンが上部チャネル全体をコーティングすることを確認しながら、ラミニンをゆっくりと排出し、M2またはM4で繰り返して下部チャネル全体をコーティングします。
   3. 圧力調整器の反対側からラミニンをピペッティングして配向を決定し、十分な圧力で押し通します。ただし、ラミニンが片側から移動しにくい場合は、片側からチップを外し、反対側からラミニンを押し出します。ピペットの2番目のストップに行く(つまり、プランジャーを完全に押し下げる)には、ラミニンをチャネル全体に押し込むのに十分な圧力を生成する必要がある場合があります。
   4. チップをメディアの入口/出口からそっと取り外します。P20のイジェクトボタンは使用しないでください。
   5. 各デバイスについて手順3.5.1〜3.5.4を繰り返し、プレートを37°C、5%_CO2 で10分間インキュベートします。
6. 培地添加(タイマー=約1時間10分から開始)
   1. 275 μLのEGM2完全培地を、列AとBまたは列GとHのウェルの非結合培地リザーバーに加えます。これはハイサイドになり、向きは圧力調整器の反対側のウェルを大容量にして開始することによって決定される必要があります。メディアは重力によって高い側から押し出されます。
   2. P200ピペットを使用して、275 μLのEGM2を含むウェルの培地の入口/出口に75 μLの培地を導入します。チップをメディアインレットホールに挿入し、メディアがチャネルを通過して反対側に泡立つのを確認しながら、メディアをゆっくりと排出します。
   3. ピペットチップを取り外し、チップから残りの培地を培地リザーバーに押し込み、ハイサイドの総容量が350 μLになるようにします。
   4. 手順3.6.1〜3.6.3を各デバイスユニット、上部および下部チャネルに対して繰り返します。
   5. 50 μLの培地を添加して、上記の向きに応じて、下側、列AとB、またはGとHのウェルを完全に覆います。ウェルの底を覆う均一なメディアの層があることを確認します。リザーバー内の培地の体積を示す概略図については、 図2D を参照してください。
7. 気泡の除去(ポストローディング)
   注意: 気泡の除去は、各デバイスの適切な流れを確保するための重要なステップです。2日目までに、内皮細胞と線維芽細胞は流れに反応して伸び始めます(図2E)。
   1. すべての培地を添加したら、プレートを37°C、5%_CO2 インキュベーターで1〜2時間インキュベートしてから、チャネルまたは培地の入口/出口に気泡がないか確認します。
   2. 顕微鏡で培地チャネル内の気泡を可視化し、75 μLの培地をチャネルに再導入して気泡を押し出すことで排出します。
   3. 媒体の入口/出口の気泡を目視で可視化します。P200ピペットを使用して、プランジャーを押し下げ、チップを穴に挿入し、プランジャーを持ち上げて気泡を引き出し、負圧を加えて気泡を吸い上げることにより、媒体の入口と出口に閉じ込められた気泡を取り除きます。

図 2.デバイス負荷の概略図。 (A)P20ピペットを使用して、細胞/フィブリン混合物をローディングポートの1つを介して各デバイスユニットの組織チャンバーに導入します。(B)明視野顕微鏡写真は、EC、線維芽細胞、および癌細胞を装填してVMTを形成するマイクロ流体デバイスを示しています。スケールバー = 500 μm。 (C)Bのデバイスの蛍光顕微鏡写真で、赤色はEC、シアンは腫瘍、青色は線維芽細胞を示しています。(D)概略図は、静水圧ヘッドを生成するために、ハイサイドに350μL、ローサイドに50μLの媒体をリザーバーに添加する方法を示しています。(E)VMT培養の2日目には、線維芽細胞とECが血管網を形成するために伸び始めていることが示されています。スケールバー = 200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

4. デバイスのメンテナンスと実験アプリケーション

1. メンテナンスと薬物治療
   注:システム内の流量を維持するには、媒体の容量をローサイドからハイサイドに、またはその逆にピペッティングして、ハイサイドの総容量が350μLにとどまるようにして、静水圧を毎日再確立する必要があります。 流れの方向は、VMOまたはVMTの確立の2日目以降、毎日切り替わります。その他のメンテナンスと治療の詳細を以下に示します。
   1. 血管系が完全に確立されるまで、EGM2が完了した状態で1日おきに培地を交換します(5〜6日目)。古い培地を完全に吸引し、高圧ウェル(350 μL)と低圧ウェル(50 μL)を交換します。
      注:最適化された培地組成の実験的決定は、多くの場合、EGM2への特定の成分の50:50の混合または添加を含む、他の細胞タイプに対して実施できます。
   2. 血管網が形成され、組織が完全に発達したら(4〜7日目)、実験にデバイスを使用する前にデキストラン灌流検査を実施します(ステップ4.2.1)。組織室に十分な灌流があるデバイスのみを使用してください。
