方法論記事

スコポラミンによる涙腺機能障害を有するラットドライアイモデル

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DOI：

10.3791/66036

⸱

2024年2月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Eye Hospital, Jinan University, 2Shenzhen Eye Institute, 3Shenzhen Research Institute, Wuhan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、涙腺機能障害のラットモデルを確立し、水欠損ドライアイの研究の基礎を提供します。

要約

水欠乏性ドライアイ(ADDE)は、涙液分泌の量と質が低下するドライアイ疾患の一種です。異常な涙液の分泌が長引くと、角膜の損傷や炎症など、眼の表面環境が乱れる可能性があります。重症の場合、ADDEは視力低下や失明を引き起こす可能性があります。現在、ドライアイの治療は点眼薬や理学療法に限られており、目の不快感の症状を緩和するだけで、ドライアイ症候群を根本的に治すことはできません。ドライアイにおける涙腺の機能を回復させるため、スコポラミンを誘発したラットの涙腺機能障害の動物モデルを作成しました。涙腺、角膜、結膜などの総合的な評価を通じて、ADDEの病態変化の全体像の解明を目指します。現在のドライアイマウスモデルと比較して、このADDE動物モデルには涙腺の機能評価が含まれており、ADDEの涙腺機能障害を研究するためのより良いプラットフォームを提供します。

概要

2021年までに、約12%の人がドライアイ1に罹患し、最も一般的な慢性眼疾患の1つとなっています。ドライアイは、病気に影響を与えるさまざまな要因に応じて、水欠乏ドライアイ(ADDE)と蒸発性ドライアイ(EDE)2の2つのタイプに分けることができます。ADDEはさらにシェーグレン症候群(SS)と非SSに分けられますが、臨床3ではドライアイ患者の大半が非SS患者です。慢性ドライアイの症状は、患者の視覚の質に深刻な影響を及ぼします。現在、DEDの従来の治療には、眼表面を滑らかにするための人工涙液の適用とまぶたの理学療法が含まれます。しかし、ドライアイ症候群は、多くの場合、完治しない可能性があります。したがって、ドライアイ疾患の病因を研究することは、新しい治療法や薬の開発にとって非常に重要です。ドライアイ症候群の動物モデルは、さらなる研究の基礎となる。

ドライアイ症候群4の動物モデルを構築するには、ホルモンレベルを変化させることで涙液分泌量を変化させるなど、さまざまな方法があります。例えば、ラットの精巣を摘出すると、アンドロゲン分泌が減少し、涙液分泌が増加し、涙液中の遊離分泌成分(SC)とIgAの濃度が低下する可能性があります5,6。別の方法は、涙腺を制御する眼表面神経を除去することにより、涙腺の自己免疫反応を示すことです。さらに、涙腺7を外科的に除去することにより、涙液分泌を直接減少させることを達成することができる。環境条件の変化も、涙液の蒸発を加速させる可能性があります。例えば、低湿度および乾燥した換気条件下で動物を培養すると、過度の蒸発ドライアイのモデルを確立することができ8、これはドライアイの重症度を増大させるために他の方法と組み合わせることができる。ドライアイ実験モデルを誘導するために使用される主な薬剤は、アトロピンとスコポラミン9です。副交感神経阻害剤として、どちらも涙腺のコリン作動性(ムスカリン)受容体の薬理学的遮断を誘発し、涙液分泌を阻害することができます。.スコポラミンは、アトロピン筋注射10によるドライアイと比較して、分泌腺に対する抑制効果が強く、薬物作用の持続時間が長く、心臓、小腸、気管支の平滑筋に対する効果が弱い。ドライアイ動物モデル用の最も成熟した薬剤の1つです。

