Method Article

表面プラズモン共鳴(SPR)技術を用いた生体分子間の動的親和性のリアルタイム検出

DOI:

10.3791/65946

⸱

September 29th, 2023

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1School of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Institute of Integrated Traditional Chinese Medicine and Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In This Article

Summary

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本研究は、表面プラズモン共鳴(SPR)技術の原理と方法論を解明することを目的としており、これにより、複数のドメインにわたる多様な応用が見出されます。この記事では、SPR テクノロジ、その運用の容易さ、およびその優れた有効性について説明し、このテクノロジに対する読者の認識と採用を広く促進することを目的としています。

Abstract

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表面プラズモン共鳴(SPR)技術は、ウイルス、病原性分子タンパク質、受容体の検出、血液型の決定、食品の不純物検出など、生体分子の検出を行うための高感度で精密な方法です。この技術により、生体分子間の潜在的な結合を迅速に特定することができ、標識を必要とせずに、さまざまな指標の迅速でユーザーフレンドリーな非侵襲的なスクリーニングが容易になります。さらに、SPRテクノロジーは、ハイスループットの薬物スクリーニングのためのリアルタイム検出を容易にします。このプログラムでは、SPR技術の応用分野と基本原理について簡単に紹介します。操作プロセスは、装置のキャリブレーションと基本的なシステム操作から始まり、リガンドの捕捉と分析物のマルチサイクル分析へと詳細に概説されています。ケルセチンとカリコシンのKCNJ2タンパク質への結合のリアルタイム曲線と実験結果について詳しく説明しました。全体として、SPRテクノロジーは、薬物スクリーニング、関連する薬物動態のリアルタイム検出、ウイルス検出、環境および食品安全性の同定のための、非常に特異的で、シンプルで、感度が高く、迅速な方法を提供します。

Introduction

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表面プラズモン共鳴(SPR)技術は、分析物を標識する必要をなくす光学検出技術です。これにより、定量的な結合親和性、速度論、および熱力学のリアルタイムかつ動的なモニタリングが可能になります。このハイスループット容量は高感度で再現性が高いため、さまざまなオープンレート、オフレート、アフィニティの測定が可能です。さらに、必要なサンプル量が少ないため、この方法の有用性がさらに向上します1,2。生体分子間の親和性結合をモニターする高速応答生体分子検出法3は、著名な研究分野として浮上しています。

SPR技術は、医薬品の研究開発の分野でさまざまな用途があります4。その用途の1つは、特定の薬物標的の構造的基盤を発見することです。また、有意な薬理活性を有する漢方薬の有効成分を特定し、薬物のスクリーニングと検証のためのそれらのメカニズムを研究するためにも使用できます。Gassnerらは、SPR測定により二重特異性抗体の線形用量反応曲線を確立し、これにより濃度分析と品質管理が可能になりました5。さらに、SPRは、薬局方やワクチン開....

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Protocol

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注:完全な実験検出曲線は、実験プロセスを8つの異なる段階に分類できることを示しています。

1. サンプルとバッファーの調製

  1. 実験前にセンサーチップを準備してください。
    1. チップをピラニア溶液(30%H2O2:H2SO4= 1:3; v / v)で2分間処理します。その後、チップを大量の脱イオン水で完全に洗浄し、無水エタノールに浸して自然乾燥させます。
    2. 次に、チップを50 Mの濃度の11-メルカプト-l-ウンデカノール(MUOH)の溶液に一晩浸し、その後、チップをエピクロロヒドリン溶液に入れ、25°Cで4時間反応させます。
    3. 溶液からチップを取り出し、蒸留水と無水エタノールで十分に洗浄します。最後に、デキストラン塩基性溶液をチップの金膜表面に滴下し、25°Cで20時間反応させます。チップを脱イオン水で洗浄し、ブロモ酢酸溶液に浸してデキストランヒドロキシルカルボキシメチル化修飾を実現します。ケルセチンとカリコシンをそれぞれ純度≥98.5%と≥99%で使用します。
  2. ランニングバッファー、アクチベーター、固定化バッファー(10 mM 酢酸ナトリウム)、および再生液 1....

