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Summary

このプロトコルはデキストランの硫酸塩ナトリウムと結合されるアゾメタンによって引き起こされる潰瘍性coloproctitis準のcolorectal癌のマウス モデルを提供する。このモデルは、大腸がんの予防と治療における伝統的な漢方薬化合物の有効性を評価するために使用されました。

Abstract

大腸がん(CRC)は消化器系の一般的な悪性腫瘍であり、世界で3番目に多い悪性腫瘍であり、悪性腫瘍関連死因の第2位となっています。潰瘍性大腸炎(UC)は前癌性病変であり、UC関連CRC(UC-CRC)は大腸がんの最も一般的なサブタイプです。したがって、合理的なUC-CRCモデルは、新薬開発の基礎であり、保証です。漢方薬(TCM)は、その優れた有効性により、UC-CRCの治療に広く使用されています。中医学の古典的な強壮剤処方として、Liujunzi煎じ薬(LJZD)はUC-CRCの治療に広く使用されています。本研究では、アゾメタンとデキストラン硫酸ナトリウムを併用してUC-CRCモデルを確立し、LJZDを投与した。このデータから、LJZDは、マウスの体重、大腸の長さ、病理学的および炎症的因子、大腸バリア機能、およびがんマーカーを使用して、UC-CRCのがん転移を効果的に抑制できることが確認されました。このプロトコルは、UC-CRC の予防と治療における TCM の有効性を評価するためのシステムを提供します。

Introduction

大腸がん(CRC)は、一般的な消化器悪性腫瘍であり、世界で3番目に多い悪性腫瘍であり、世界で2番目に多い死因であり、世界のがん発生率の10%、がん関連死全体の9.4%を占めています^1,2。遺伝的要因、慢性炎症、高脂肪食、糖尿病、および異常な腸内細菌叢は、大腸がんの危険因子^です3,4。その中で、炎症性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎(UC)は、CRC ^5,6の明らかな危険因子です。UC関連CRC(UC-CRC)は、大腸の慢性炎症に基づく炎症、非定型過形成、および癌の移行過程であり、CRC ^7,8の典型的な腺腫-腺癌発生モデルとは異なります。一般集団と比較して、炎症性腸疾患の患者では大腸がんのリスクが約10〜40倍高くなります⁹。

現在、大腸がんの標準治療は依然として手術であり、腫瘍の位置と病期に応じて、放射線療法、全身薬物療法、またはその両方の組み合わせが可能です¹⁰。これらの伝統的な治療法は大きな進歩を遂げていますが、大腸がんの不均一性と再発率が高いため、予後は不良であり、治療効果は理想的ではありません^11,12。したがって、早期発見、早期診断、総合的治療が大腸がん患者の生存率向上の鍵であり、特に大腸がんから大腸がんへの転換に注意を払うことが重要である。長年にわたり、伝統的な漢方薬(TCM)は、その副作用が限られ、有効性が高いため、UC-CRCまたは慢性胃炎の治療において多くの注目を集めてきました。弁証法的治療に基づいて、さまざまな世代の有名な漢方医が、黄旗建中煎じ薬¹³、思順子煎じ薬¹⁴、思神丸薬¹⁵など、多数の古典的な処方箋を作成しました。

劉潤子煎じ薬(LJZD)は、明代に編纂されたYi Xue Zheng Zhuanの作品に由来し、TCM¹⁶の古典的な処方箋です。表1に示すように、LJZDは、Codonopsis pilosula (Franch.)ナンフ。(Dangshen)、Poriaのココス(Schw.)オオカミ(Fuling)、Atractylodesのmacrocephala Koidz。(Baizhu)、Glycyrrhiza uralensis Fisch。(ガンカオ)、柑橘類のreticulata Blanco(Chenpi)およびPinellia ternata(Thunb。気を補充し、脾臓を強化し、湿気を乾燥させ、痰を解消する効果があるブライト(Banxia)。現代の臨床現場では、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍の治療によく使用されます。現代の薬理学的研究は、LJZDおよび修正LJZDがUCおよび消化管癌の補助療法において高い適用価値を有することを示している17,18,19。

