ファージとロボット工学によるほぼ連続的な進化の実践ガイド

PRANCEは、2つの強力な指向性進化技術を組み合わせたものです。1つ目は^PACE1で、遺伝子の多様化と選択をM13バクテリオファージの速いライフサイクルに結びつける分子技術であり、液体ファージ培養において急速な進化のラウンドが連続的に起こることを可能にします。この選択は、進化するタンパク質の機能を、ファージの繁殖に必要なM13のテールコートタンパク質であるpIIIの発現に結合するプラスミドコード遺伝子回路の使用によって推進されます。実験レベルでは、液体ファージ培養物の連続希釈により、連続的な選択が可能になります。したがって、選択の厳格さは、ファージ培養の希釈速度を制御することにより、遺伝子回路のレベルと実験レベルの両方で調節できます。したがって、PACEは、大腸菌の所望の活性を検出してpIII発現を誘導できる分子センサーがあるあらゆる生体分子工学の課題に適用できます。アプリケーションには、タンパク質-タンパク質結合^2,3,4、タンパク質-DNA結合⁵、タンパク質溶解度⁶、および多数の特定の酵素機能⁷の進化が含まれます。2つ目は、ロボティクスで加速された進化^8,9で、フィードバックコントローラを使用して、指向性進化の2つの一般的な故障モード、つまり、環境が厳しすぎるときに発生する絶滅と、環境が緩すぎるときに発生する進化の欠如を排除します。PANCE(ファージ支援非連続進化)^7,10で行われるファージの逐次継代とは異なり、ロボット工学で加速された「ほぼ連続的」進化では、培養を中期に維持する迅速なピペッティングが行われ、集団が感染と増殖の連続的なサイクルを経験することができます。これら2つの技術を併用すると、PHAGEとRobotics-assisted Near-continuous Evolution⁸の略でPRANCEと呼ばれ、堅牢で多重化された迅速な連続進化が可能になります。PRANCEは、ポリメラーゼ、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素を進化させ、それらの進化中にフィードバック制御を行い、それらの速度^{と信頼性を向上させる}ために使用されています8。

PRANCEのハードウェアとソフトウェアのセットアップには、リキッドハンドリングロボットでバクテリオファージを使用できるようにするためのいくつかの詳細があります。ロボットメーカーが提供するデフォルトのソフトウェアを使用する代わりに、Pythonベースのオープンソースソフトウェアパッケージ¹¹を使用しており、高速な同時実行を可能にし、半連続バイオリアクターを中間対数相に維持することができます。研究者のハンズオフ時間は、デッキ上のいくつかのコンポーネントを定期的に自己滅菌することで数日に延長することができ、これはこれらのコンポーネントを漂白およびすすぐことができるポンプの自動制御によって達成されます。ファージのクロスコンタミネーションは、フォースフィットチップを使用しないリキッドハンドリングロボットを使用し、リキッドハンドリング設定を慎重に調整することで排除できます。

1. ハードウェアのセットアップ

メモ:PRANCEシステムのハードウェアコンポーネントの概要については 図2 を、物理的に組み立てられたこれらのコンポーネントの写真については 図3 を参照してください。