スコポラミンでドライアイを誘発するには、皮下注射、薬物ポンプ、パッチ塗布など、さまざまな方法を使用できます4,11,12。実験動物への薬物投与頻度を減らすために、多くの研究者はマウスの尾部に経皮パッチを貼ったり、ドラッグポンプを使用したりしています。ただし、どちらの方法にも制限があります。例えば、経皮吸収型パッチの吸収は、マウスの個々の吸収を考慮する必要があり、これは薬物投与量の不均一化につながる可能性があります。薬物ポンプは各投与の投与量を正確に制御できますが、送達される薬物や使用される濃度と常に互換性があるとは限りません。また、外科的に留置する必要がありますが、これは動物にとってより侵襲的であり、麻酔イベントを必要とし、裂開などの術後合併症の可能性があります。皮下注射は、より面倒ですが、各投与の正確な投与量を確保し、異なるラット間での薬物投与の一貫性を維持することができます。同時に、低コストで、多数の動物実験を行うのに適しています。

この研究では、スコポラミンの皮下注射を繰り返し適用して、ドライアイラットモデルを確立します。角膜欠損、涙液分泌量、角膜、結膜、涙腺の病態形態などのドライアイ指標を解析します。薬物濃度、病理症状、ドライアイ症状を組み合わせることで、ドライアイラットモデルをさらに詳細に説明し、ドライアイ治療と病理学的メカニズムの研究のためのより正確な実験データを提供します。また、将来の研究者のために、モデリングプロセスについても詳しく説明します。

プロトコル

このプロトコルに従って実施されるすべての動物実験は、動物実験委員会(IACUC)の承認の下で実施されます。

1.動物の調製

  1. 体重160g±20gの健康な6週齢のSPF Wistar雌ラット12匹を調製します。
  2. 細隙灯と検眼鏡を使用して、すべてのラットの眼の状態を調べ、前眼部や網膜の病気がないことを確認します。
  3. 十分な餌と水源ですべてのラットを1週間飼育します。
  4. すべてのラットを正常なスコポラミン薬物濃度2.5mg/mL、スコポラミン薬物濃度5mg/mL、スコポラミン薬物濃度7.5mg/mLに無作為に割り分け、各群に3匹ずつ配置した。

2. 溶液調製

  1. スコポラミン臭化水素酸塩を0.9%塩化ナトリウム溶液に溶解して調製し、7.5 mg/mL、5 mg/mL、および2.5 mg/mLの濃度の溶液を作成します。
  2. スコポラミン臭化水素酸塩を含まない0.9%塩化ナトリウム溶液を調製し、ラットの対照群の注射として使用します。

3.機器と材料の準備

  1. 小動物顕微鏡を用意します。
  2. 針付き使い捨てシリンジ1mL(26 G)を含む実験用の材料を準備します。フルオレセインナトリウム眼科用ストリップ;シルマーの破損試験紙;無水エタノール;4%パラホルムアルデヒド;キシレン;ニュートラルバルサム;ヘマトキシリン、エオシン;および過ヨウ素酸シッフ染色キット。

4.皮下注射

注意: この手順では、ラットを固定するために2人目の支援が必要です。

  1. ネズミの体をしっかりと保持し、左(または右)の後ろ足を捕まえて伸ばします。
    注意: 介助者が動物を抱きかかえるのを手伝ってくれます。
  2. アルコールで注射部位をきれいにします。
  3. 針付き使い捨てシリンジ1mLを、親指と指の間の皮膚のひだの付け根に挿入します。
  4. シリンジプランジャーを引き戻してシリンジを吸引します。シリンジ内の血液は、針の配置が不適切であることを示しています。針を取り外して位置を変えます。
  5. 0.9%塩化ナトリウム溶液をスコポラミン臭化水素酸塩の有無にかかわらず、安定した流動的な動きで投与します。.
  6. すべてのラットを異なる濃度に従って注射し、0.5 mLを毎回、1日4回(9:00、12:00、15:00、18:00)19日間連続して、左右の肢を交互に注射します。
    注: グループには、次のような名前が付けられています。
    スコポラミン臭化水素酸塩を含まない群:0群(対照)
    スコポラミン臭化水素酸塩2.5 mg/mLを含むグループ:2.5グループ
    スコポラミン臭化水素酸塩5 mg/mLを含むグループ:5グループ
    スコポラミン臭化水素酸塩7.5 mg/mLを含むグループ:7.5グループ
  7. 動物をケージに戻し、呼吸と行動を5〜10分間監視します。

