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方法論記事

Ex Vivo Live Imagingを用いたマウス歯の再生中の細胞分裂と動きの調査

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DOI:

10.3791/66020

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2023年10月27日

 ,  ,  ,  , 
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

Ex vivo ライブイメージングは、生体組織における細胞の動きや相互作用のダイナミックなプロセスを研究するための強力な技術です。ここでは、培養された成体マウス切歯全体の歯上皮細胞をライブトラッキングするために2光子顕微鏡法を実装するプロトコルを紹介します。

要約

成長を続けるマウス切歯は、成体上皮幹細胞や間葉系幹細胞の調節や歯の再生を研究するための扱いやすいモデル系として注目されています。これらの前駆細胞集団は、組織の恒常性を維持し、失われた細胞を応答的に再生するために、活発に分裂、移動、分化します。しかし、固定された組織切片を用いた従来の解析では、細胞の動きや相互作用のダイナミックなプロセスを捉えることができず、その制御を研究する能力が制限されていました。この論文では、外植片培養システムでマウス切歯全体を維持し、多光子タイムラプス顕微鏡を使用して歯上皮細胞をライブトラックするプロトコルについて説明します。この技術は、歯科研究のための既存のツールボックスに追加され、研究者が生体組織内の細胞の挙動と組織に関する時空間情報を取得することを可能にします。この方法論は、研究者が歯の再生と再生の両方で起こる動的な細胞プロセスを制御するメカニズムをさらに探求するのに役立つと期待しています。

概要

過去20年間で、マウス切歯は成体幹細胞の調節と歯の再生の原理を研究するための非常に貴重なプラットフォームとして浮上してきました1,2。マウス切歯は継続的に成長し、動物の生涯を通じて再生します。これは、上皮幹細胞と間葉系幹細胞の両方を維持することによって行われ、自己複製して歯のさまざまな細胞型に分化することができます1,2。歯の上皮幹細胞はエナメル質マトリックスを分泌する髄芽細胞を生じさせるのに対し、歯の間葉系幹細胞は歯芽細胞、セメント芽細胞、線維芽細胞を生じさせ、それぞれ象牙質、セメント質、歯根膜を形成します3,4,5,6。この新しい細胞の絶え間ない供給は、組織の恒常性を維持し、咀嚼の摩耗や損傷のために失われた古い細胞の交換を可能にします7,8。したがって、歯科幹細胞の維持と分化を調節する細胞および分子メカニズムの解明は、関心が高まっている分野である歯の再生を理解する上で中心的な役割を果たします。

解剖学的には、成体マウス切歯の大部分は顎骨に包まれています。歯の切歯縁が露出している間、切歯の頂端はソケット内に収まり、歯根膜と結合組織を介して周囲の骨にしっかりと取り付けられています(図1A、B)。切歯の頂端は歯の成長領域でもあり、上皮層と間葉系歯髄の両方で歯の幹細胞と前駆細胞を維持しています9,10,11,12,13。具体的には、歯の上皮幹細胞は、頂端芽として知られる上皮の球状端(唇頸管ループとも呼ばれる)に維持されています(図1C)。腸上皮や表皮と同様に、切歯の上皮再生は、主に活発に循環する幹細胞と、頸管ループの内側に存在する移行増幅細胞14、15、16、17と呼ばれるその高度に増殖する中間子孫によって支えられています。しかし、切歯上皮が再生中に静止幹細胞を含み、利用するかどうかは、まだ決定されていない。対照的に、根尖歯髄では活性型と静止期の歯間葉系幹細胞の両方が同定されており、静止幹細胞は損傷修復中に活性化される予備集団として機能する13,18。

マウス切歯の再生と再生の生物学に関する発見の多くは、組織学的調査の結果であり、サンプルは明確な時間的分岐点で採取され、固定され、処理され、特定の平面に沿ってミクロン単位の薄切りに切断されます。系統追跡や遺伝的摂動を可能にするさまざまなマウスモデルの組織学的切片の詳細な分析を通じて、科学者たちは、さまざまな前駆細胞集団の細胞系統、ならびに切歯の恒常性と損傷の修復を制御する遺伝的およびシグナル伝達経路を特定しました19,20,21.しかし、切片内の非生命細胞の静的な2次元(2D)画像では、細胞の形状変化、動き、細胞動態など、生体組織における細胞の挙動や空間的組織の全範囲を捉えることはできません。組織切片では解決できない時間スケールで発生するこれらの急速な細胞変化を検出および測定するには、別の戦略が必要です。さらに、このような情報を取得することは、歯の細胞がどのように相互作用し、さまざまなシグナル刺激に反応し、組織の構造と機能を維持するために自己組織化するかを理解する上でも重要です。