1. リキッドハンドリング機器、プレートリーダー、補助ポンプなど、PRANCEシステムの主要なハードウェアを入手します。
   注:これまでのすべてのPRANCEシステムは、8チャンネルの個別アドレス指定可能なピペッティングアーム、シングルピストン96チップピペッティングアーム、プレート移動用のロボットグリッパー、チップ滅菌用の統合洗浄ステーション、吸光度と発光測定が可能な統合プレートリーダーを備えた中型から大型のリキッドハンドリング機器に実装されています。
2. リキッドハンドリングロボットのモデルと機能に応じて加熱方法を設定します。加熱プレートキャリアまたはヒーター媒介ロボット温度調節を使用します。
3. チップの再利用を可能にするために、チップ洗浄ステーションを設置します。
   注:これまで、PRANCEシステムは既製の洗浄ステーションを使用してきましたが、原理的には、このコンポーネントは低コストのコンポーネントから簡単に構築できます。
4. ケモスタット/タービドスタットとして37°Cで動作するリアルタイムバイオリアクターをセットアップすることにより、対数相で維持される細菌培養源を確立します。あるいは、37°Cの対数相(OD₆₀₀ 、0.25〜0.45)で、近くの冷蔵庫で4°Cで増殖した少なくとも1 Lの容量の対数相細菌培養を停止します。沈殿を防ぐために、培養物は、冷蔵または温めにかかわらず、シェーカープレートまたは攪拌プレートを使用して定期的に攪拌してください。
5. 必要なソフトウェアとドライバーを使用してロボットを統合するために、優先ポンプを構成します。ソフトウェアを実装して、ポンプが10〜100 mLのオーダーで定義された量の液体を供給できるようにします。
   メモ: この実装で使用されるポンプについては、 部品表 を、これらのポンプの操作に使用するソフトウェアと、それらの構成方法に関するドキュメントについては、製造元の Web サイトを参照してください。この原稿で示したPRANCEセットアップで使用されるポンプ用のこのようなソフトウェアは、次のGitHubリポジトリでオープンソースで提供されています https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCEには、3つの別々のチャネル(バクテリアをバクテリアリザーバーに送達する、漂白剤をバクテリアリザーバーに送達する、バクテリアリザーバーを廃棄物に排出する)をポンプで送ることができる少なくとも3つのポンプマニホールドが必要であり、それぞれの速度は独立して校正および制御されます。以前、人々は水槽ポンプと水耕栽培ポンプアレイを使用してきましたが、原則として、ニシキヘビが制御できる蠕動ポンプを使用できます。重要な機能には、ロボットグリッパーを使用してプレートをリーダーに出し入れする機能、プレートリーダー測定を開始する機能、測定値にアクセスする機能が含まれます。
6. 補足ファイル1(https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link)にあるように、少なくともバクテリアリザーバー/分配マニホールド(「ワッフル」)を含む、PRANCEシステムに必要なカスタムデッキコンポーネントを3Dプリントします。これらの容器をデッキに固定し、標準のリキッドハンドリングロボットソフトウェアを使用して位置を校正します。リザーバーをポンプアレイに接続します。
   注意: キャリブレーションの実行方法の詳細はロボットに依存するため、ロボットの製造元のドキュメントを参照してください。樹脂ベースの3Dプリンターが最適です。使用されるプリンタータイプの例は、 材料表に記載されています。標準のClear Resinをデフォルトのプリンタ設定で使用しました。
7. 地域のバイオセーフティー勧告に適合するドレンをシステムに装備します。
8. リキッドハンドリングロボットのデッキに実験器具を置きます( 図4)。
9. 標準的な実験室用個人用保護具(白衣、手袋、目の保護具など)の使用を含む、標準的な安全手順に従ってください。

2. ソフトウェアの準備

1. オープンソースのPyHamiltonリポジトリから入手できる、python¹¹でリキッドハンドリングロボットを制御するために使用されるオープンソースソフトウェアをインストールします。https://github.com/dgretton/pyhamilton
2. 図 4 に示すように、リキッドハンドリングロボットソフトウェアのデッキレイアウトファイルを修正およびキャリブレーションして、ロボットデッキ上のラボウェアの位置を正確に反映します。
   注意: ここで使用されるセットアップは、提供されたドキュメントに従って、液体処理ロボットの製造元から提供されたソフトウェアを使用します。
3. PRANCEロボットメソッドプログラムを シミュレーションモードで実行します。
   1. 次のコマンドを使用してコマンドラインを開きます(Windowsオペレーティングシステムの場合)図 5に示すように。
      Windowsキー+ R
      「cmd」と入力します。
   2. 親ディレクトリをロボットメソッドプログラムのディレクトリに変更します。 図5に示すように、正しいパスで以下のコマンドを入力します。
      CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE
   3. Pythonでシミュレーションモードフラグを指定してロボットメソッドプログラムを呼び出します( 図5参照)。
      py robot_method.py --simulate
   4. プログラムの実行時に開く [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択します (図 5)。
      注記 : 先に進む前に、シミュレーションで PRANCE メソッドがエラーなしで実行できることを確認してください。スクリプトがエラーなしでシミュレーションモードで動作できるかどうかは、システムのエラー処理が呼び出されることなくメインプログラムの複数のループを完了し、メインプログラムループを終了するため、明らかになります。
4. シミュレーションモードを無効にして、PRANCEロボットメソッドプログラムを実行します。
   1. 適切なディレクトリでコマンドラインを開きます(図5)。
      Windowsキー+ R
      「cmd」と入力します。
      CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE
   2. Pythonでフラグなしでロボットメソッドプログラムを呼び出します。
      py robot_method.py
   3. プログラムの実行時に開く [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択します。
   4. PyHamiltonが計測器を制御し、初期化できることを確認します。
5. リアルタイムのデータ同期を確立します。
   注:これまで、PRANCEシステムは、ユーザーがリモートファイル共有ソフトウェアまたはリモートデスクトップを介してログファイルとリアルタイムのプレートリーダー測定グラフを監視できるネットワークコンピュータを使用してきました。
6. 自動更新をオフにします。