現在、UC-CRCマウスモデルを構築するには多くの方法がありますが、アゾキシメタン(AOM)/デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘導マウスモデルは、最も広く使用されているUC-CRCモデルです。臨床症状、形態学的、および病理学的観察により、このモデルがヒトのUC-CRCと非常によく似ていることが証明されています^20,21。まず化学発がん物質AOMで発がんを誘導し、その後マウスを黄砂の炎症刺激環境に連続的に曝露して、腸管粘膜上皮の継続的な損傷と修復をシミュレートし、UC-CRCマウスモデルを構築することを基本原理とする²²。本研究の目的は、短期的にAOMの腹腔内注射とDSSの周期的刺激によるUC-CRCのマウスモデルを確立し、UC-CRCに対する薬物の効果とLJZDの分子メカニズムを評価して、UC-CRCの治療に科学的根拠を提供することです。

Protocol

この動物実験は、長春中医薬大学倫理委員会によって承認されています(記録番号:2021214)。特異的病原体フリーC57BL/6Jマウス(8-10週、体重18-22g)の雌雄を、22°C、相対湿度65%の独立換気ケージに収容した。マウスは、水と食事を自由に利用できる適応摂食を7日行った後に実験を開始しました。

1. 薬剤の調製

1. LJZDの調製
   注:使用された漢方薬は長春中医薬大学付属病院から購入し、本物の漢方薬であることが確認されました( 表1参照)。
   1. 唐深(12g)、白珠(12g)、甘草(6g)、陳彡(12g)、江板霞(9g)を専用の陶器鍋に入れます( 材料表を参照)。1000 mLの蒸留水を加え、室温で1時間浸漬します( 図1Aを参照)。
   2. 粉末12gをグラインダーで微粉末にし、別の容器に蒸留水300mLを室温で1時間浸します。
   3. 専用の陶器鍋で上記の漢方薬を混ぜます。混合物を沸騰させ、300 mLの煎じ薬だけが残るまで中火で続けます。濾過には医療用ガーゼを使用し、濾液は室温で保存してください。
   4. 1000mLの蒸留水を加え、上記の煎じ薬操作をもう一度繰り返します。医療用ガーゼを使用して再度ろ過します。濾液を混ぜ合わせ、150mLになるまで煮沸します。
   5. 濃縮液を10,000× g で5分間遠心分離し、得られた上清をさらに中火で30mLに濃縮する。最終濃縮物を皿に移し、溶質だけが粉末として残るまで電気乾燥オーブンを使用して乾燥させます。
   6. 上記の固体を秤量し、滅菌蒸留水に溶解して、マウスの1日投与量である0.2mL(114.16mg/mL)あたり22.85mgの薬物を含む溶液を得る。
2. 5-アミノサリチル酸の調製
   注:5-アミノサリチル酸(5-ASA; 材料表参照)はUC-CRCに対して良好な予防効果があり、この研究²³で陽性薬として使用されました。
   1. 64 mg の 5-ASA 粉末を 200 mL の滅菌蒸留水に溶解して、1.82 mg/mL の 5-ASA 溶液を得ます。1匹のマウスの1日投与量は0.2mLでした。.
3. AOM注入液の調製
   1. 2.5 mLの滅菌蒸留水を25 mgのAOM粉末( 材料表を参照)に加え、ボルテックスミキサー( 材料表を参照)で混合して10 mg/mLのAOMストック溶液を作り、使用するまで-20°Cで保存します。
   2. AOM 原液を滅菌蒸留水で 10:1(1 mg/mL)に希釈して、AOM 注入液を調製します。

2. UC-CRCモデルの確立

注:実験は、対照群、モデル群、LJZD群、および5-ASA群の4つのグループに分けられ、各グループに10匹のマウスがいました。対照群を除く他の群はAOMおよびDSSで治療された。