2光子顕微鏡を用いた4次元(4D)深部組織イメージングの出現22は、3つの空間次元と時間分解能を統合した技術であり、培養組織の外植片、オルガノイド、さらには組織をその場で時空間的に検査することを可能にし、組織学的分析の固有の限界を克服しました23,24,25,26 .例えば、発生中の歯上皮の4Dライブイメージングは、組織の成長、シグナル伝達中心の形成、および歯の上皮形態形成を調整する細胞分裂と移動の時空間パターンを明らかにしました27,28,29,30,31,32.成体マウス切歯では、最近、4Dイメージングが、歯の上皮損傷修復中の細胞挙動を研究するために適応されています。ライブイメージングにより、基底層の層中間細胞が基底層の髄芽細胞に直接変換され、損傷した上皮を再生できることが明らかになり、上皮損傷修復の従来のパラダイムに挑戦します15。

ここでは、口唇頸管ループの上皮細胞に着目して、成体マウス切歯の解剖、培養、イメージングについて述べる(図1)。この技術により、歯細胞の活力を12時間以上維持し、蛍光標識された細胞を単一細胞の分解能でライブトラッキングすることができます。このアプローチにより、通常の培養条件下、または遺伝的、物理的、化学的摂動に対する応答における細胞の動きと移動、および細胞の形状と分裂配向の動的な変化を調べることができます。

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プロトコル

すべてのマウスは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)またはエルサレムヘブライ大学(HUJI)の病原体のない動物施設で飼育されました。マウスを用いたすべての実験は、それぞれの動物管理委員会(IACUC)によって承認された規制およびプロトコルに従って実施されました(ARC-2019-013;UCLA)または(MD-23-17184-3;HUJI)です。実験ステップの一般的なワークフローを 図2Aに示します。このプロトコルで使用されるすべての機器、試薬、および材料に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 溶液およびゲルの調製

  1. 解剖培地:0.5%グルコースで新鮮なDMEM/F12を調製し、ステップ2.4で必要になるまで37°Cで保温します。
    注:フェノールレッドを含まないDMEM/F12を使用して、ライブイメージング中の自家蛍光を低減します。
  2. 培地 1x:50% DMEM/F12、ラット血清 50%、グルタミン代替物 1x 、MEM 非必須アミノ酸 1x MEM、グルコース 1%、L-アスコルビン酸 0.1 mg/mL L-アスコルビン酸、ペニシリン-ストレプトマイシン 0.5% を使用して、新鮮な培地を調製します。ステップ5.5で必要になるまで、37°Cで保温します。この培地は、ライブイメージング中の切歯外植片の培養に使用されます。
    注:ラット血清は高品質で、研究者または市販の供給源から組織全体を培養するために特別に調製されている必要があります。特に、血液凝固が形成される前に、血液を遠心分離(室温で1,200 × g で5分間)する必要があります。遠心分離後、得られたフィブリン血栓は圧搾して廃棄すべきである33。
  3. 培養ゲル:ゲルの目的は、イメージング中にサンプルを固定化することであり、新鮮に調製されます。
    1. 200 mgの低融点アガロースを10 mLのDMEM/F12にマイクロ波で溶解し、DMEM/F12で2%ゲルを作製します。2%ゲルを37°Cに保ちます。
    2. 50%ラット血清、1xグルタミン代替品、1x MEM非必須アミノ酸、1%グルコース、0.1 mg/mL L-アスコルビン酸、および0.5%ペニシリン-ストレプトマイシンを混合して、2x培地(DMEM/F12なし)を作成します。2倍培地(DMEM/F12なし)を37°Cに温めます。
    3. 等量の2%ゲルと2倍培地(DMEM/F12なし)を混合して、1%培養ゲルを作製します。ステップ5.1で必要になるまで、1%培養ゲルを37°Cに保ちます。
      注意: ゲル化を防ぐために、混合する前にすべての溶液が温かいことを確認してください。1%ゲルは成体マウス切歯の培養に適していることがわかりました。ゲル化率は、他の組織を培養する場合は経験的に決定する必要があります。