3. 実行前の準備

1. 計画された分析に必要なすべての培養物に対数相の細菌培養源が利用可能であり、沈降を防ぐために積極的に攪拌されていることを確認してください。活性ケモスタット/タービドスタットまたは増殖停止冷蔵増殖済み培養液を使用してください。
2. プログラムサイクルごとに、96ウェルラグーンの各ウェルにポンプで送る細菌培養の量(範囲0〜500 μL)の詳細でコントローラーマニフェストファイルを更新します。これにより、ラグーンの有効希釈率を正確に制御できます。これを 図 6 に示します。
   1. 図 7 に示すように、DilutionCalculator.xlsxスプレッドシート(補足ファイル 2 として提供)を使用してラグーンの希釈率を計算します。
3. robot_method.pyファイルを目的のラグーンの高さで更新します。このプロトコルに従うには、プログラム内の変数fixed_lagoon_heightのデフォルト値として 14 (ミリメートル単位) を使用します。これは、システム上のラグーン容量 550 μL に相当しますが、使用する特定の 96 ディープウェルプレートによって異なる場合があります。
4. 清潔なフィルターを通したピペットチップをロボットデッキの所定の位置に置き、チップラックをチップホルダーにテープで固定して、分析中の安定性を確保します。
5. 清潔な96ウェルプレートをロボットデッキの指定された位置に配置します。
6. 清潔な96ウェルリーダープレートをロボットデッキの指定された位置に配置します。
7. プレートリーダートレイが既存のプレートで占められていないことを確認します。
8. ポンプがコンピュータに接続され、正しいアドレスに割り当てられていることを確認します。
9. ポンプを作動させて漂白剤を汲み上げてから水を汲み上げて、ポンプラインを清掃します。
10. ポンプラインを適切なソースとアウトプットに接続し、正しいラインが関連する細菌培養物に接続されていることを確認するために細心の注意を払います。
11. バクテリアリザーバーとピペットチップ洗浄用の漂白剤/水を含むタンク/バケツを補充します。
12. 甲板上のすべてのコンポーネント、特に可動要素が指定された位置で安定していることを確認してください。
13. ローカル実装に従って、目標温度(つまり、37°C)までヒーターを作動させます。 図8)。
14. UV滅菌プロトコルファイルを10分間実行して、メーカーから提供されたリキッドハンドリングロボットの内蔵UV滅菌ランプを操作します(図9)。
    1. プログラムの実行時に開く [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択します。
    2. parametrized オプションを指定してファイルを 600 秒間実行します。
15. ロボット実行制御ソフトウェアが閉じていることを確認します。
    メモ: ロボットメソッドプログラムは、実行制御ソフトウェアの既存のインスタンスが実行されている場合にクラッシュします。