5.涙液分泌試験(シルマー涙液試験、STT)

  1. ラット11用の修正された濾紙ストリップを作成します。人間用の濾紙帯を中心線(1mm×15mm)に沿って半分にカットし、ストリップの頭を滑らかにトリミングします。
    注意: 涙分泌試験を行う前に、手動でラットの体を拘束して動きを防ぎ、ラットの目を露出させてください。
  2. ラットの下まぶた結膜嚢の外側1/3にろ紙ストリップを置きます。
  3. テストの時間を5分間計ります。処置中、ラットの目の閉鎖を制御します。
  4. 測定後、ピンセットを使用してろ紙ストリップを微量遠心チューブにクランプし、チューブの壁に印をつけて涙の量を記録します。
  5. 0日目、1日目、3日目、5日目、7日目、11日目、15日目、および19日目に涙液分泌を測定します。

6. 角膜フルオレセイン染色

  1. 0.5 μLの0.5%フルオレセインナトリウム溶液を各ラットの下結膜嚢に滴下します。
  2. フルオレセイン点眼後、3分間青色光の下で角膜を観察します。
  3. 各ラットの角膜の蛍光染色を記録し、角膜欠損があるかどうかを観察します。
  4. 0日目、1日目、3日目、5日目、7日目、11日目、15日目、19日目に角膜フルオレセイン染色を行います。

7. 結膜組織の組織学的観察

  1. モデル開発完了後、0.4mL/100gの10%抱水クロラール水溶液の腹腔内注射でラットを深く麻酔し、動物の緊張を緩和します。その後、頸部脱臼によりラットを安楽死させる。
  2. 各ラットの同じ領域から、約2 mm x 2 mmのサイズの球結膜を採取します。
  3. 直ちに組織を4%パラホルムアルデヒドに24時間固定し、パラフィン13に包埋します。
  4. 厚さ5 μmの切片を切断し、ヘマトキシリンとエオシン(HE)14 および過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色で染色します(メーカーの指示に従ってください)。

8. 角膜および涙腺組織の組織学的観察

  1. モデル開発が完了したら、ステップ7.1の説明に従ってラットを安楽死させます。
  2. 各ラットの右側にある角膜を取り、すぐに4%パラホルムアルデヒド溶液で固定します。
  3. 耳と目尻を結ぶ線に沿って頭側表皮と皮下組織を切断し、切開部を両側に広げ、さらに黄色がかった眼窩外腺を分離します。
  4. ラットの毛皮を完全に取り除き、0.9%塩化ナトリウム溶液で眼窩外腺を分離します。
  5. 単離された眼窩外腺を4%パラホルムアルデヒド溶液に24時間置き、パラフィンに埋め込みます。
  6. ~5μmの厚さの連続切片を切断し、角膜および眼窩外腺組織標本をHEで染色します。

9. 統計解析

  1. データの統計分析には、適切なソフトウェアを使用してください。
    1. 一元配置分散分析 (ANOVA) を実行してデータを分析し、最小有意差 (LSD) 検定を実行してグループ間の比較を行います。統計的有意水準を α = 0.05 に設定し、P < 0.05 を統計的有意性を示します。
      注:SPSS 20ソフトウェアは、実験データの統計分析に使用されました。

結果

シルマーIテスト、SIT I
ラットの涙液量は、実験開始後0、3、5、7、11、15、19日目に測定した。実験結果から、対照群(0群)と比較してスコポラミン群(2.5群、5群、7.5群)の涙液分泌が有意に減少し、その差は統計学的に有意であった(P < 0.01)。2.5群、5群、7.5群の間に統計的有意性は認められなかった(P > 0.05)。日数(P > 0.05)に関して、異なるグループ間で有意差は観察されませんでした(図1、 表1)。

角膜フルオレセイン染色
角膜フルオレセイン染色は、実験の0、3、5、7、11、15、および19日目に行いました。その結果、どのグループでも角膜フルオレセイン染色は見られず、異なる濃度のスコポラミン薬を用いた20日間の実験中に明らかな角膜上皮欠損は形成されなかったことが示されました(図2)。

