方法論記事

マウス海馬と前頭前野における二重細胞外記録

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DOI：

10.3791/66003

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2024年2月16日

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1Neural Dynamics Laboratory, Department of Medicine, The University of Melbourne, 2Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Melbourne

この記事について

サマリー

このプロトコルは、局所電界電位を記録し、マウス海馬および前頭前野における情報の流れを調査するためのカスタム設計の記録装置および電極の使用を概説する。

要約

局所電位(LFP)を記録する技術は、局所的なニューロン集団の電気的活動を測定するために使用される電気生理学的方法です。これは、特に海馬や前頭前野などの脳領域における認知研究において重要なツールとして機能します。これらの領域間のデュアルLFP記録は、地域間信号通信の調査を可能にするため、特に興味深いものです。しかし、これらの記録を行う方法はめったに記載されておらず、ほとんどの市販の記録装置は高価であるか、特定の実験計画に対応するための適応性に欠けています。この研究は、マウス海馬と前頭前野で二重電極LFP記録を実行するための包括的なプロトコルを提示し、これらの領域のLFP特性に対する抗精神病薬とカリウムチャネルモジュレーターの効果を調査します。この技術により、各脳領域内のパワースペクトルや2つの領域間のコヒーレンスなど、LFP特性の測定が可能になります。さらに、これらの実験のために、低コストのカスタム設計の記録装置が開発されました。要約すると、このプロトコルは、異なる脳領域において高い信号対雑音比を有する信号を記録する手段を提供し、脳内の地域間情報通信の調査を容易にする。

概要

局所電界電位(LFP)は、細胞外空間から記録された電気的活動を指し、局所的なニューロン群の集合的な活動を反映しています。それらは、1Hzの低速波から100Hzまたは200Hzの高速振動まで、さまざまな周波数範囲を示し、特定の周波数帯域は、学習、記憶、意思決定などの認知機能に関連しています1,2。LFP特性の変化は、認知症や統合失調症などのさまざまな神経疾患のバイオマーカーとして使用されています3,4。LFP記録を分析することで、これらの状態に関連する根本的な病理学的メカニズムと潜在的な治療戦略に関する貴重な洞察を得ることができます。

デュアルLFP記録は、2つの特定の脳領域内および2つの特定の脳領域間の局所的な電気的活動を測定するために使用される技術です。この手法は、異なる脳領域内および異なる脳領域間で発生する複雑な神経ダイナミクスと信号伝達を調査する貴重な機会を提供します。以前の研究では、個々の脳領域のニューロン特性の変化を検出することは複雑である可能性があることが明らかになりましたが、領域間皮質コミュニケーションの変化は観察できます5,6。したがって、デュアルLFP記録の利用は、この問題に対処するための強力な手段を提供します。

海馬と前頭前野の接続性は、認知機能の調節に重要な役割を果たしており、機能障害はさまざまな神経障害と関連しています7,8。これらの領域の二重電極記録は、これらの相互作用に関する情報を提供することができます。残念ながら、これらの領域間で二重電極LFP記録を実行する方法に関する利用可能な情報は限られています。さらに、市販の記録装置は一般的に高価であり、特定の実験計画への適応性に欠けています。従来のLFPの記録方法は、動物の脳に埋め込まれた電極にシールドケーブルを使用して記録装置を接続するというものでした。ただし、このアプローチはモーションアーチファクトや環境ノイズの影響を受けやすく、記録された信号の品質と信頼性に影響を与えます。

このプロトコルは、動物の頭に配置できる低コストのカスタム設計のヘッドステージを使用して、マウスの海馬および前頭前野で二重電極LFP記録を実行するための包括的な手順を記述します。これらの方法により、研究者は2つの別々の脳領域内の領域固有の振動パターンを調査し、これらの領域間の領域間の情報交換と接続性を探ることができます。

プロトコル

この研究は、科学的目的での動物の世話と使用に関するオーストラリアのコードに従って、フローリー動物倫理委員会(メルボルン大学、No.22-025UM)によって承認されました。本研究では、動物資源センター(オーストラリア)から入手したC57BL/6雄マウス(8週間)を使用しました。

1.ヘッドステージの設計と製造

注:ヘッドステージPCBボードは、動物の頭に直接配置するように設計されたコンパクトな14 mm x 12 mmの4層ボードです。市販のアンプチップ( 資料表を参照)を利用しており、すべての設計ファイルとガーバーファイルはオンラインで入手できます(GitHubリンク:https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway)。

