ヒト大網を用いた卵巣癌腹膜転移の Ex vivo モデル

卵巣がんは^{、世界で最も致命的な}婦人科悪性腫瘍です1。このがんを発症する生涯リスクは約70人に1人で、診断年齢の中央値は63歳です²。原発性卵巣悪性腫瘍は、組織学的に上皮性または非上皮性のいずれかに分類される。上皮性卵巣がん(EOC)は腫瘍の90%以上を占め、最も一般的なサブタイプは高悪性度漿液性がん(HGSC)であり、EOCの約70%〜80%を占めています。現在、病気を早期に発見するための有効なスクリーニング方法はありません。そのため、ほとんどの患者は、がんが腹膜腔全体に拡がった後、進行した病期(すなわち、国際婦人科産科[FIGO]ステージIIIまたはIV)で診断^{されます2。}

標準的な最前線治療は、目に見える肉眼的病変をすべて切除する細胞縮小手術と、その後、残存する顕微鏡的病変を破壊するための補助プラチナ製剤ベースの化学療法です。過去20年間で卵巣がんの治療には多くの進歩がありましたが、進行した疾患の患者の約70%^が治療後3年以内に再発します3。これらの患者の全体的な予後不良を考えると、EOCにおける進行中および将来のトランスレーショナルリサーチの取り組みは、早期発見のためのバイオマーカーの特定、転移の予防、耐性を回避するための現在の治療法の改善、および新しい個別化がん治療法の開発を目的としています。

腹腔内の全身性転移とそれに関連する化学療法抵抗性は、卵巣癌患者の治療を改善するための主要な制限の2つです^4,5。大網は、胃から腸に垂れ下がる脂肪質のエプロンのような構造で、卵巣がん転移の主な部位です^6,7。大網は、物理的なバリアとしての機能に加えて、再生能力と血管新生能力を持ち、免疫活性を持っていることが示されており、これらが一緒になって血管新生を促進し、創傷治癒を促進し、感染を制限します⁸。さまざまな細胞タイプに分化できる幹細胞を高濃度で含み、損傷した組織の修復に役立ちます。大網は、損傷や感染に反応して炎症を起こすことがあり、それが免疫細胞^の損傷部位への移動を引き起こす9。これらの免疫細胞は、損傷した組織の修復と再生を促進するのに役立つ成長因子やその他の分子を放出します。大網に局在するマクロファージ、リンパ球、形質細胞などの免疫細胞は「乳白色の斑点」と呼ばれる構造で、病原体を検出して攻撃し、腹膜免疫を調節する役割を担っています。また、大網は免疫寛容¹⁰(自己抗原に耐え、健康な組織を攻撃しない免疫系の能力)を誘導する役割も担っていることが示されている。しかし、同じ免疫関連活動は、大網腫瘍の増殖、転移、免疫監視の脱出などの病理学的反応にも関与しています^9,11。私たちの研究室や他の研究による以前の研究は、抗腫瘍免疫応答の阻害と化学療法抵抗性の獲得における脂肪微小環境のユニークで積極的な役割を示しています12,13,14。残念ながら、大網が腫瘍誘発性の微小環境を提供する細胞および分子メカニズムに関する情報は限られています。

がん細胞と大網の相互作用をよりよく理解するために、ヒト卵巣がん細胞と患者由来の大網外植片からなる3D培養システムを開発しました。ここに記述されているプロトコルは腹膜の癌腫症の新しい 生体外 モデルを表す。このモデルは、この脂肪が豊富な組織における卵巣がん腫瘍形成の自然な進行を模倣しています。提案されたモデルは、生成が容易で安価であり、卵巣癌研究におけるトランスレーショナル研究に適用できる可能性があります。

以下の研究プロトコルは、ウェイン州立大学治験審査委員会(IRB)によってレビューされ、承認されました。手術前にすべての患者からインフォームドコンセントが得られました。 図 1 は、このプロトコルの 3 つの一般的な手順を示しています。