角膜上皮の病理学的解析
実験後、各ラットの角膜組織を採取してHE染色を行い、角膜上皮の形態を観察し、角膜上皮層の厚さを測定しました。対照群の角膜上皮は、整然と配置された上皮細胞の4〜6層で構成され、その中で基底層は、きれいに密集して配置された円柱状上皮細胞の単層から構成されていた。スコポラミン群2.5、5、および7の角膜上皮は、対照群よりも有意に薄く、扁平で萎縮した細胞形態と細胞構造の乱れを呈していた。グループ7.5では、基底層に緩い細胞間接続と液胞構造がありました( 図3の赤い矢印で示されています)。スコポラミン群の角膜上皮と比較して、正常対照群の角膜上皮は角膜上皮層の厚さに統計的な差が見られました(図4)。

涙腺の病理学的分析
ラットの涙液分泌の主な腺は眼窩外涙腺である15。涙腺切片を観察すると、スコポラミン濃度の上昇に伴って涙腺上皮細胞の形態の変化が観察され、炎症や組織の浮腫が見られました。対照群ではそのような変化は観察されなかった。病理学の結果は、涙腺の炎症性変化、細胞浮腫、および腺上皮細胞の萎縮を、涙腺の機能的損傷の指標として使用できることを示唆しています16 (表2)。これらの指標は、涙液分泌量に対するドライアイの重症度を測定するために使用できます(図5)。

結膜染色結果の解析
対照群における結膜の構造は完全であり、主に表層と固有層からなる。表層は積層された円柱状上皮細胞であり、滑らかで完全であり、細胞表面に微絨毛がある。散在する杯細胞は上皮細胞間に存在し、細胞体積が大きく、細胞質内に粘液性顆粒が存在した。3つのスコポラミン薬物群の結膜上皮の表層は有意に薄く、微絨毛細胞と杯細胞の数は減少し、細胞配列構造は不完全であり、浮腫を伴い、HE染色で観察された少量の炎症細胞が見られました(図6)。

結膜をPASで染色することにより、各マウスの3つの独立したサンプルにおける40倍の顕微鏡野あたりの平均杯細胞数を計算し、平均±SDとして表しました(図7)。

figure-results-1
図1:各グループのシルマーテスト値の統計量(mm) この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図2:ラット角膜のフルオレセインナトリウム染色。 フルオレセインナトリウムを用いた20日間の実験では、すべてのラットの角膜に肯定的な所見は観察されませんでした。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図3:角膜上皮染色と厚さ測定。 グループ7.5では、基底層に細胞間接続と液胞構造が緩んでいました(赤矢印で表示) この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:各グループの角膜上皮厚の統計。 スコポラミン群の角膜上皮と比較して、正常対照群の角膜上皮は角膜上皮層の厚さに統計的な違いを示した。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図5:ラットの眼窩外涙腺のHE染色結果。 (A)グループ0:視野では、涙腺は小葉構造を示し、管と管状腺で構成されており、管の形態に明らかな異常はなく、管状腺は細胞質に粘液状物質が豊富に含まれた円錐形の腺細胞で構成されていました。 結合組織に明らかな浮腫はなく、間質血管に明らかな異常はなく、明らかな壊死や炎症性細胞浸潤はありません。(B)グループ2.5:視野では、涙腺上皮細胞の萎縮が時折みられ、体積の減少、不規則な形状の拡張腺腔、腔内の粘液性物質の減少(赤矢印)。また、間質に遊離リンパ球が浸潤することがありますが(青い矢印で示します)、管の形態に明らかな異常や浮腫の兆候は観察されません。(C)グループ5:視野では、涙腺上皮細胞が時折萎縮して縮小し、腺腔が肥大し、腔内の粘液物質が減少し(赤矢印)、間質に遊離リンパ球浸潤が時折みられ(青矢印)、涙腺小葉間の管形態や結合組織浮腫に明らかな異常は認められない。(D)グループ7.5:浮腫は視野に見られます。涙腺間の間隔が広くなり、配置が不規則になり(緑矢印)、涙腺の上皮細胞が萎縮することが多く、体積が小さくなり、形状が不規則になり(黄色矢印)、腺腔が拡大し、腔内の粘液が減少し(赤矢印)、遊離リンパ球が浸潤する(青矢印)、 管形態に明らかな異常はありません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図6:ラット結膜のHE染色。 対照群の結膜上皮と比較して、スコポラミン薬を投与された結膜上皮の3つのグループすべてで、さまざまな程度の構造的損傷が見られました。. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

