くも膜下出血後の脳切片におけるバイタルおよび非バイタル脳周皮細胞のイメージング

サマリー

予備調査では、くも膜下出血(SAH)が脳周皮細胞の死にを引き起こすことが確認されています。SAH後の周皮細胞の収縮性を評価するには、生存可能な脳周皮細胞と生存不可能な脳周皮細胞を区別する必要があります。そこで、高分解能共焦点顕微鏡を用いた観察を容易にするために、脳切片で生存可能な脳周皮細胞と非生存脳周皮細胞を同時に標識する手順が開発されました。

要約

周皮細胞は、脳の微小循環内に位置する重要な壁細胞であり、収縮性の調整を介して脳の血流を積極的に調節する上で極めて重要です。従来、それらの収縮性は、特定の状況下での形態学的変化と近くの毛細血管直径の変化を観察することによって測定されていました。しかし、組織固定後の活力の評価と、それに続く画像化された脳周皮細胞の周皮細胞の収縮性が損なわれます。同様に、脳周皮細胞の遺伝的標識は、特にくも膜下出血(SAH)などの神経学的状態において、生存可能な周皮細胞と生存不可能な周皮細胞を区別するのに不十分であり、予備調査で脳周皮細胞の死が検証されています。これらの制約を克服するために信頼性の高いプロトコルが考案され、脳切片の機能的および非機能的な脳周皮細胞の両方の蛍光タグ付けが可能になりました。この標識法により、高解像度の共焦点顕微鏡による可視化が可能になり、同時に脳スライスの微小血管系をマーキングすることができます。この革新的なプロトコルは、脳周皮細胞の収縮性、毛細血管径への影響、および周皮皮構造を評価する手段を提供します。SAHの文脈の中で脳周皮細胞の収縮性を調べることで、脳微小循環に対するその影響についての洞察に満ちた理解が得られます。

概要

脳周皮細胞は、細い隆起と突出した細胞体によって区別され、微小循環を取り囲んでいます^1,2。脳血流増強は主に毛細血管拡張によって引き起こされるが、細い動脈は拡張速度が^遅い3。ペリサイトの収縮性は、毛細血管径とペリサイトの形態に影響を与え、血管動態^{に影響を与えます4}。脳周皮細胞の収縮は毛細血管収縮につながり、病理学的シナリオでは、過度の収縮が赤血球の流れを妨げる可能性があります⁵。座骨髄から放出されるノルエピネフリンを含むさまざまな要因が、毛細血管内の脳周皮細胞の収縮を誘発する可能性があります⁶。ペリサイトは、脳血流の調節に関与し、20-HETE合成を示し、高^酸素症の際に酸素センサーとして機能します7。酸化的・硝化的ストレスによる脳周皮細胞の収縮は毛細血管に悪影響を及ぼす⁵.脳周皮細胞の収縮に関するin vivoおよびex vivoの両方の研究にもかかわらず⁸、脳スライス内の生存可能および非生存可能な脳周皮細胞のイメージングに関する限られた知識が残ってい....

プロトコル

実験プロトコルは、昆明医科大学の動物倫理および使用委員会(kmmu20220945)によって承認されました。本研究では、雌雄300〜350gのSprague-Dawley(SD)ラットを使用しました。

1. SAHモデルの誘導

1. 2%イソフルランと100%酸素を使用してラットを麻酔します。イソフルラン(1%〜3%)を連続吸入麻酔に供給することにより、麻酔を維持します。.脳定位固定装置を使用してラットの頭を固定します( 材料表を参照)。
2. 以下の手順に従って SAH モデルを作成します。
   1. マイクロインジェクションニードルを上槽に挿入します。次に、シリンジポンプを使用して、ラットの尾動脈(抗凝固剤なし)から自家血液を上槽槽に注入します( 材料表を参照)。
   2. 上記の座標を使用して、右外側脳室にマイクロ注射針を埋め込みます:ブレグマ、-0.8 mm;横方向、1.4 mm;奥行き、4 mm⁹。SAH群の場合、0.2 mLのラット尾動脈血を注入します。偽グループの場合、同じ量の等張生理食塩水を投与します(図1A)。

結果

通常の生理学的条件下では、脳周皮細胞は一般に細胞死を経験しません。 図6 はこの現象を示しており、黄色は重要な脳周皮細胞の存在を示しています。脳周皮細胞はPIによる染色を示さず、生存率を示しています。細胞死後も周皮細胞が微小血管系に付着したままであるかどうかをさらに調べるために、SAHラットモデルで方法を採用し、その後のイメージングを実施しました。

SAH後の脳スライス中の重要な脳周皮細胞と非重要な脳周皮細胞の両方をイメージングする方法が開発されています。 図7に示すように、重要な脳周皮細胞(青い矢印)は微小血管系内にあり、非重要な脳周皮細胞は白い矢印で表されています。この同時可視化により、脳スライス内の重要な脳周皮細胞と非重要な脳周皮細胞の両方を同定することができます。さらに、PI標識された非重要な脳周皮細胞が微小血管系全体に付着したままであることが観察されました。

ディスカッション

重要な脳周皮細胞、非重要な脳周皮細胞、および脳スライスの微小血管系を視覚化するための高解像度共焦点イメージング技術を開発しました。急性ラットの脳切片では、このプロセスでは、TO-PRO-3¹¹による周皮細胞の最初の標識、続いてIB4¹²による微小血管内皮細胞の標識が伴います。その後、PIを用いて死亡した周皮細胞の同定を行います。このプロトコールは、簡単で再現性が高く、機能研究に非常に適用できます。

神経系内の脳周皮細胞を特異的に追跡するために、遠赤色蛍光色素TO-PRO-3が用いられます。TO-PRO-3は、主に固定組織の核を染色するが¹³、生理食塩水に適用した場合、ex vivoで生体内の生きた周皮細胞に選択的に取り込まれる¹⁴。以前の研究では、TO-PRO-3を使用したマウスの脳周皮細胞の明確な同定が確認されています¹⁵。この蛍光色素は、重要.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェルプレート	ABC 生化学	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Illustrator CS6 16.0.0	RT
アルミホイル	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
共焦点イメージングソフトウェア	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
共焦点レーザー走査型顕微鏡	Nikon	N-SIM/C2si	RT
ガスタンク (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
ガラス底共焦点皿	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
製氷機	XUEKE	IMS-20	RT
画像解析ソフトウェア	国立衛生研究所	画像 J	RT
吸入麻酔システム	SCIENCE	QAF700	RT
イソレクチン B 4-フィット	グマ	L2895–2MG	ストアアリコート–20度;C
KCl	シグマ - アルドリッチ	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
パスツールピペット	NESTバイオテクノロジー	318314	RT
蠕動ポンプ	Scientific Industries Inc	203	RT
プロピジウム(ヨウ化物)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	アリコートを&ndashで保存します。20度;C
脳定位固定装置	SCIENCE	QA	RT
シリンジポンプ	Harvard PUMP	11 ELITE Nanomite	RT
サーモスタットウォーターバス	OLABO	HH-2	RT
振動ミクロトーム	Leica	VT1200	RT

シモデル