  1. 次の仕様をメーカーに提供します:ボードの厚さ:0.6 mm;最小トラッキング/間隔:4ミル;最小穴サイズ:0.2mm。
  2. PCBアセンブリプロセス中は、次の順序に従います。
    1. 350°Cに設定された熱風ガンを使用して、アンプチップをボードにはんだ付けします。
    2. 受動部品をはんだ付けします。
    3. SPIコネクタと電極コネクタをはんだ付けします( 材料の表を参照)。
  3. 品質保証のために顕微鏡ではんだ付けを検査します。安定性を高めるために、エポキシを使用してSPIコネクタを所定の位置に固定します。
  4. 信号集録には、他社製の記録ソフトウェアと制御ボード( 「材料の表」を参照)を使用します。詳細な手順については、ソフトウェアのユーザーガイドを参照してください。
  5. 設計されたヘッドステージは8チャンネルをサポートします。ソフトウェアで、チャンネル8、9、12、13、20、21、22、および23を録音用に有効にします。

2. 電極の作製

  1. PFA被覆タングステン線( 材料表を参照)を、前頭前野電極(12 mm)、海馬電極(10 mm)、および接地電極(6 mm)など、さまざまな電極タイプに対して特定の長さに切断します。
  2. 真鍮管( 材料の表を参照)を3mmのセグメントに切断します。
  3. ライターを使用して各ワイヤの端にあるコーティングの2 mmを取り除き、電極ワイヤを真鍮管にしっかりとはんだ付けします。真鍮管の内径は0.45mm、外径は0.60mmです。
  4. 接地電極の場合は、M1.2ステンレス鋼ネジ( 材料の表を参照)を電極にはんだ付けします。リン酸系フラックスをねじに塗布し、はんだ付けを強化します。はんだ付け後、アルコールを使用してネジを清掃します。
    注意: はんだ付けプロセス中の保護のために手袋を着用してください。

3.外科的処置

  1. 3%イソフルランと1 L / minの酸素流量を備えた麻酔室でマウスを麻酔します。
  2. 麻酔をかけたマウスを加熱パッドの上に置き、固定装置フレームに固定します( 材料の表を参照)。
  3. イソフルランの維持率を2.5〜3%に調整し、酸素流量を500mL / minに減らします。つま先のつま先を使用して、動物がまだ深い麻酔下にあるかどうかを確認します。
  4. カルプロフェンを0.5 mg / kgで皮下注射し、目の軟膏を塗布して目を保護します。.
  5. ポビドンヨードと80%エタノールを使用してマウスの頭を剃り、滅菌します。
  6. 頭皮の正中線に沿って8mmの切開を行い、切開部の結合組織を除去します。
  7. 過酸化水素を塗布して頭蓋骨の表面をきれいにし、周囲の皮膚に触れないように注意してください。
  8. 正確な電極配置のために、ブレグマとラムダのランドマークを同じレベルに合わせます(ブレグマとラムダは、矢状縫合糸が冠状縫合糸とラムドイド縫合糸と交差する場所です)。
  9. 基準電極/接地電極、アンカーネジ(0.9mmドリルバリ)、アクティブ電極(0.3mmドリルバリ)用の穴を指定座標にドリル穴を開けます。
  10. カスタムメイドの電極(ステップ2)を脳定位固定装置フレームアームに取り付け、脳に対して垂直であることを確認します。
  11. 海馬CA1領域(AP-1.8 mm、ML-1.3 mm、DV-1.4 mm)に電極を埋め込みます。
    注:AP、前後;ML、中外側;DV、背腹側。
  12. 前頭前野への電極移植を繰り返す(AP-2.0mm、ML-0.3mm、DV-1.7mm)。
  13. 市販の強力な接着剤と歯科用セメントで電極を固定します( 材料の表を参照)。
  14. 1.2mmのアンカーネジを2本(AP-1.8mm、ML-1.6mm)を埋め込み、動きを防ぎます。
  15. 基準/接地電極を硬膜に直接接触させ、ラムダランドマークの後方2 mmと片側2 mmに配置します。
  16. 電極の真鍮管側をマルチチャンネルソケットコネクタ( 材料の表を参照)に接続し、接地電極を中央に置きます。
  17. 分離のために、ミドルピンの外側に0.8mmの熱収縮チューブを使用します。
  18. 電極、アンカーネジ、コネクタを接着剤と歯科用セメントで固定します。