figure-results-7
図7:結膜のPAS染色。 (A)正常対照ラット。(B)スコポラミン群ラット。(C)各グループの杯細胞密度(20倍)。ブラックバー = 100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

シルマーI検定、SIT(平均値、単位[mm])
群0 日間3日間5日間7日間11日間15日間19日間
064.25875.56.3
2.522.722.73.33.73
52.32.71.72.33.23.73
7.52.33.22.52.82.73.22.8

表1:異なる時点(mm)での4群のラットのシルマー試験。 薬を塗った後、ラットの涙の分泌は有意に減少しました。

数壊死炎症浮腫上皮萎縮症
0グラム- 10000
0 グラム -20000
0 グラム -30000
2.5 GRP -10100
2.5 GRP -20000
2.5 GRP -30101
5 GRP -10101
5 GRP -20101
5 GRP -30001
7.5グラム-10121
7.5 グループ -20101
7.5 GRP -30122

表2:ラット涙腺の病理学的組織スコア。 採点基準: 0: 通常の条件下では、動物の年齢、性別、株などの要因を考慮すると、組織は正常と見なされます。

1:観察された変化は正常範囲を超えています。2:病変は観察できますが、まだ重症ではありません。3:病変は明らかで、悪化し続けています。4:病変は非常に重篤で、組織全体に影響を及ぼしている16.

ディスカッション

水欠乏ドライアイ(ADDE)はドライアイの重要な種類であり、ドライアイ全体の人口の約1/3を占め17、ADDEの主な原因は涙腺の病理学的損傷と炎症です13。このタイプのドライアイの場合、最も一般的な臨床治療法は、症状を緩和するための人工涙液またはステロイドまたはシクロスポリン18の局所塗布ですが、涙腺の損傷に対する治療オプションはほとんどありません。したがって、涙腺機能再建がドライアイに与える影響を調査し、涙腺機能障害の動物モデルを確立することは非常に重要です。ラットに涙腺の分泌を抑制する薬剤を繰り返し塗布する方法を用いて、慢性涙腺機能障害ドライアイ動物モデルを作製した。

このドライアイモデルを構築するためにラットを選択しましたが、これは他の動物モデルと比較してより多くの利点があります19。たとえば、ウサギは体のサイズが大きく、目的の効果を得るために、より多くの用量の薬またはより頻繁な注射が必要です。さらに、ウサギはわずかに高価であるため、実験のコストが高くなります。マウスは眼科研究でも一般的に使用されるが、一般的にはシェーグレン症候群モデルの構築に用いられる20。これらのモデルは、臓器の炎症とリンパ球浸潤を比較して、免疫病理学的メカニズムを探ることに焦点を当てています。マウスは体が小さく、涙腺の解剖学的構造が複雑で、涙液の分泌が少ないため、涙液の分泌を正確に反映することは困難です。ラット動物モデルは、簡便な薬剤注射が可能で、給餌条件が比較的単純で、臨床研究と実験的研究の両方に適しており、コストの面でも利点があるため、より適したドライアイモデルです。ADDEの優れた動物モデルです。

コリン作動性受容体遮断薬スコポラミンを応用してラット体内のコリン作動性受容体を阻害し、涙腺分泌を減少させ、涙腺細胞の病態構造を変化させることで、ドライアイ患者の涙腺の状態を根本的に模倣しました。他の方法と比較して、このアプローチは、自然な状態での涙腺の損傷状態をよりよくシミュレートします。塩化ベンザルコニウム点眼薬21の使用や、湿度の低下や眼表面蒸発の増加などの外部条件の変更4,8などの他の方法は、眼表面環境を混乱させるだけで、涙腺の機能状態を変化させない。そのため、長期にわたる慢性的なドライアイには適していません。

