このプロトコルは脳の血液関門の信頼できる、有効な 生体外 モデルを記述する。この方法では、マウスの脳血管内皮細胞bEnd.3を使用し、膜貫通電気抵抗を測定します。
このプロトコルは脳の血液関門の信頼できる、有効な 生体外 モデルを記述する。この方法では、マウスの脳血管内皮細胞bEnd.3を使用し、膜貫通電気抵抗を測定します。
血液脳関門(BBB)は、微小血管内皮細胞、星状細胞、および周皮細胞で構成される動的な生理学的構造です。BBBは、有害物質の輸送制限、栄養素の吸収、および脳内の代謝産物クリアランスの間の相互作用を調整することにより、中枢神経系の恒常性を維持するために不可欠です。BBBの in vitro モデルの構築は、神経疾患の病態生理学を探求し、薬理学的治療法を作成するための貴重なツールです。この研究では、bEnd.3細胞を24ウェルプレートの上部チャンバーに播種することにより、 in vitro 単層BBB細胞モデルを作成する手順について説明します。細胞バリア機能の完全性を評価するために、従来の上皮細胞電圧計を使用して、正常細胞とCoCl2誘導低酸素細胞の膜貫通電気抵抗をリアルタイムで記録しました。以上の実験は、BBBの in vitro モデルや中枢神経系疾患の治療薬の創製に有効なアイデアを提供することが期待されます。
BBBは、血管内皮細胞、周皮細胞、星状膠細胞、ニューロン、その他の細胞構造で構成される血液循環と神経組織の間のユニークな生物学的インターフェースです1。血液と脳の間のイオン、化学物質、細胞の流れは、このバリアによって厳密に制御されています。このホメオスタシスは、毒素や病原体から神経組織を保護すると同時に、脳の神経の適切な操作を可能にします2,3。BBBの完全性を維持することで、神経機能障害、浮腫、神経炎症など、中枢神経系に影響を与える疾患の発症と進行を効果的に防ぐことができます4。しかし、BBBのユニークな生理学的特性により、低分子医薬品の98%以上、高分子医薬品の100%が中枢神経系に入るのを防ぎます5。したがって、中枢神経系の薬剤の開発中にBBBを介した薬剤の浸透性を高めることは、治療効果を達成するために不可欠です6,7。基質のコンピューターシミュレーションスクリーニングにより、医薬品候補がBBBを通過する確率が大幅に向上しましたが、科学研究のニーズを満たすためには、信頼性が高く手頃な価格のin vitro/in vivo
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
注:マウス脳由来内皮細胞.3(bEnd.3)を24ウェルプレートのチャンバーに接種し、特定の培地条件下でBBBの単純な in vitro モデルを構築しました。正常細胞と低酸素細胞のTEERをTEERメーターで測定しました(図1 、 図2)。
1. 溶液調製
2. 細胞培養と細胞生存率
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
このプロトコルにより、経内皮抵抗計に設定されたパラメータに従って、細胞の抵抗値の変化を記録することができました。異なる濃度のCoCl2で処理したbEnd.3細胞(生細胞数)の生存率をCCK-8アッセイでスクリーニングしました。CoCl2 によって引き起こされる細胞損傷が大きいほど、細胞生存率が低くなることが示されました。300 μMのCoCl2がin vitroで有意に細胞傷害性を示すことがわかったため、この濃度を次の実験に使用しました(図3A)。bEnd.3の増殖抵抗性の変化をモニタリングしたところ、5日目に細胞のTEER値が安定し始めたことが分かりました。6日目にプレートの上部チャンバーに300 μM CoCl2を添加することによって誘発された低酸素傷害は、12時間および24時間の両方の時点で、対照と比較してTEER値の有意な減少をもたらしました(図3B)。細胞バリア.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
最も発達した身体器官の1つである脳は、記憶、認知、聴覚、嗅覚、運動など、さまざまな複雑な生理学的プロセスを制御しています27。脳は、人体で最も複雑で病気の器官の1つであると同時に、人体で最も複雑で病気の器官の1つです。多くの中枢神経系疾患の発生は、大気汚染、不規則な食事パターン、およびその他の要因を含む要因により、年々増加傾向を示しています27,28,29。脳卒中、てんかん、アルツハイマー病(AD)などのいくつかの中枢神経系疾患の始まりと進行が、BBBの成長と密接に関連していることは興味深いことです30,31,32。脳機能障害を伴う大多数の疾患の治療の基本概念は、BBBの機能的恒常性を維持するための新しい治療法または薬物.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
著者は何も開示していません。
中国国家自然科学基金会(82274207および82104533)、寧夏回族自治区重点研究開発プログラム(2023BEG02012)、成都中華大学興林奨学生研究促進プロジェクト(XKTD2022013)からの財政的支援に感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 24ウェルトランズウェルプレート | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 & micro;m) | 10522023 | |
| 75%エタノール | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96ウェルプレート | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| 細胞培養皿 (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| 塩化コバルト (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad ソフトウェア | 9.0.0(121) | |
| マトリゲル (コラーゲンIVを含む) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| マイクロプレートリーダー | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS、1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| 次亜塩素酸ナトリウム | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| 膜貫通抵抗計 | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) |
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト
許可をリクエスト