2. 成体マウス下顎骨の摘出

  1. IACUCによって承認された標準的な手順を使用して、希望の年齢でマウスを安楽死させます。
    注:ここでは、CO2窒息とそれに続く子宮頸部脱臼を使用します。動物の安楽死に関する規制は、地域によって異なる場合があります。研究者は、実験を行う前に必要な機関の承認を取得し、地域の動物管理規制を確実に遵守する必要があります。
  2. 70%エタノールを使用してマウスを消毒します。
  3. マウスの首を切り落とし、左右の下顎骨を摘出します。
    1. マウスをお腹の上に置き、#9シングルエッジの工業用カミソリの刃を使用して首の部分を切り取り、マウスの頭を体の他の部分から分離します。
      注:咽頭または頸部の組織も採取する場合は、斬首を行わず、直接ステップ2.3.2に進むことができます。
    2. マウスを裏返して、腹側が上を向き、下顎骨に簡単にアクセスできるようにします。
    3. 親指と人差し指で動物の頭をそっと挟んで固定します。
    4. カミソリの刃を使って、下唇から襟ぐりに向かって下顎の皮膚を切る矢状中部切開を行います。
      注:#15サージカルブレードを使用して、切開とその後の解剖を行うこともできます(ステップ2.3.6-2.3.9)。
    5. 切開したら、親指と人差し指を使って切った皮膚を広げ、その下の筋肉と顎骨を露出させます。
    6. カミソリの刃を使って下顎の頬側の咬筋を切断し、左右の半顎骨の外側に筋肉の付着がなくなるようにします。
    7. 下顎骨の内側に沿って筋舌骨筋を切断し、そこにある筋肉の付着を取り除きます。
    8. 2つの半顎骨をつなぐ下顎結合をもう一度切開します。切断されると、下顎骨は左右半分に分離されます。
    9. 下顎顆と側頭下顎関節の間にかみそりの刃をくさびで留め、頭の残りの部分から半身骨を慎重に解剖します。
      注:切断中に切歯を同時にそっと引っ張ると便利であることがわかりました。下顎骨を骨折したり、内部の軟部組織を傷つけたりしないように注意する必要があります。
  4. 解剖した下顎骨を予熱した解剖培地ですぐにペトリ皿に移し(ステップ1.1)、#15サージカルブレードを使用して残りの筋肉組織を取り除きます。
    注:サンプルを低温培地に保管すると、細胞活性が低下し、ライブイメージング中に増殖や細胞移動などの特定の細胞活性の回収が遅れたり、失敗したりします。

3. マウス切歯全体の単離

注:切歯のさらなる分離は、明視野解剖顕微鏡で行われます。

  1. 切歯ソケットを覆い、切歯の頂端部分を収容する下顎骨の楕円形の領域を視覚的に識別します。
  2. 下顎骨の内側(舌側)が上を向くように下顎骨を配置します。
  3. 鋸歯状の鉗子で下顎骨を所定の位置に保持しながら、#15外科用ブレードを使用して、顆から大臼歯に向かっている方向に上にある膜骨を削り取ることにより、楕円形領域に窓を生成します。これにより、内面の頂端切歯の軟部組織が露出します。
  4. 下顎骨をひっくり返して、外側(頬側)の表面が上を向くようにします。
  5. ステップ3.3で説明したように、下顎骨の外側の楕円形の領域に窓を生成し、メスの先端を使用して、端に残っている骨片を取り除きます。歯の先端が両側から見えることを確認してください。
    注意: 下にある軟部組織の損傷を防ぐために、骨を剃るときは過度の圧力を避けてください。
  6. 切歯の周りの骨を体系的に切り取り、歯全体を分離します。
    1. 最初に顆状突起を取り除くために、頂端切歯のすぐ隣にある平面できれいに切り込みを入れます。
      注意: 切歯に切り込まないように注意してください。
    2. 第3大臼歯のすぐ後ろに2回目の切り込みを入れますが、歯を傷つけずに切歯の背側に切り込みを入れます。これにより、コロノイド突起を含む骨が除去されます。
    3. 角突起の先端から切歯に向かって連続的に切断し、腹側下顎骨を段階的に徐々に除去します。
      注:歯の上皮と関連する歯周組織は、腹側骨の大部分を一度に切断すると、骨に付着していることが多く、簡単に剥がれてしまいます。切歯の軟部組織から骨を分離するには、切歯の頂端にある2つの組織の間にメス(または一対の鋭い鋸歯状でない鉗子)を挿入し、器具を繊細に前方にスライドさせます。
    4. 大臼歯で歯槽骨と切歯に付着したままの残りの骨を切り取ります。
    5. 切歯全体が分離されました。完全に切除した切歯を清潔な温かい解剖培地を入れた皿に移します(ステップ1.1)。
  7. 手順3.2〜3.6を繰り返して、必要に応じて追加の切歯を分離します。
    注:マウスの上顎/上切歯も成体幹細胞を維持しており、歯の再生を研究するために使用できます34。歯科研究者は通常、上切歯よりもアクセスしやすく、解剖しやすい下切歯に焦点を当てます。下顎切歯前駆細胞と上顎切歯前駆細胞の違いは、まだ決定されていません。