   3. 治療薬を用いた実験では、治療開始日に、各装置のすべての蛍光チャンネルで画像を撮影します。これはベースラインとして機能します。
   4. 培地を所望の濃度で希釈された薬物を含む新鮮な培地と交換することにより、所望の治療薬でデバイスを治療する。医薬品は、メーカーの推奨に従って適切なビヒクルで希釈されますが、培地中のDMSOは0.01%を超えないようにしてください。
   5. デバイスを所望の時間(通常は48時間、ただし薬物動態によって通知される)薬物に曝露します。
   6. 各デバイスの各チャンネルを所望の時間間隔で画像化し、治療反応を監視します。実験中は、ステップ4.1.1に示されているようにプレートを維持します。
   7. 実験終了後、プレートを漂白してバイオハザード容器に入れ、免疫蛍光染色のために4%PFAで固定するか(ステップ4.3)、生細胞またはRNAの単離のために回収します(ステップ4.4)。
2. 灌流アッセイ
   1. デキストランの灌流
      注:血管透過性/開存性は、さまざまな分子量(40 kD、70 kD、または150 kD)の蛍光標識デキストランで血管ネットワークを灌流することによって決定できます。FITC-またはローダミン-デキストランは、ECの蛍光標識に応じて使用できます。
      1. 灌流の前に、空のデバイスの流路またはチャンバー内に数μLのデキストランを添加することにより、FITCまたはローダミンチャネルの適切な曝露を決定します。顕微鏡ソフトウェアを使用してピクセル強度のヒストグラムを表示することにより、露光時間を飽和レベルのすぐ下に設定し、高輝度値が集中することなく、均一に分布したピクセルを特徴とするダイナミックレンジを確保します。
      2. 蛍光デキストランチャンネル内のすべてのデバイスの背景画像を含む、関心のあるチャンネル内のすべてのデバイスの顕微鏡写真を撮影し、背景に対してキャリブレーションします。上記で決定したのと同じ露光を使用し、組織チャンバーを画像フレームの中央に位置合わせして、定量化のための一貫した画像を確保します。
      3. 1x DPBS中に5 mg/mLの濃度でFITC-デキストランまたはローダミン-デキストランの主原料を調製します。このストックは4°Cに保つことができます。
      4. ワーキングストックを調製するには、5 mg/mL ストックを EGM2 で最終濃度 50 μg/mL に希釈します。
      5. リザーバー内の培地を、最大容量の半分(175 μLを1つのウェルおよび組織チャンバーの上部または下部チャネルの高い側)に希釈したデキストラン溶液と交換します。他のウェルの培地を交換して、非結合側のハイサイドでデキストランなしで175 μLの新鮮なEGM2が得られ、ローサイドのウェルでそれぞれ50 μLしか持たないようにします。
         注:デキストランは、高圧側を通って血管床に入り、低圧側から出ていく色素を視覚化できるように、マイクロ流体チャネルの片側(上部または下部)にのみ添加する必要があります。
      6. 顕微鏡下で、蛍光デキストランが血管網を流れるのを観察します。これは通常、染料を培地リザーバーに添加してから約2分以内に発生します。
      7. 蛍光デキストランチャネル(および必要に応じて他のチャネル)のイメージングを開始します。これは T = 0 の時点です。複数の時点 (通常は 10 分ごと) または 1 つのエンドポイント イメージで追加の画像を撮影します。
   2. 細胞の灌流
      注:がん免疫学研究用のリンパ球やマクロファージ、転移研究用のがん細胞など、研究デザインに応じてさまざまな種類の細胞を血管系に灌流できます。細胞は、経時的な追跡を容易にするために蛍光標識する必要があります。
      1. 細胞を灌流する少なくとも2時間前に、上記のようにすべてのデバイスでデキストラン灌流を実施します。このステップは、細胞を追加する前に血管の開存性を決定するために重要です。
      2. 灌流する細胞に適切なカメラ露出を決定します。少量の細胞サンプルを採取して顕微鏡で観察し、その蛍光マーカーの露光時間を設定します。露光時間は彩度レベルのすぐ下に設定します。
      3. 蛍光デキストランチャンネル内のすべてのデバイスの背景画像を含む、関心のあるチャンネル内のすべてのデバイスの顕微鏡写真を撮影し、背景に対してキャリブレーションします。手順4.2.2.1で決定したのと同じ露出を使用します。
      4. 灌流のために細胞を採取する前に、デキストランが組織チャンバーから完全に拡散したことを確認します。目的の細胞を収穫して数えます。
      5. 細胞を適切な密度でEGM2に再懸濁します。例えば、T細胞は通常、血液中の濃度を模倣するために約1 x 10⁶ 細胞/mLで添加されます。
         注:ECはメディアの組成に敏感ですが、他のほとんどのメディアとの混合を最大50%まで許容できます。事前にテストしてください。
