生体内 ラット三叉神経節における感覚ニューロンのカルシウムイメージング

身体感覚は、皮膚や筋肉、骨、内臓などの身体構造に影響を与える機械的、熱的、化学的刺激の神経コードであり、^{これらの構造を}神経支配する一次求心性ニューロンの活動から始まります1。単一ユニットベースの電気生理学的アプローチは、このプロセスに関与する求心性サブタイプと、それらの刺激応答特性が時間の経過とともにどのように変化するかについての豊富な情報を提供しています^1,2,3。しかし、特定の感覚モダリティがニューロンの特定のサブポピュレーションによって伝達されることを示唆する標識線理論を支持する強力な証拠が残っている一方で、ニューロンの多くのサブポピュレーションが同じタイプの機械的、熱的、および化学的刺激に応答する能力は、体性感覚刺激の大部分がニューロンの複数のサブポピュレーションによってコードされていることを示唆しています^4。5.したがって、体性感覚をよりよく理解するには、数百とは言わないまでも、数十のニューロンの活動を同時に研究する能力が必要です。

比較的最近の共焦点およびそれに続く多光子およびデジタルイメージング技術の出現による光学的アプローチの進歩により、ニューロン活動の比較的非侵襲的な集団レベルの分析を実行する能力が容易になりました^6,7。この技術の応用における最後のハードルの1つは、神経活動の光学的評価を可能にするツールの開発でした。活動電位の速度がミリ秒未満で開始および終了することを考えると、活動電位の速度で膜電位の変化に追従する能力を備えた電位感受性色素は、この目的に理想的なツールです。しかし、この分野では驚異的な進歩がありました^{が7、8、9、10}、これらの色素の多くは、単一細胞レベルで数百のニューロンの集団分析を可能にするには、まだ十分に高くありません。代替アプローチとして、研究者は細胞内^Ca2+濃度([^Ca2+]_i)の変化をモニタリングすることに目を向けました。この戦略の限界は当初から明らかであり、[Ca²⁺]_iの増加が神経活動の間接的な尺度であるという事実を含む¹¹。[^Ca2+]_iの増加は、電位依存性^Ca2+チャネル(VGCC)の活性化に関連する^Ca2+流入とは無関係に起こり得ること^12,13;^Ca2+トランジェントの大きさと持続時間は、VGCC活性とは無関係なプロセスによって制御され得ること11,12,14;そして、^Ca2+トランジェントの時間経過は、活動電位の時間経過^{をはるかに超えています15}。それにもかかわらず、神経活動の間接的な尺度としての^Ca2+の使用に関連する多くの重要な利点があります。これらのうち、ほとんどの^Ca2+指標に関連するS/N比は、細胞内^Ca2+の変化の大きさと、シグナルが細胞膜の2次元空間ではなく細胞質の3次元空間から生じているという事実の両方を反映しています。さらに、遺伝的にコードされたCa²⁺指標(GECI)の開発により、細胞の特定の亜集団におけるCa²⁺指標の発現を促進する遺伝的戦略を利用することが可能になり、インタクト調製物における集団レベルの分析が容易になります(例えば、¹⁶を参照のこと)。

現在マウスで利用可能な遺伝的ツールの数を考えると、GECIがこの種の中で最も広く使用されていることは驚くことではありません。感覚ニューロンの亜集団における構成的GECI発現を有するマウス系統が開発されている^7,16,17。特定の細胞型でリコンビナーゼを発現するマウス系統の開発により、GECI発現を制御するためにさらに高度な戦略を使用することが可能になった¹⁵。しかし、これらのツールはかつてないほど強力になっていますが、ラットなどの他の種が実験的な問題に適している理由はいくつかあります。これらには、サイズが大きいことが含まれ、小さなマウスでは不可能ではないにしても困難な多くの実験的操作を容易にします。比較的複雑な行動課題におけるラットの訓練の容易さ。そして、ラットの感覚ニューロンにおけるいくつかのイオンチャネルの生物物理学的特性および発現パターンは、ヒトと比較したマウスの同じチャネルよりもヒトの感覚ニューロンで観察されたものとより類似している可能性があるという少なくともいくつかの証拠¹⁸。