4.切歯上皮子宮頸部ループを露出させるための歯周組織の除去

  1. 切歯全体を舌側に横たえ、鋸歯状の鉗子で歯を所定の位置に保持しながら、#5の細い鉗子を使用して、頂端切歯と子宮頸部ループ領域を覆う歯周組織を押し込みます。
  2. 歯周組織を頂端芽から慎重に剥がし、子宮頸管ループの外側(または他の関心領域)がスコープの下に見えるようにします。
    注意: 歯の上皮を傷つけたり、間葉から剥離したりしないように注意する必要があります。切歯が関心領域に蛍光シグナルを有し、蛍光解剖顕微鏡が利用可能な場合、蛍光シグナルを使用して組織タイプを区別し、解剖を助けることができます。セクション2〜4を効率的に実施して、サンプルを培地に迅速に移し、外植片培養によって適切に維持できるようにすることが重要です(下記参照)。

5. 外植片培養のための組織包埋

  1. 500 μLの温かい未固化培養ゲルを24ウェルプレートのウェルに加え、解剖した切歯全体をウェルにすばやく移します。プレートを数回回転させて切歯をすすぎます。
  2. 400 μLの温かい未固化培養ゲルを培養皿に加え、すすぎ取った切歯を皿に移します。
    注:灌流セットアップと互換性のある市販の培養皿を使用しています。代替オプションについては、手順 6.4 を参照してください。
  3. 切歯の向きを向けて、子宮頸部ループ領域(または他の関心領域)を皿の中心に配置し(図2A、B)、頂端切歯の傾きを目的のイメージング面に調整します。
    注:組織の配向は、ゲル化が完了する前に迅速に行う必要があります。
  4. ゲルが固まったら、一対の細かい鉗子を使用して、関心領域の上にあるゲルを取り除き、ゲルで覆われないようにします。
  5. 十分な量の温かい培地を、サンプルを覆うように皿の端にゆっくりとピペッティングして添加します(~150 μL)。
  6. 外植片培養物を37°Cの細胞培養インキュベーターに移し、組織を沈降させ、培養条件に1時間調整します。

6. 切歯外植片のタイムラプス顕微鏡検査

注:この実験では、開口数1の25倍の水浸対物レンズを備えた正立顕微鏡を使用しました。一般に、深部組織イメージングには、高開口数の水浸レンズが最適です。

  1. 顕微鏡と2光子レーザーの電源を入れます。
  2. 培養皿をステージアダプターに固定し、灌流アダプターリングを上部に取り付けます(図2C)。
  3. ステージアダプターを温度コントローラーセットに接続して、培養を37°Cに維持します。
  4. アダプターリングの入口と出口をマイクロ灌流ポンプに接続し、ポンプの灌流速度を20に設定して培地の灌流を開始します。これにより、サンプルの上部に培地のゆっくりとした流れ(~5 mL/h)が生成されます(図2C)。
    注:組織を安定的に制御された環境で維持するためのシステムの詳細については、 材料表 を参照してください。他のシステムも使用できます。37°Cの加熱プレートと、シリンジポンプに接続された入口と出口を備えた自家製の灌流培養皿(補足図S1)を組み合わせて使用することもできます。
  5. アダプターリングの上に大気制御バリアリング(ACBR)を置き、ACBRを通して対物レンズを下げて培地に接触させます(図2D)。
  6. レーザー波長を920 nmに調整して、GFPと赤色蛍光(tdTomatoなど)の両方の信号を可視化します。
  7. 接眼レンズを通してサンプルを見つけ、次に顕微鏡のソフトウェアでサンプルを見つけます。
  8. ソフトウェアを使用して、Zスタック、マルチポジションイメージング、および時間間隔を設定します。このプロトコルに従うには、4 μm の z ステップサイズと 5 分の時間間隔を 14 時間使用します。
    注:5分を超える時間間隔では、スムーズな細胞の動きと分裂を捉えるには不十分であることが多いことがわかりました。
  9. タイムラプス撮影を開始します。
    注意: サンプルの位置は最初の1時間でシフトする可能性があり、さらに調整が必要になる場合があります。
  10. ダウンストリームのデータ処理と分析のためにファイルを保存します。