ラットの涙液の分泌量を測定する際には、シルマー涙液試験紙を改良しました。まず、人間が使用する涙液試験紙を中心線に沿って切断します。次に、上部を丸い円弧状にトリミングし、上部をゆっくりと折り返して、ラットの下部結膜嚢に簡単に挿入できるようにしました。ラットは活動的であり、5分間涙を測定することは困難であることに注意すべきです。シルマー涙液試験紙をラットの下部結膜嚢に挿入した後、ラットの快適性を高め、測定結果に影響を与える可能性のある涙の長時間の測定中に苦労しないように、手動でラットの目を閉じました。

涙腺を摘出する際には、まず涙腺の位置を特定する必要があります。涙腺の局在化のポイントは、耳の前面と内側のカンサスの間の中間点です。次に、毛皮の下の皮膚組織を切断し、断片化された毛皮の侵入を最小限に抑え、後の段階での取り扱いプロセスを減らします。抽出プロセスでは、断片化された毛皮をタイムリーにクリーンアップすることも重要です。特に涙腺を分離するときは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または生理食塩水を使用して繰り返しすすぎ、切片形成の結果に影響を与える可能性のある他の組織との混合を避けてください。

開発されたドライアイ動物モデルの利点は、プロトコルがさまざまな薬物濃度とさまざまな程度の涙腺損傷を相関させることです。これは、涙腺機能障害の治療の研究のための実験的基礎を提供する。モデリングプロセスの操作手順の一部を改良し、研究者にとってより詳細な参考資料を提供しました。また、角膜、結膜、涙腺の形態学的指標を組み込んだドライアイ動物モデル用の解析指標を追加し、結膜細胞をカウントし、涙腺損傷の程度をスコアリングしました。炎症、浮腫、萎縮から涙腺機能を評価した。ドライアイと涙腺機能障害の程度を反映するために、最も包括的で費用対効果が高く、正確な分析方法を選択しました。

ただし、この方法にはいくつかの制限もあります。動物モデルの構築には長い時間がかかるため、実験者は繰り返し注入する必要があります。現在、薬物ポンプや経皮パッチなど、手動注射に代わるいくつかの方法がありますが、それらの使用にはまだいくつかの合併症があります。投薬の頻度を減らし、合併症の発生を回避し、投与量の正確さを確保するために、より良い方法を適用する方法が私たちの次の目標です。結論として、スコポラミン注射によるドライアイ動物モデルを改良し、ADDEの涙腺機能障害の研究に実験的基礎を提供しました。

開示事項

著者らは、この手順で使用される薬物および材料に関連する潜在的な利益相反を有していません。

謝辞

この研究は、広東省高レベル臨床重点専門分野(SZGSP014)および深セン自然科学基金会(JCYJ20210324125805012)の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9%塩化ナトリウム溶液SJZ No.4 医薬品H13023201
4%パラホルムアルデヒド武漢Servicebio Technology Co., LtdG1113
無水エタノールSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.
フルオレセインナトリウム眼科用ストリップ天津Yinuoxinkang医療機器技術有限公司YN-YG-I
ヘマトキシリンとエオシン南京建城バイオエンジニアリング研究所D006
中性バルサム北京Solarbioサイエンス&;株式会社テクノロジー G8590
パラフィン北京Solarbio科学&テクノロジー株式会社YA0012
ヨウ素酸-シッフ染色キットBeyotime BiotechnologyC0142S
Schirmer涙試験ストリップ天津Yinuoxinkan医療機器技術有限公司YN-LZ-I
SCOPOLAMINE 臭化水素化水素上海マックリン生化学有限公司 S860151
小動物顕微鏡ヘッドバイオテクノロジー株式会社。LtdZM191
キシレンシノファーム化学試薬株式会社
10009218過10023418

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