4. ハードウェアとソフトウェアの統合

1. 「ウォーターラン」を実施し、PRANCEロボットメソッドプログラムを、すべての培養物と湿式試薬の代わりに水で一晩中実行します。
   注:このテストは室温で実行できます。
   1. 図 5 および図 6 に示すように、ラグーンの有効希釈速度が 1 容量/h になるようにcontroller_manifestとrobot_methodを設定して、上記のように分析前調製を完了します。
   2. 「バクテリアイン」ラインを水の容器に接続して、給水用の対数相バクテリアを交換します。
      注:食品着色料を水源に追加して、実験中の液体の動きを追跡できます。
   3. 適切なディレクトリでコマンドラインを開きます。
   4. 新しい実行フラグ (py robot_method.py --new) を使用して Python でロボット メソッド プログラムを呼び出し、 ログ ファイル名 (TestRun)、ラグーン ウェルの数 (16)、 サイクル期間 (30)、 リーダー プレート測定あたりのサイクル数 (4)、 インデューサー ボリューム (インデューサー ボリュームは 0 ) など、要求された引数を入力しますこの試験では、アラビノースで突然変異誘発が誘導される進化の間、この値は10μLである可能性があります)、 図5に示すように。
   5. [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択すると、引数が指定されるとプログラムが実行されると開きます。
      注:PRANCE法は空のラグーンプレートを使用して開始でき、ラグーンの液体量は最初の6サイクルで最終容量に平衡化します。
2. バクテリオファージを含まない、目標温度での細菌培養のみでPRANCEプロトコルを一晩実行する「バクテリアのみのラン」を実施します。
   1. 図 5 および図 6 に示すように、ラグーンの有効希釈速度が 1 容量/h になるようにcontroller_manifestとrobot_methodを設定して、上記のように分析前の前処理を完了します。目標温度が37°Cになるようにヒーターがオンになっていることを確認してください。
   2. 「バクテリアイン」ラインを、選択した対数相バクテリアの発生源に接続します。
   3. 適切なディレクトリでコマンドラインを開きます。
   4. 新しい実行フラグ (py robot_method.py --new) を使用して Python でロボット メソッド プログラムを呼び出し、セクション 4.1.4 で前述したように、要求された引数を入力します。
   5. [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択すると、引数が指定されるとプログラムの実行時に開きます。
3. 進化したタンパク質を持つファージが、そのタンパク質を必要とする細菌で増殖するように挑戦する「感染テスト」を実行します。
   注:どのラグーンにファージを接種し、どのラグーンに接種しないかを事前に決定し、クロスコンタミネーションを検出するためのファージコントロールラグーンとして機能します。
   1. 図 5 および図 6 に示すように、有効希釈速度 1 容量/h になるようにcontroller_manifestとrobot_methodを設定して、上記で詳述した分析前調製を完了します。目標温度が37°Cになるようにヒーターがオンになっていることを確認してください。
   2. 「バクテリアイン」ラインを、選択した対数相バクテリアの発生源に接続します。
   3. 適切なディレクトリでコマンドラインを開きます。
   4. 新しい実行フラグ (py robot_method.py --new) を使用して Python でロボット メソッド プログラムを呼び出し、セクション 4.1.4 で前述したように、要求された引数を入力します。
   5. [ロボット実行制御] ウィンドウの左上にある [再生] ボタンを選択すると、引数が指定されるとプログラムが実行されると開きます。
   6. バクテリオファージを添加する前に、この方法を2〜3時間実行して、ラグーンプレート内の体積とバクテリアODを平衡化します。
   7. プログラムがスリープしているときに、実行サイクルの終わりに10⁶ pfu/mLのバクテリオファージをウィズファージラグーンに接種します(例えば、プラークアッセイまたはqPCRによって決定された10⁸ pfu/mLのファージアリコート5.5 μLを)、550 μLラグーンに接種します。
   8. プログラムを一晩実行し、プラークアッセイまたはqPCRによってラグーンウェルのファージ力価を確認します。

感染検査結果
このテストでは、細菌培養、ファージクローニングと力価、機器の温度安定性、リキッドハンドリング設定、プレートリーダーの統合に関する問題を明らかにします。巧妙なバクテリオファージの伝染テストはファージと接種された礁湖の明確で、急速なバクテリオファージの伝染を明らかにし、ファージの礁湖の信号無し。 図10 にファージ感染検査の代表的な結果を示します。実験結果は、「ホットPRANCE」(生きた細菌タービドスタットによって供給される)または「クールPRANCE」(冷やされた中対数段階培養によって供給される)構成が実装されているかどうかに応じて、このPRANCE論文8の図1dおよび1cと比較することもできます。このテストでは、いくつかの一般的な問題が明らかになる場合があります。細菌培養の準備に問題があると、感染が弱くなったり、感染がなかったりすることがよくあります。バクテリアは、中対数期で37°Cにある場合にのみ、M13ファージによって最適に感染することができます。 他の温度や成長段階では、毛線毛の発現が弱くなるため、ファージ感染の影響を受けにくくなります12。低力価ファージ、またはバックボーン変異を有するファージを接種すると、シグナルの遅延または欠如が生じる可能性がある。このテストでは、蛍光または発光のプレートリーダーのゲイン設定の問題が明らかになります。