      6. 各デバイスのハイサイドにある1つのウェルに175 μLの細胞懸濁液を添加し、もう1つのウェルに175 μLのEGM2 completeを加えます。下側では、両方のウェルに50 μLのEGM2完全培地を添加します。
      7. 顕微鏡下で、蛍光細胞が血管網を流れるのを観察します。これは通常、細胞を培地リザーバーに追加してから約2分以内に発生します。
      8. 細胞流動が確立されたら、蛍光細胞チャネル(および必要に応じて他のチャネル)のイメージングを開始します。これは T = 0 の時点です。研究デザインに応じて、複数の時点で追加の画像または単一のエンドポイント画像を撮影します。たとえば、10分ごとにイメージングすると、高解像度のタイムコースが得られ、6〜12時間ごとに周期的な細胞の動きを追跡します。
3. 免疫蛍光(IF)染色
   1. ウェルから培地を吸引します。200 μL の 4% PFA を各デバイスユニットのハイサイドの両ウェルに、50 μL をローサイドに添加します。PFA を室温で 15 分間、または 4°C で 30 分間チャンバー内を流動させます。
   2. インキュベーション中に、ウェルあたり500 μLの1x PBSを含む24ウェルプレートを調製します。各デバイスを染色するために必要なウェルの数を計算します。
   3. ウェルからPFAを完全に除去します。プレートを逆さまにして、メンブレンのプラスチックバッキングを慎重に取り外します。
      注:IF染色は、メンブレンとデバイスを取り外さずに その場 で行うこともできます。そのためには、VMO/VMTに試薬を灌流して染色ステップを行い、各インキュベーションステップの所要時間を約6倍に増やします。
   4. 非常に優しく慎重に、下部の膜層をデバイスのフィーチャー層から剥がし、両方の角をつかみ、ゆっくりと滑らかな動きで引き下げることにより、組織チャンバーを露出させます。ほとんどの組織は組織チャンバーに残るはずです。 図3Aを参照してください。
   5. 図3Bに示すように、かみそりの刃またはメスを使用して、特徴層を完全に切り裂くのに十分な力を加え、個々のデバイスユニットの周囲に小さな長方形を切り取ります。
   6. フィーチャーレイヤーとウェルプレートの間にスパチュラをくさびで留めます。特徴層の下に穏やかな圧力をかけて、組織チャンバーを含む特徴層全体をウェルプレートから慎重に取り除きます。
   7. 組織を下向きに含む各長方形のPDMS特徴層片を、PBSを含む単一のウェルに配置します。
   8. すべてのユニットがウェルに入ったら、プレートを穏やかなロッカーに5分間置き、ウェルからPBSを吸引し、500 μLの新鮮なPBSと交換してPBSで洗浄します。合計3回の洗浄を繰り返します。
   9. 各ウェルからPBSを吸引し、500 μLの0.5% Triton-X含有PBSで組織を透過処理し、穏やかなロッカーでそれぞれ2回、10分間混合します。透過処理液を除去します。
   10. デバイスあたり 0.1% Triton-X 中の 10% 血清 500 μL を室温で 1 時間、穏やかに揺動させながらブロッキングします。
   11. 一次抗体を 3% 血清中の 0.1% Triton-X で目的の濃度および容量に希釈します。ブロッキング溶液を除去し、各ウェルの底部を完全に覆い、デバイス組織(~200 μL)が自由に動けるように十分な量の一次抗体溶液を添加します。プレートを透明なフィルムで覆います。
   12. プレートを4°Cで一晩揺動しながらインキュベートします。 翌日、デバイスティッシュの入ったプレートを室温に戻します(~15分)。
   13. 各ウェルおよび洗浄チャンバーから一次抗体溶液を500 μLのPBSで、穏やかなロッカーでそれぞれ5分間3回吸引します。
   14. 200 μLの二次抗体を0.1% Triton-X中の3%血清中に所望の濃度で添加します。暗所で室温で1時間穏やかに揺らしながらプレートをインキュベートします。
   15. 二次抗体溶液を吸引し、PBSで3回、それぞれ5分間、穏やかに揺動しながら洗浄します。1x DAPIを0.1% Triton-Xに溶液中10分間添加し、暗闇で揺らします。
   16. ピンセットを使用して、染色されたティッシュを含む長方形のデバイスの切り欠きをプレートから取り除き、ティッシュ側を上にしてペーパータオルの上に置きます。
   17. 数μL(~10μL)の褪色防止液を各チャンバーとカバーガラスに直接ピペットで移し、気泡が発生しないように注意します。褪色防止剤を室温で暗所で一晩硬化させてから、イメージングに進みます。
4. 分子アッセイのための組織および細胞の単離
   注:各ハイスループットプレートには、収穫の時点に応じて、約1〜2 x 10⁵ セルが含まれます。実験の繰り返し回数をスケーリングして、細胞全体と回収中の潜在的な損失を考慮します。
   1. シングルセル解析
      1. 各ウェルから培地を吸引し、デバイス層が上を向くようにハイスループットプレートを反転させます。