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結果

成体マウス切歯の頂端領域は下顎骨内に包まれているため(図1)、増殖領域内に存在する前駆細胞を可視化してライブトラッキングするために直接アクセスすることはできません。そこで、顎骨から切歯全体を抽出し、2光子タイムラプス顕微鏡用の外植片培養系で維持する方法を開発しました(図2)。ここでは、歯上皮の唇頸部ループ領域における細胞増殖と移動のダイナミックなプロセスを捉えた代表的な結果について説明します。

実験手順を実証するために、歯の上皮で緑色蛍光を発現する2つの異なるマウスモデルを使用しました。最初のマウスラインはK14Creです。R26rtTAです。ここで、K14Cre(MGI:2680713)は、ケラチン14プロモーター35からCreリコンビナーゼを発現し、R26rtTA対立遺伝子...

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ディスカッション

生組織イメージングは、細胞がニッチな環境で維持されるときの細胞の動的なプロセスと挙動を研究することを可能にする重要な技術です41。理想的には、ライブイメージングは、高い時空間分解能で in vivo で行われます。しかし、哺乳類器官の in vivo イメージングは、組織へのアクセス不能、光学的不透明性、および動物または器官を長期間固定することの難しさのために困難な場合がある42。組織外植片は、これらの課題のいくつかを回避し、歯の形態形成や外胚葉器官の発達中など、細胞の挙動を追跡するための多くの研究で成功裏に採用されています26。ここでは、培養した成体マウス切歯の深部組織イメージングをライブで行うための、比較的シンプルかつ堅牢なプロトコルを実証しました。この技術を応用することで、歯の再生における細胞の動き、運命の決定、組織組織の制御を理解することができます。

細胞分裂は容易に観察できるイベントであり、再生...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)の先端光学顕微鏡/分光法研究所とカリフォルニアナノシステム研究所(RRID:SCR_022789)のライカマイクロシステムセンターオブエクセレンスが、2光子顕微鏡を提供してくれたことに感謝します。ASは、イスラエル科学財団のISF 604-21の支援を受けました。JHは、NIH/NIDCRのR03DE030205とR01DE030471の支援を受けました。ASとJHは、米国・イスラエル二国間科学財団(BSF)からの助成金2021007の支援も受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24ウェル、平底組織培養プレートオリンパスプラスチック25-107
25x HC IRAPO motCORR水浸漬対物レンズカ11507704
アスコルビン酸(ビタミンC)Acros Organics352685000
D-(+)-グルコースbioxtra シグマ アルドリッチG7528
デルタ T システム Bioptechs0420-4温度制御、培養皿、灌流セットアップを含む
解剖顕微鏡 - LEICA S9ELeicaLED300 SLI
DMEM/F12Thermo Scientific11039047フェノールレッドを含まない基礎培地
フェザー手術用ブレード (#15)フェザー72044-15
ファインフォーセプスF.S.T11252-23
グルタマックス Thermo Scientific35050-061グルタミン代替品
Leica SP8-DIVE (25X HC IRAPO motCORR 水浸対物レンズを装備)  ライカn/a
低融点アガローNuSieve50080
非必須アミノ酸 (100x)Thermo Scientific11140-050
ペニシリン–ストレプトマイシンThermo Scientific1514012210,000 U/mL 
ペトリ皿Gen Clone32-107G90 mm 
ラット血清バレーバイオメディカルAS3061SCライブイメージング用に処理
されたカミソリ刃#9VWR55411-050
ハンドル
さみ
鋸歯状鉗子FST11000-13
スプリングハサミFST91500-09
ライス メスFST10003-12はFST37133

参考文献

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