1. ヒト大網組織の調製

1. 大網培養培地(DMEM/F12 + 10%ウシ胎児血清 + 1%ペニシリン-ストレプトマイシン)を調製し、4°Cで保存します。 この培地30〜40 mLを滅菌50 mLのコニカルチューブまたは手術標本容器に分注します。
2. 大網生検または大網切除術から手術標本を取得します。手術室で取り出した直後に、滅菌標本を大網培養液に浸します。ワークフローでこれができない場合は、できるだけ早く検体を大網培養培地に入れてください。サンプルを氷上に置いて移し、処理するまで4°Cで保存します。
   注:除去された大網標本のサイズによって、実行可能な組織の量が決まります。
3. 層流フードを使用して、収集から1〜2時間以内に大網標本を処理します。すべての材料とツールが滅菌または滅菌されていることを確認してください。
4. 大網を採取容器から取り出し、100mmの培養皿に移します。検体を1xリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)に浸し、検体を静かに洗浄して血栓や破片を取り除きます。
5. 組織を小片(0.5 cm x 0.5 cmまたは100-200 mg; 図2A)小さな手術用ハサミまたは10〜15mmのメスを使用します。小さな外科用鉗子を使用して、組織を操作し、大網を押しつぶさないようにします。エネルギー装置を使用して大網標本を外科的に除去した場合は、密閉されたエッジで歪んだ組織を使用しないでください。
6. 切断した大網の各部分を24ウェル培養プレートの個々のウェルに入れ、ウェルに500 μLの大網培養培地、または大網片をウェル床上に浮かせずに大網を覆うのに十分な容量まで満たします(図2B)。
7. 大網片は、注入の準備ができるまで4°Cの新鮮な培地に保管してください。

2. 卵巣がん細胞の調製

1. ヒト卵巣がん細胞を75cm2の培養フラスコで37°C、5%^CO2で培養し、大網採取日までに少なくとも75%のコンフルエントに培養する。
   注:このプロトコルは、以前に^15,16,17,18と記載されたmCherry陽性OCSC1-F2ヒト卵巣癌細胞を利用します。蛍光シグナルでタグ付けされた任意のがん細胞株に修飾できます。
2. 大網標本を採取した直後に層流フード内に細胞を調製します。すべての材料とツールが滅菌または滅菌されていることを確認してください。
3. 10 mLの滅菌1x PBSを培養フラスコに加え、フラスコを静かに揺動させて細胞を洗浄します。1x PBS を除去し、3 mL の 0.05% トリプシン-EDTA を加えます。
4. 培養フラスコを静かに揺らしてすべての細胞をコーティングし、フラスコをインキュベーター(37°C、5%_CO2)に5分以内入れます。培養フラスコを叩いて細胞を完全に剥離し、3 mLの大網培養培地を加えてトリプシンを中和します。
5. 細胞懸濁液をピペッティングで混合し、懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移します。懸濁液を24°C、1,200 x g で5分間遠心分離します。 上清を除去し、細胞ペレットを6 mLの新鮮な大網培養培地に再懸濁します。
6. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞懸濁液を懸濁液100〜200μLあたり少なくとも100,000細胞に希釈します。これは、大網の各カット部分への注入量です。
7. 適切な数の細胞を新しい培養フラスコに移し、細胞継代を継続します。

3. 卵巣がん細胞の注入

1. 1 mL のシリンジを使用して細胞懸濁液を吸い上げ、26 G の針を取り付けます。針を使用して細胞懸濁液を吸い上げると、細胞が断片化する可能性がありますので、使用しないでください。
2. 小さな外科用鉗子を使用して、切断された大網の一部を拾います。大網を別の作業中の滅菌皿に移して、注射を容易にします。.針先で大網を静かに刺し、少量の細胞懸濁液を組織に注入します(図2C)。
3. 大網のいくつかの領域にわたって、少なくとも100μLまたは100,000細胞の総量まで注射を繰り返します。.細胞懸濁液の多くが標本の周囲に溜まっているように見える場合があることに注意してください。注入の品質に懸念がある場合は、注入を繰り返すか、より多くの細胞懸濁液を検体に注入します。
4. 注入した大網サンプルを24ウェル培養プレートの各ウェルに戻します。大網培養培地の体積は、大網を浮遊させずに大網を覆うレベルであることに注意してください。プレートを慎重に取り扱い、インキュベーター(37°C、5%CO₂)に入れます。
5. オプション:マトリゲル(基底膜マトリックス)を使用して、大網組織を固体マトリックスに懸濁し、注入を容易にし、細胞懸濁液の送達をより濃縮します。
   1. 基底膜マトリックスを4°Cで融解し、使用直前に大網培地と1:1の比率で混合します。基底膜マトリックス混合物は、注入するまで氷上または4°Cで保存します。大網の切り取った部分を浸すのに十分な基底膜マトリックス混合物で空のウェルを満たします。
   2. 標本を基底膜マトリックス混合物に入れ、24ウェル培養プレートをインキュベーター(37°C、5%_CO2)に20分間入れます。混合物が固まったら、上記のように注入を続行します。
6. 蛍光イメージングを使用して注入が成功したことを確認します。注入部位に蛍光シグナルのストリークが可視化されていることを確認します(図2D)。注射後に大網に付着した細胞の実際の数は予測できないことに注意してください。.