      2. メンブレンのプラスチックバッキングをはがします。PDMSの底部メンブレンをデバイスのフィーチャー層から非常に優しく慎重に剥がし、両角をつかみ、ゆっくりと滑らかな動きで引き下げることにより、組織チャンバーを露出させます。
      3. メンブレンは、適切に接着しても取り外すことができます。ほとんどの組織は、膜を除去した後も組織チャンバーに残るはずです。ただし、メンブレンに付着している部分がある場合は、メンブレン自体で以下の手順に従ってください。
      4. 各デバイスユニットを500μLのHBSSまたはPBSで洗浄します。各デバイスユニットに100 μLの解離試薬を加え、デバイスの上に液滴として置きます。プレートを37°Cのインキュベーターに戻し、5分間加熱します。
      5. 消化後、P200ピペットを使用して組織チャンバーを上下にピペッティングし、解離試薬に組織を回収します。ピペットの先端を各デバイス間で前後に動かして組織を完全に除去し、500 μL の EGM2 を含む 15 mL のコニカルに集めて解離試薬を中和します。
      6. 組織チャンバーから残りの細胞を完全に除去するには、各デバイスユニットに500 μLのEGM2を加え、P200ピペットで洗浄します。
      7. 剥離した組織を含む消化液を300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、単一細胞および組織全体をペレット化します。
      8. 培地を慎重に吸引し、500 μLの1 mg/mL(200 U/mL)IV型コラゲナーゼ、0.1 mg/mLのヒアルロニダーゼV型、および200 U/mLのHBSS中のDNAseタイプIVを組織に加えます。
      9. 穏やかに再懸濁した後、溶液を室温で2分間放置してから、再び静かにピペッティングしてゲルを解離させます。
      10. 分解ミックスを 10 mL の EGM2 で洗浄し、300 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。 細胞を1% BSAまたはHSAを含む1x DPBSに再懸濁し、200 x g で1分間遠心させて、事前に湿らせた70 μmフィルターを通過させます。
      11. 細胞をカウントし、最終濃度が1000細胞/μLになるように容量を調整します。 その後、細胞懸濁液をFACS、フローサイトメトリー、またはシングルセルRNAシーケンシングにかけることができます。
   2. 全組織からのRNA単離
      1. 上記の手順4.4.1.1および4.4.1.2に従います。
      2. 曝露した各組織チャンバーに約 10 μL の RNA 溶解バッファーを添加し、バッファーが組織の上に直接プールされるようにします。合計で100 μLを超えるRNA溶解バッファーを使用しないでください。
      3. 室温で3分間インキュベートします。P20を使用して各デバイスユニットをピペットで上下させ、必要に応じてピペットチップを使用して組織チャンバーから残留物質をこすり落とします。
      4. できるだけ多くの溶解緩衝液を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。手順4.4.2.2.-4.4.2.3を繰り返します。残りのデバイス用にサンプルを1.5 mLチューブにプールします。
      5. キットまたは試薬に応じて、製造元の指示に従って RNA を単離してください。

図 3.免疫染色のためのプラットホームの準備。 (A)メンブレン層を上にした完全に組み立てられたデバイスプラットフォームの概略図。メンブレンを取り外すには、外層の各角を安定して穏やかな動きで慎重に引き下げます。(B)膜層が完全に除去されたら、刃物、メス、またはナイフを使用して、組織自体に切り込まないように注意しながら、各デバイスユニットの組織室の周囲を長方形に切断します。次に、スパチュラを各長方形の下に挟んでプレートから取り除き、各ユニットをPBSで染色する24ウェルプレートのシングルウェルに入れます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

結果

ここで概説したプロトコルに従って、VMOおよびVMTは、市販のEC、NHLF、およびVMTの場合はトリプルネガティブ乳がん細胞株MDA-MB-231を使用して確立されました。確立されたVMOは、転移を模倣するために癌細胞を灌流しました。各モデルでは、共培養の5日目までに、血管ネットワークが組織チャンバーを横切る重力駆動の流れに応答して自己組織化し、栄養素、治療薬、および癌細胞または免疫細胞を間質ニッチに送達するなどのin vivo の導管として機能します(図4)。VMOは、 図4A (培養0日目)に示すように、細胞が均一に分布するように、mCherry標識ECを組織チャンバーに導入することによって最初に確立されました。VMO培養の2日目に、ECは伸長して内腔化し始め(図4B)、4日目までにECは外側のマイクロ流体チャネルと吻合し、連続した血管ネットワークを形成します(図4C)。血管系...