4.術後ケア

  1. 術後の痛みを軽減するために、3日間の痛みの評価に基づいて、12〜24時間ごとに5〜10 mg / kgの用量でカルプロフェンを皮下注射します。.
  2. 記録または実験手順を開始する前に、動物に1週間の回復期間を与えてください。

5. 記録手順

  1. 動物を15分間、1日2回、3日間連続して取り扱います。
  2. マウスに過度の圧力をかけずに、マウスの周りの手をそっと閉じて、マウスを持ち上げます。
  3. ヘッドステージボードを動物の頭に30分間、1日1回、3日間連続して置きます。
  4. 録音当日は、動物を録音室に30分間順応させます。
  5. 動物をファラデーケージ内の小さな記録室に入れて、外部からの電気的干渉を減らします。録音用のカスタムヘッドステージを取り付けます。
  6. 録音ソフトウェアを開き、2.00kHzのサンプリングレートを選択します。13 と 20 以外のすべてのチャンネルを無効にするには、各チャンネルを選択して スペースバーを押します。
  7. ハードウェア帯域幅ウィンドウで、下限帯域幅を 2 Hz に、上限帯域幅を 100 Hz に設定します。
  8. ソフトウェア フィルタリング ウィンドウで、ローパス フィルターを 100 Hz に、ハイパス フィルターを 2 Hz に調整します。
  9. [ファイル名の選択] をクリックして保存パスを選択し、[レコード] をクリックします。
  10. 各記録セッションを 10 分間の慣れ期間で開始し、その後 15 分間のベースライン EEG 記録を行います。
  11. ベースライン記録後、腹腔内注射 で 薬物を投与し、遅滞なくさらに30分間記録を続けます。.
    注:使用した薬物の詳細については、結果のセクションを参照してください。

結果

ここに示す結果は、C57BL/6雄マウスの4つのコホート(各コホートでn = 8、年齢:8週、体重:24.0 ± 0.42g)でテストされた局所電界電位(LFP)特性に対するいくつかの薬物の効果を示しています。試験された薬物には、抗精神病薬のクロザピン、カリウムチャネルモジュレーターの4-アミノピリジン(4-AP)、レチガビン、および対照ビヒクル生理食塩水が含まれていました。

図1に示すように、マウスを小さな記録室に入れ、カスタム設計のヘッドステージを使用して海馬(HIP)と前頭前皮質(PFC)からLFPを採取しました。この研究は主にシータ周波数帯域とガンマ周波数帯域の調査に焦点を合わせていたため、記録された信号は最初に2〜100Hzの周波数範囲内で最初のバンドパスフィルタリングを受け、次に2000Hzでサンプリングされました。その後、信号はいくつかの2秒エポックに分割されました。顕著なモーションアーチファクトを示すエポックが特定され、その後、後続の分析プロセスから除外されました。HIPとPFCの両方におけるLFPのパワースペクトルとHIP-PFCコヒーレンスは、マルチテーパーベースの分析法9を使用して測定されました。分析では、5つのスレピアンテーパーを使用し、時間帯域幅を3に設定して、最適なスペクトル濃度を達成しました。1秒のスライディングウィンドウと100ミリ秒のステップサイズを使用して、時間-周波数スペクトログラムとHIP-PFCコヒーレンスの時間経過を生成しました。

図2および図3に示すように、生理食塩水の投与は、HIPおよびPFCにおけるLFPのパワースペクトル、またはHIP-PFCコヒーレンスに識別可能な影響をもたらさなかった。レチガビンとクロザピンの両方が、HIPとPFCのガンマバンド(30〜100 Hz)パワー、およびガンマバンドHIP-PFCコヒーレンスの明らかな減少を示しました。対照的に、4-APは、HIPとPFCの間のガンマバンドパワーの増加と、HIPとPFCの間のガンマバンド内のコヒーレンスの増加を特徴とする逆の効果を示しました。

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図1:実験装置の概略図。 電極は、局所電界電位を記録するために海馬(HIP)と前頭前野(PFC)に埋め込まれました。動物は小さな記録室に入れられ、カスタム設計のヘッドステージが電極コネクタに取り付けられました。各記録セッションは、10分間のベースラインセッションで始まり、その後30分間の薬物セッションが続きました。生理食塩水、クロザピン、4-AP、およびレチガビンの効果を試験した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図2:海馬(HIP)および前頭前野(PFC)で進行中の電気生理学的活動に対する抗精神病薬およびカリウムチャネルモジュレーターの影響。 HIPおよびPFCの局所電界電位の正規化されたスペクトログラムは、HIP-PFCコヒーレンスとともに、研究されたすべての薬物について時間依存的な効果を示しました。薬物は、時間t = 15分に腹腔内注射 を介して 投与 されました。