4. ヒト大網細胞と卵巣癌細胞の共培養

1. 500〜2000μLの新鮮な大網培養培地を追加して、48〜72時間ごとに培地を交換します。大網組織の上に培地を直接ピペットで移すと、がん細胞が移動する可能性があるので、使用しないでください。メディアの色が黄色に変わった場合は、メディアを交換してください。
   注:培地交換の頻度は、使用する培地の量とがん細胞の増殖の軌跡によって異なります。がん細胞が大網に種をまくと、大網片が浮いているかどうかは重要ではなくなります。
2. オプション:基底膜マトリックスを使用した場合、マトリックスは通常、最初の培地交換時までに溶解します。
3. 蛍光イメージングを使用して卵巣がん腫瘍の成長を監視します。イメージングの頻度は研究者の裁量に委ねられています。約14日までに小さな腫瘍の証拠が予想されます(図3A-C)。結果は、注射の質によって異なる場合があります。
4. 実験エンドポイントに基づいて実験を終了します。
   注:大網組織の腫瘍の成長と完全性は、過去50日間観察されています。

大網標本への卵巣がん細胞の正常な定着は、約14日目までに明らかになりました(図3A-C)。少なくとも 24 回の繰り返しを調製し、さらなる実験を可能にするために、収集した検体ごとに注入しました。蛍光画像を撮影することにより、腫瘍の成長をモニターしました(図3D、E)。画像は、大網に付着していない各ウェルの底にも癌細胞の単層が成長したため、慎重に解釈する必要がありました。大網が培地に懸濁されたときの画像は、がん細胞の単層と蛍光シグナルが重ならないように撮影することを好んだ。

14日目までに蛍光シグナルが見られない場合は、注射の失敗と見なすことができます。がん細胞は、最初の7日間は大網の表面に広がっていましたが、時間が経つにつれて集まって腫瘍を形成することが観察されました(図3A-D)。サンプル間の腫瘍量に対する代替指標は、大網培養培地の色が赤から黄色に変化する速度であった(図3F)。蛍光イメージング、組織学的レビュー、および肉眼検査を利用して、50日間の共培養後の腫瘍の成長と大網組織の生存率を確認しました(図4)。

図1:プロトコルの一般的なステップの図。 (A)ステップ1:大網の準備。(B)ステップ2:がん細胞の注入。(C)ステップ3:がん細胞-大網微小環境の確立。(図は BioRender.com で作成)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:大網へのがん細胞の調製と注入 。 (A)大網は1×1cmに切り分けられます。(B)各ピースを24ウェルプレートのウェルに入れ、500μLの培地で覆います。(C)大網片へのがん細胞の注入。(D)注射後に蛍光がん細胞の筋状が観察される。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:14日および25日間の共培養後の代表的な画像。 (A-C)14日間の共培養後の代表的な画像:(A)相、(B)mCherryチャンネル、(C)マージ。(D-E)25日間の共培養後の代表的な画像。(F)培地の色がピンク色から黄色に変化することは、がん細胞の注入が成功し、共培養が確立されたことを示しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:肉眼的形態およびヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色 。 (A、B)50日目の共培養の代表的な肉的形態。矢印はmCherry+卵巣がん細胞の増殖部位を示す。(C、D)50日目の共培養の代表的なH&E染色。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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