図1:PRANCE装置の感染試験中に作動する遺伝子回路の模式図。 ファージゲノムにコードされたT7 RNAポリメラーゼが宿主である 大腸菌 に感染すると、転写されてT7プロモーターでAPに結合し、pIIIファージタンパク質とluxABタンパク質の転写をもたらし、ファージの増殖と発光の産生を促進します。略語: PRANCE = ファージおよびロボット工学支援の準連続進化;AP = アクセサリープラスミド。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:PRANCEシステムの物理コンポーネントの概略図。 攪拌した培養物は冷蔵庫に保管され、ポンプの配列によってロボットデッキに運ばれ、バクテリアの貯蔵庫である「ワッフル」に送られます。リキッドハンドリングロボットは、ピペッティングヘッドを使用して「ワッフル」から保持ウェルに細菌培養物を移動させ、インキュベーション温度まで温め、次にメインインキュベーションが行われるラグーンに移動させるために使用されます。保持井戸とラグーンはどちらも標準的な2 mLディープウェルプレートです。ロボットはサンプルをシングルユースのリーダプレートに取り込み、プレートリーダに移して測定します。略語:PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution(ファージおよびロボット工学支援による準連続進化)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:PRANCEロボット装置。 (A)PRANCEのセットアップ。(I)HEPAフィルターと外部ヒーター。(II)培養冷蔵庫。(III)ロボットのメインエンクロージャー。 (IV) プレートリーダー。 (V) ポンプとタンク。(B)ロボット筐体。 (VI) メイン培養ポンプ。 (VII) 水、廃棄物、漂白剤タンク。 (VIII) ウォッシャーポンプ。(C)ロボット筐体。(IX) ロボットピペッティングアームとグリッパー。(X)ピペットチップ。(XI)ロボット(「ワッフル」)への培養分配を可能にするための3Dプリントされたコンポーネント。(XII)プレートリーダーでサンプリングするためのプレート。(十三) 先端洗浄用バケツ(XIV) 「ラグーン」:進化的培養が行われる培養容器。略語: PRANCE = ファージおよびロボット工学支援の準連続進化;HEPA = 高効率粒子状空気。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:デッキレイアウト。 (A)ロボット制御ソフトウェアでのデッキレイアウトの3D表現。(B)甲板部品の写真。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:パラメータの例(上)と実行制御ソフトウェア(下)を含むコマンドラインのスクリーンショット。 再生ボタンは左上にあり、ローカルの実装に応じて、マウスでクリックしたり、タッチスクリーンで操作したりできます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図 6: テスト実行用に構成されたコントローラー マニフェスト ファイル。 培養物 #0 を含むラグーンは、96 ディープウェルプレートの列 1 と 3 にあります。残りの列は空になります。96-deep-well-plateの列A、B、D、およびEは、ファージによる感染(1)の右側の列にマークされており、他の列(0)はファージなしの対照です。コントローラーマニフェストのこのインスタンスでは、プログラムはサイクルごとに 210 μL の培養液でラグーンを希釈します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図7:DilutionCalculatorスプレッドシートを使用したラグーンの実効希釈率の計算。DilutionCalculator スプレッドシートの補足ファイル 2 を参照してください。この図に見られるように、550 μLのラグーンを30分サイクルごとに210 μLの新鮮培養液で希釈し、リーダープレート測定用のサンプルを4サイクルごとに採取すると、1.0ラグーン容量/時間の有効希釈率になります(1時間ごとに、時間開始時の元のラグーン液の50%が残ります) これの拡大版を表示するには、ここをクリックしてください像。

図8:ロボットヒーターシステム。 ヒーターは、赤い丸で示されているように電源を差し込むことで作動します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図9:UV除染プロトコルの設定。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図10:PRANCEシステム上で実施した感染試験の測定結果。 分析中にサンプルを採取し、発光と吸光度の測定を行います。各ラグーンについて、発光測定値を対応する吸光度測定値で除算し、時間の関数としてプロットします。ファージに感染したラグーンは緑色で、感染していない対照ラグーンは黒色です。略語:PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution(ファージおよびロボット工学支援による準連続進化)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:少なくともバクテリアリザーバー/分配マニホールド(「ワッフル」)を含む、PRANCEシステムに必要なカスタムデッキコンポーネントを3DプリントするためのSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:DilutionCalculatorスプレッドシート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らに開示すべき矛盾はない。