ディスカッション

体内のほぼすべての組織が血管系を通じて栄養素と酸素を受け取るため、in vitroでの現実的な疾患モデリングと薬物スクリーニングに不可欠な要素となっています。さらに、いくつかの悪性腫瘍と病態は、血管内皮機能障害と透過性亢進によって定義されます³。特に、がんでは、腫瘍関連の血管系はしばしば灌流が悪く、破壊され、漏出しているため、腫瘍への治療および免疫細胞の送達に対する障壁として機能します。さらに、血管系は、がん細胞が転移して離れた組織に種をまくことができる導管として機能し、細胞間コミュニケーションを促進して免疫応答を弱め、がん細胞の増殖と播種をさらに促進します。これらの現象は、血管ニッチが治療抵抗性とがんの進行に果たす重要な役割と、前臨床試験中に腫瘍微小環境を正確にモデル化する必要性を浮き彫りにしています。しかし、標準的な in vitro モデルシステムでは、適切な間質および血管成分が含まれておらず、動的流動条件も組み込まれていません。現在のモデルシステムのこれらの欠点に対処するために、生理学的腫瘍学研究のための生きた灌流ヒト微小腫瘍(VMT)の形成をサ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Fabrication
(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン、95%	シグマ・アルドリッチ	175617-100G
グライナー バイオワン μクリアボトム96ウェルポリスチレンマイクロプレート	Greiner Bio-One	655096
Methanol &ge99.8% ACS	VWR 化学薬品 BDH	BDH1135-1LP
MILTEX 滅菌使い捨て生検パンチ プランジャー付き、直径 1mm インテグ	ラ ミルテックス	33-31AA-P/25
PDMS メンブレン	PAX インダストリー	HT-6240
プラズマ クリーナー PDC-001	ハリック プラズマ	N/A
スムースキャスト 385	スムースオン	N/A
SP Bel-Art Lab Companion クリアポリカーボネートキャビネットスタイル真空デシケーター	Bel-Art	F42400-4031
標準蓋、凝縮リング付き、96ウェルプレート	VWR	82050-827
SYLGARD 184 シリコーンエラストマーキット (PDMS)	ダウ	4019862
細胞培養/ローディング
BioTek Lionheart FX 自動化マイクロスコープ	アジレント
CELLvo ヒト内皮前駆細胞	StemBioSys	N/A
コラーゲン I, ラットテール	エンツォ ライフサイエンス
コラゲナーゼ from Clostridium histolyticum (type 4)	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1X with Caium and Magnesium	コーニング	21-021-CV
コーニング L-グルタミン、4.5g/L グルコース、ピルビン酸ナトリウムを含む DMEM	Corning	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS なし、カルシウムなし、マグネシウムなし	Gibco	14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	ロンザ	CC-3162
フィブリノーゲン ウシ血漿由来	Neta Scientific	SIAL-341573
フィブロネクチンヒト血漿	Sigma-Aldrich	F0895
オレセインイソチオシアネート–デキストラン (70kDa)	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
豚皮ゼラチン	Sigma-Aldrich	G1890
ヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼ (4型)	Sigma-Aldrich	H6254
ラミニンマウスタンパク質	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLFの–正常な人間の肺線維芽細胞	ロンザ	CC-2512
コンエクリプスTi	コン	N / A
パラホルムアルデヒド4%0.1Mリン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4	電子顕微鏡科学	15735-90-1L
PBMC - 末梢血単核細胞	ロンザ	CC-2702
PBS、pH 7.4	Gibco	10010049
プレミアムグレード ウシ胎児血清 (FBS)、熱不活性化	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold 退色防止マウンタント	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep Kit	Zymoウ	R1051
トロンビン	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100 (電気泳動)、	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X)、フェノールレッド	Gibco	12605028
Trypsin-EDTA (0.05%)、フェノールレッド	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cellテクノロジー	LL-0003