体性感覚刺激の伝達は一般に一次求心性神経の末梢末端で起こるが、末梢で開始された活動電位は、中枢神経系に到達する前に、後根(DRG)または三叉神経節(TG)神経節と呼ばれる一次求心性体細胞を収容する構造を通過しなければならない¹⁹。一次求心性軸索に沿って伝播するすべての活動電位が細胞体に侵入するわけではないという証拠があるが²⁰、一次求心性体細胞がT結合を介して主求心性軸索に結合しているという事実の結果として¹⁹、末梢で開始された活動電位の大部分は体細胞²¹に侵入するように見える.これは、GECIを使用して一次求心性における集団コーディングを評価する際に、3つの実験的利点をもたらします:軸索に対する細胞体のサイズが大きいため、[Ca²⁺]_iを求心性活動の間接的な尺度として使用する場合、信号対雑音比がさらに増加します。DRGは一般的に簡単にアクセスできます。また、求心性終末から空間的に離れた部位での活動を評価することで、求心性終末の刺激反応特性に対する神経節を露出させるために必要な手術の潜在的な影響を最小限に抑えることができます。ただし、TGは脳の下(またはパレットの上)にあるため、DRGよりもはるかにアクセスが困難です。さらに、DRGニューロンとTGニューロンの間には多くの類似点がありますが、相違点のリストも増えています。これには、TGにおけるニューロンのほぼ体性構成²²、神経支配されたユニークな構造、異なる中枢末端終末パターン^{23、24、25、26}、そして現在では遺伝子発現^27,28と機能的受容体発現の両方における相違点のリストが拡大している²⁹が含まれる.さらに、疼痛の末梢メカニズムの同定に関心があるため、三叉神経系に特有と思われる疼痛症候群(片頭痛、三叉神経痛、口内灼熱症候群など)が比較的多数あり、一次求心性に異常な活動性が関与しているように見える30,31,32は、TGを直接研究する必要があることを示唆しています。

このように、TGニューロンの刺激応答特性は、マウス¹⁶のGECIを用いて研究されてきたが、上記の理由により、ラットは様々な実験的問題に取り組むのにより適切な種である可能性が示唆されるため、本研究の目的は、ラットのTGニューロンを研究するためにGECIを使用するアプローチを開発することであった。これを達成するために、末梢神経系におけるGECI GCaMP6の発現を促進するウイルスアプローチを利用しました。次に、前脳を切除してTGにアクセスできるようにしました。最後に、機械的刺激と熱的刺激を顔面に当て、神経細胞の反応を蛍光顕微鏡で評価しました。これらのデータを総合すると、ラットを利用して多くの状態下でTGの変化を調査する役割が支持され、三叉神経系の感覚コーディングに関心のある研究者のためのツールキットが拡大されます。

研究における動物の使用を含むすべての実験は、国立衛生研究所および国際疼痛学会によって定められた基準に従って実施され、ピッツバーグ大学の施設的動物ケアおよび使用委員会(プロトコル#22051100)によって承認されました。各実験の最後に、ラットは、米国獣医師会とピッツバーグ大学IACUCによって承認されたアプローチである氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の心臓灌流による発疹によって安楽死させられました。

1. GCaMP誘導

1. 出生後適切な時期に子犬を注射できるように、妊娠中のSprague Dawleyラットを注文します。
2. 各ラットの子犬を扱う前に、手袋に70%EtOHをスプレーします。これにより、ダムが若者を共食いするのを阻止できます。
3. ラットの仔(P1-2)を70%EtOHで綿棒で拭き取り、氷上で3分間麻酔をかけます。
4. 25 μLの滅菌気密性ハミルトンシリンジを使用して、15 μLのAAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40(Addgene)を腹腔内に注入します。