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Results

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タンパク質がチップ表面に固定されているかどうかを判断するために、SPRセンサーマップ(図1)の縦座標(応答信号)を使用し、SPR曲線の角変位を求めます。 図2 および 図3 は、3.9 μMから250 μMの範囲の濃度で制御還元した後の、KCNJ2組換えタンパク質の固定化表面上のケルセチンおよびカリコシンとKCNJ2組換えタンパク質との相互作用のSPR曲線を示しています。物質輸送の影響による不正確さを最小限に抑えるために、KCNJ2組換えタンパク質分子は低濃度で固定されただけでなく、速度論試験中に20μL/minの高流速にもさらされました。その結果、ケルセチンとカリコシンの用量反応官能マップが得られました。 表1 と 表2 は、運動速度定数(会合速度定数Ka;解離速度定数Kd)と解離平衡定数(KD)の計算結果を示しています。両者を比較すると、カリコシンのKa定数はケルセチンのKa定数よりも高い.......

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Discussion

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SPR解析サイクルは4つの段階に分かれています。最初の段階であるベースラインには、バッファーの注入が含まれます。それに続くのが第2段階であるリガンド捕捉です。センサーチップCOOHは、EDC/NHS(1:1)で20μL/minの流量で活性化されます。次に、チップを1 Mエタノールアミン塩酸塩-NaOHを使用して、20 μL/minの流速で不活性化します。次に、第3段階であるマルチサイクル分析種法に進みます。分析種は、20 μL/minの流速で240 sの会合相でチャネルに注入され、続いて360 sの解離期間が続きます。関連付けプロセスと分離プロセスの両方が、実行中のバッファーで実行されます。分析種のサイクルは、分析種の濃度に応じて昇順で繰り返されます。相互作用解析の各サイクルの後、10 mM グリシン-HClを注入バッファーとして使用して、150 μL/minの流速でセンサーチップの表面を完全に再生し、分析対象物を除去する必要があります。次に、分析物の注入と再生ステップを行うことにより、分析物の次の濃縮サイクルが繰り返されます。最後に、第4ステップでは、10 mMグリシ.......

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Disclosures

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著者は何も開示していません。

Acknowledgements

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この研究は、四川省メジャーR&Dプロジェクト(2022YFS043)、寧夏回族自治区の主要研究開発プログラム(2023BEG02012)、および成都TCM大学のXinglin Scholar研究推進プロジェクト(XKTD2022013)の支援を受けました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)Nan Jing Reagent,Nanjing,ChinaC08296594
無水エタノールMerck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China459836
BIAnormalizing solutionMerck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China49781
ブロッキングソリューションBosheng Biotechnology Co.,Ltd.,上海、中国110050
ブロモ酢酸Merck Chemical Technologies Ltd.、上海、中国17000
CalycosinPush Bio-technology Co., Ltd.、成都、中国PU0124-0025
DextranCanspec Scientific Instruments Co., Ltd.、上海、中国PM10036
EpichlorohydrinMerck Chemical Technologies Ltd.、上海、中国
エタノールアミン塩酸塩Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaS44235
Glycine-HClMerck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, ChinaG2879
H2O2Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China3587191
H2SO4Nantong high-tech Industrial Development Zone,China2020001150C
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Shandong, ChinaS3872
KCNJ2 (Human) Recombinant ProteinAbnova,West Meijie Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaH00003759-Q01
MUOHJizhi Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaM40590
NaOHMerck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, ChinaSX0603
N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaS13005
OpenSPRTMNicoya
QuercetinPush Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, ChinaPU0041-0025
Sensor Chip COOHNicoya
Sodium AcetateMerck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China229873
492515

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jebelli, A., Oroojalian, F., Fathi, F., Mokhtarzadeh, A., Guardia, M. Recent advances in surface plasmon resonance biosensors for microRNAs detection. Biosens Bioelectron. 169, 112599(2020).
  2. Sun, B., Xu, J., Liu, S., Li, Q. X. Characterization of small mo....

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Surface Plasmon ResonanceSPR TechnologyReal Time DetectionBiomolecular InteractionDrug ScreeningLigand CaptureMulti Cycle AnalysisVirus DetectionProtein BindingFood Safety
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