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図3:抗精神病薬とカリウムチャネルモジュレーターがHIPとPFCのパワースペクトル密度に及ぼす影響4-AP は、両方の脳領域でガンマバンドパワーを有意に増加させましたが、クロザピンとレチガビンは両方の領域でガンマバンドパワーを抑制しました。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、海馬(HIP)と前頭前野(PFC)の二重局所電界電位(LFP)を同時に記録するために特別に設計されたカスタマイズされたヘッドステージを構築するための手順を概説しています。このプロトコルで提供される詳細な手順は、研究者が各領域内およびHIPとPFC間の信号通信を徹底的に調べるのに十分な情報を提供します。

カスタム設計のヘッドステージは、市販のアンプチップを利用しています。現在の構成では8チャンネルの記録をサポートしていますが、ヘッドステージは32チャンネルの容量全体に対応するように簡単に調整できるため、電極アレイの記録に適したチャネル容量を拡張できる可能性があります。ヘッドステージのコストが低いことを考えると、1つのオプションは、ボードを動物の頭に恒久的に貼り付けることです。このアプローチには、モーション アーティファクトを最小限に抑え、動きによって引き起こされる外乱の全体的なレベルを低減できるという利点があります。

カスタムメイドの電極は、LFPの安定した長期記録を示し、3〜5か月にわたって良好な信号品質を維持します。別の実行可能なアプローチは、電極アレイ10、11としてポリイミドベースのフレキシブル回路基板を採用することを含む。これらのフレキシブル回路基板は、記録ヘッドステージと統合して、マルチチャンネル記録を可能にします。この方法は、電極の調製と外科的処置を簡素化するという利点を提供します。ヘッドステージの有無にかかわらず、インプラントの重量はそれぞれ0.198gと0.812gと非常に軽く、非常に若いマウスに適しています。

電流記録技術の1つの制限は、吊り下げケーブルによって引き起こされる潜在的な干渉であり、実験中の動物の自然な行動を妨げる可能性があります。この問題に対処するために、データストレージにSDカードを利用したり、ワイヤレス信号トランスミッタモジュールを実装したりするなどの代替ソリューションを検討できます。

プロトコルの重要かつ重要なステップは、電極の正確な位置決めです。実験間での比較を可能にするために、正確で一貫した電極配置を確保することが重要です。電極の位置を確認するには、組織学を実施する必要があります12。HPCでの適切な電極配置を強化するための有用な手法は、強いシータリズムとニューロンの発火が正しい配置を示すため、電極が垂直に挿入されている間に記録することです。8週齢以上の成体マウスは、時間の経過とともに信号の質が低下したり、マウスの加齢に伴って誤った配置になったりする可能性があるため、利用することをお勧めします。これらの考慮事項を考慮すると、実験結果の信頼性と妥当性を維持するのに役立ちます。

結論として、この記事で紹介するプロトコルは、異なる脳領域間の信号伝達を研究するためのフレームワークを提供します。これにより、研究者はこれらの領域内および領域間のニューロンのダイナミクスと相互作用を調査できます。

開示事項

著者らは何も開示していない。

謝辞

この研究は、ロイヤルメルボルン病院神経科学財団(A2087)の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
真鍮管 Albion Alloys、米国内径0.45mm
の炭化 リマジル、ファイザーアニマルヘルス 
商用アンプチップIntantechRHD 2132
制御盤IntantechRHD 録音システム
歯科用セメント パラドゥール
ヒートシュリンクパンドウィット0.8mmM1.2
ステンレス鋼ネジウォッチツール時計とウォッチネジ
マルチチャネルソケットコネクタ Harwin、AU1.27 mmピッチ、PCBソケット
PFAコーティングタングステン線 AMシステムズ、米国径150&マイクロ;m 
リン酸系フラックスチップクイックCQ4LF-0.5
録音ソフトIntantechRHX 録音ソフト
定位フレームワールド精密機器マウス定位測定器
スーパーグルーUHU超高速
直径内

参考文献

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LFP

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