2.三叉神経節曝露手術

1. 麻酔カクテル(55 mg / kgケタミン、5.5 mg / kgキシラジン、1 mg / kgアセプロマジン)を6〜8週齢のラット(約150〜200 g)に体重に基づいて腹腔内に投与します。.
   注:これは通常、後足の有害なつまみに対する離脱反射の欠如によって評価されるように、麻酔の外科的平面を維持するのに十分です。.ただし、動物が軽くなった場合は、鼻錐形を介してイソフルランを補給します。
2. 完全に麻酔をかけたら、頭と顔の髪とひげを剃ります。
3. ラットをイヤーバー付きの脳定位固定装置フレームに取り付け、その下に加熱パッド(~37 ^°C)を置いて体温を維持します。
4. バイタルサイン(心拍数、呼吸数、血中酸素飽和度)をマウスオキシメーターまたは同等のもので監視します。
   注:体温は直腸プローブによって監視され、フィードバック制御された循環水毛布の上にラットを置くことによって維持されます。
5. 氷冷した生理食塩水に浸したガーゼを頭に当てて血管を収縮させ、出血を最小限に抑えます。サイズ15のメスを使用して、頭蓋骨の上の皮膚と筋肉の正中線を切開します。
6. 皮膚と筋肉を鈍く解剖して頭蓋骨を露出させます。
7. 1/4ラウンドのドリルビットを使用して、頭蓋骨キャップに慎重に穴を開けて前脳を露出させます。次に、ロンゲール(2.5mmカップ)を使用して、頭蓋骨を慎重に切ります。
8. サイズ15のメスを使用して、脳(ブレグマ:-3.80)と嗅球を切開します。
   注:このポイントを超えて尾側を切ると、ラットが死にます
9. スパチュラを使用して硬膜を頭蓋骨から慎重に外し、切断された脳をそっと持ち上げてTGと頭蓋骨の底を明らかにします。
   注:抽出全体で氷冷生理食塩水灌流を追加で使用すると、出血が最小限に抑えられ、次の解剖野が最適化されます。
10. 焼灼ペンを使用して、抜歯による出血を食い止めます。
    注意: 硬膜を切断すると、必然的に出血します。頭蓋腔を浸して、神経細胞の健康を維持しながら血管を収縮させるために、氷冷したaCSF(119 mM NaCl、26.2 mM NaHCO₃、2.5 mM KCl、1 mM NaH₂PO₄、1.3 mM MgCl₂、10 mMグルコース、2.5 mM CaCl₂)を調製するのが最善です。

3. GCaMP6sイメージング

注:これらのニューロンのサイズと密度を考えると、使用されるイメージングおよびデータ収集システム(対物レンズ、顕微鏡、光源、カメラ)によって、視覚化されるGECI⁺ 細胞の数が決まります。光源、対物レンズ、カメラは、露光時間や画像キャプチャレートなど、画像取得に使用されるパラメータも決定します。実験のパラメータによっては多光子法や共焦点法を使用できますが、落射蛍光顕微鏡法で多くの細胞を分離できる場合があります。任意の画像取得パッケージを使用できます。理想的には、刺激アプリケーションは画像取得ソフトウェアパッケージでタイムロックされます。

1. 頭蓋骨腔を対物レンズの下に置き、可視光を使用してTGに焦点を合わせます。
2. GCaMP6sの励起波長は496nm、発光波長は513nmです。したがって、適切なダイクロイックキューブとフィルターキューブを使用して、GCaMP⁺ 細胞を特定します。焦点を調整して、ニューロンが関心のある受容野に加えられた刺激に反応している神経節の領域を見つけて解決します。
3. 10倍の対物レンズを使用して、顔の^1cm2 領域に印加された機械的刺激に応答するTG内のほとんどのニューロンの可視化を可能にする¹⁶。分解能を上げるには、作動距離が長い(10.8 mm)20倍の乾式対物レンズを使用してください。
4. 取得ソフトウェア(Metamorphなど)を使用して、経時的に、および刺激の適用に応答して蛍光データを収集します。
   1. ニューロンの光退色を最小限に抑えるには、できるだけ短い露光時間を使用して、ベースラインおよび誘発された蛍光の増加を検出します。本研究で使用した20倍、0.40NAの空気対物レンズ、120Wのハロゲン化水銀光源、および相補型金属酸化膜半導体(CMOS)カメラを使用して、露光時間300ms、画像取得速度3Hzで、>90分間安定したベースライン記録を取得します。
      注:1)これらの画像取得パラメータは、経験的に決定する必要があります。2)機械的(ブラシ、点状、振動、ピンチ)、熱的(熱と冷)、および化学的(カプサイシン、メントール、炎症性メディエーター)を受容野に適用できます。比較的安価な主観的アプローチは、手で刺激を加えることです。ただし、フィードバック制御アクチュエータを使用して既知の力で繰り返し適用できる、より客観的で再現性の高いアプローチが推奨されます。フィードバック制御のペルチェ素子は、制御された加熱と冷却には便利ですが、曲面の熱刺激には理想的ではありません。フィードバック制御の赤外線光源は加熱の代替手段であり、コールドスプレーは冷却の代替手段として理想的とは言えません。

我々は以前、ラットの感覚ニューロンの感染に対するAAV9血清型15で成功を収めていたため、この血清型をラットTGニューロンにおけるGCaMP6の発現に用いた。そこで我々はまず、AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40(AAV9-GCaMP)を仔ラット新生仔に投与した場合の感覚ニューロン感染効率を評価しようとした20。このウイルスは、高レベルの遺伝子発現を駆動および維持するCAGプロモーターを利用しています。さらに、AAV9は、新生仔ラットに投与すると、感覚ニューロンに効率的に感染することが示されている33。最初の注射では、生後5日目(p5)の仔に5 μLを使用し、約51.66%±14.33%の効率が得られました(図1A)。感染率を上げるために、最終的に若いラット(p2)に大量のウイルス(15μL)を使用し、ウイルス力価を2.4×1014 に維持しました。この戦略により、91.84%±3.18%(n = 8)のニューロンが感染しました(図1B)。

振動パッドを神経支配するTGニューロンを可視化するために、次にTGを生体内で露出させる外科的戦略を開発しました。前脳の約60%は、主要な呼吸中枢に影響を与えることなく除去できます。これはブレグマ-3.80の吻側脳組織に相当します。露出したTG(左)と眼窩下神経の神経支配領域(ION、右)の概略図を図2に示します。振動パッドの神経支配を引き起こすTGの領域は、20倍の蛍光の変化を監視しながら、振動パッドに軽い機械的刺激(ブラシ)を当てて決定しました。予測されたように、顔の上顎分裂を神経支配するTGのV2領域が活性化された唯一の領域でした。すなわち、系統的には研究されていないが、V1(額の皮膚)またはV3(下顎骨の皮膚)領域に加えられた刺激に反応して、研究対象のニューロンを振動パッドに刺激を加えることで活性化できるときに、蛍光の変化は検出されなかった。次に、ベースラインでの蛍光の変化と、振動パッドに加えられた刺激に反応した蛍光の変化をモニターしました。関心領域(V2)は、図3Aで区切られています。感覚ニューロンの安静時活性が比較的低いという以前の報告と一致して34、安静時蛍光はほとんどのニューロンで比較的低く、蛍光の自発的な増加の証拠はほとんどありませんでした(図3B)。末梢6,16,21およびCNS12,35,36のニューロンにおける刺激誘発活動を特定するために使用される基準は、自由に利用できるようにされたいくつかの洗練されたワークフローパッケージ37,38を備えた進化する分野です。採用されたさまざまなアプローチの長所と短所の完全な議論は、この原稿の範囲を超えています。これは本研究の焦点ではなかったため、神経節のはっきりと検出可能なニューロンがない領域で観察されたピーク応答(核を見る能力に基づく)に基づいて、比較的恣意的で主観的な基準を使用し、蛍光の増加が刺激の適用に時間ロックされている場合(刺激の適用から1秒以内に検出された蛍光の増加(刺激の適用から1秒以内に検出された蛍光の増加(細胞体から3cm以内の部位で開始された最も伝導の遅い軸索(0.2 m/s)で開始された活動電位は、1秒未満で細胞体に到達するはずであるという仮定に基づく)で、ピーク応答の標準偏差(ΔF/F)の>6倍であったコントロール部位を検出しました(図3C)。次に、これらのニューロンの自然刺激に対する応答特性(ブラシ、点状、熱、冷気)を特徴付けました。これらの各刺激に対する応答の例を図4に示します。特に、疼痛関連の研究で最も頻繁に使用される点状刺激に対する反応は、最も頑健な反応を示します(図4B、F)。

この技術の開発における私たちの目標は、TGニューロンの集団コーディングの変化を評価できるようにすることでした。そこで、以前29で採用した慢性狭窄傷害を、神経損傷の2週間後のラットの研究に適合させた。モデルの導入後、TGを曝露し、損傷部位の同側および反対側のTGにおける安静時および誘発活動を評価しました。興味深いことに、ブラシに対する誘発反応のピークの大きさは、反対側に加えられた同じ刺激に対するピーク応答と比較して、神経損傷側で~2倍増加しました(図5A-C)。さらに、2つのブラシ刺激を直列に(刺激間間隔10秒で)加えると、2番目の刺激に対する反応の大きさが、傷ついた側で有意に増幅されたが、傷ついていない側では見られた(図5D)。

最後に、刺激誘発による蛍光の増加が末梢で開始される活動電位によるものであることを確認するための初期対照実験として、刺激誘発応答に対するテトロドトキシン(1μM)の影響を評価しました。TTXは、眼窩下神経を標的とするように、前述したように200μLの容量を経皮的に注入した28 。 図6に示すように、誘発された活動はほぼ完全に排除されました。まとめると、これらの結果は、AAV9-GCaMPを使用してTG集団応答を in vivoで調べることの有用性を示しています。

図1:新生児AAV注射によるTGニューロンにおけるGCaMP6s感染の高効率。 (A)P5ラットの仔に5μLのpAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40(力価:2.4×1014)ウイルスを腹腔内に注射した。 GCaMP6sの発現は、TGニューロンの51.7%±14.3%(n = 1匹あたり3スライス、ラット7匹)で検出された。(B)若齢動物(p2)の注入量を15μLに増やすと、感染効率が向上し、TGニューロンの91.8%±3.2%でGCaMP6sの発現が検出されました(n=1匹あたり3スライス、ラット8匹)。左のパネルはGCaMP6用に染色しました。中央のパネルは、ニューロン特異的マーカーであるNeuNで染色しました。右のパネルは、GCaMP6sとNeuNのパネルを合成したものです。最初のパネルの縮尺記号は、後続のすべてのパネルで同じです。右のグラフは、GCaMP6sの発現量(SEM±平均)を、動物1匹あたりのスライスあたりのニューロンの総数に対する割合でプロットしたもので、個々の点は各動物のデータです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:三叉神経節(TG)、眼窩下神経(ION)、顔面領域(振動パッド)が刺激された位置。 (A)前脳を切除し、TGにアクセスできるようにした。(B)IONおよびTGに対して自然刺激が加えられた顔の領域。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:刺激誘発によるGCaMP6s蛍光の増加。 (A)20倍の倍率での全視野。TGの眼科(V1)および上顎(V2)部門が示されます。(B、C)ボックス内の領域はパネル B と Cに示されており、これらはそれぞれ振動パッドのブラシ刺激前とブラシ刺激後の蛍光画像です。白い円はコンパレータの関心領域です。ニューロンは、本文に記載されているように、コンパレータの関心領域で観察された蛍光のピーク変化に基づいて、刺激に応答すると考えられました。最初のパネルの縮尺記号は、両方のパネルで同じです。(D)顔面にブラシ刺激を与えた神経細胞の蛍光の代表的な変化をBとCに示す。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:顔面に加えられた刺激に対するニューロンの反応に基づくニューロンの分類。顔の同じ領域に適用された1cmのラクダ毛ブラシ(A-ブラシ)、1cm2グリッドのモノフィラメント(B-点状)、加熱(C-熱)および冷却(D-コールド)に対する反応の前(上パネル-ベースライン)および後(中央パネル-刺激)のTGニューロンの代表的な画像。最初のパネルの縮尺記号は、後続のすべてのパネルで同じです。オレンジ色の円は、応答性ニューロンの例を示しています。白い円はコンパレータの関心領域です。(E-H)刺激ごとの各応答の代表的なトレース。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:神経損傷はTGニューロンのブラシ誘発反応を増加させる。 眼窩下神経の慢性狭窄損傷(A、Contra)または神経損傷の同側(B、Ipsi)の反対側のラットの顔に2回適用されたブラシに対するTGニューロンの典型的な反応。(C)6匹のラットの応答性ニューロンからプールされたデータ(プロットされたデータはラットあたり)の解析により、ブラシに対する最初の応答の大きさの差が有意であることが確認されました(対応のあるt検定)。(D)1回目と2回目の刺激に対するピーク応答を比(R2/R1)として解析したところ、統合したデータを解析したところ、神経損傷側の反応比の増加が有意であることが確認された。** p < 0.01 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:テトロドトキシン(TTX)によるTGニューロンの誘発活動のブロック。(A)眼窩下神経に隣接するTTX(200μL、1μM)をブラシ刺激(青色の棒)を注入した後の神経損傷と同側のTGニューロンからの蛍光データ。(B)3匹のラットのピークレスポンスデータをプールした。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

ゴールド博士は、この製剤の開発中にグリューネンタールから助成金を受けていました。グリューネンタール研究の焦点と、この原稿で記述されている準備に重複はありませんでした。他の著者のいずれも、開示すべき他の潜在的な利益相反はありません。