1. AOM注射液の腹腔内注射
   注:7日間の適応給餌後、マウスに腹腔内注射によるAOM注射溶液(1 mg / mL)を投与しました( 図1Bを参照)。
   1. マウスの腹を上にして持ち、頭を少し下に向けます。背中の皮膚をつかんで腹部の皮膚を引き締め、1 mLのシリンジで腹部中央線上の両大腿部の根元の線の交点の約1cm右側に皮膚を突き刺します( 材料表を参照)。
   2. 1 mLシリンジ針を皮膚下3〜5 mmの距離まで押し、腹部の正中線と平行に保ち、針を0.3〜0.5 mm腹腔に45°挿入します。.
   3. 先端が腹筋を通過した後、オペレーターは突然の抵抗の喪失を感じます。続いて、シリンジを外側と後方に引いて、液体の浸透が起こるかどうかを観察します。そうでない場合は、AOM注入溶液を0.1 mL/10 gでマウスにゆっくりと押し込みます。
2. 2%DSS溶液のサイクリック刺激
   注:各AOM誘発マウスに3週目、6週目、9週目に500 mLのDSS溶液を投与し、この期間中、マウスは自由に飲んだ。
   1. 10 g の DSS に 500 mL の滅菌蒸留水を加えて 2% DSS 溶液を調製します ( 材料表を参照)。ボルテックスミキサーで混合し、使用するまで4°Cで保存してください。
   2. 各AOM誘導マウスは、AOM誘導後3、6、および9週目に500 mLの2%DSS溶液を7日間自由に飲みます。

3.薬物治療

注:成人の人間は、1日あたり63gのLJZDを必要とします。マウスとヒトの薬物投与量の換算式によると、マウスの等価実験用量(mg / kg)=ヒト用量(mg / kg)/体重(60kg)x 9.1であり、マウスの1日用量は約9.6 g / kgでした。

1. LJZD および 5-ASA 群を、調製した LJZD および 5-ASA 溶液 0.1 mL/10 g で、それぞれ 7 週目と 15 週目に胃強制経口投与で処理します。
   1. マウスの胃内投与については、以下の手順を行う。マウスを左手に持ち、右手で胃灌流装置を持ちます。注射針を口に挿入し、マウスの咽頭の後壁を滑り込ませます。マウスが飲み込むときに咽頭を滑り降り、前進を続けます。抵抗感があり、注射器を咽頭に押し込むことができたら、針を抜いて注射を完了します。
2. 対照群とモデル群を同量の生理食塩水で処理します( 材料表を参照)。
3. 各群のマウスを1日1回、投与期間中同じ時間に適切な薬剤で治療する。

4. UC-CRCモデルとLJZDの有効性評価

1. 疾患活動性指数スコア
   注: 表2によると、疾患活動性指数(DAI)スコアは、マウスの体重減少、糞便粘度、および便出血を組み合わせて評価しました。
   1. 適応摂食の開始から薬物治療の終了まで、マウスの体重を毎日記録します。
   2. 各実験マウスの糞便の粘稠度を注意深く観察し、排便を正常、軟便、水様性下痢の3つの状態のいずれかとして記録します。
   3. 実験動物の糞便出血を、出血なし、出血が少ない、便中の血液が見えるという3つの条件の1つとして記録します。
2. 血清中のIL-6レベルの検出
   1. マウスをLJZDまたは5-ASAで9週間治療します。左手でマウスの首の皮膚をつかみ、実験台を軽く押して外側褥瘡の位置を取り、マウスを固定します。ハサミでネズミのひげを切り落とします。マウスのひげをハサミで慎重に切り取り( 材料表を参照)、血液汚染を防ぎます。
      注:自由に小刻みに動くことができないマウスは、適切に固定されていると見なされました。これが起こらない場合は、マウスを修正する必要があります。
   2. 2%イソフルランを吸入してマウスを麻酔する。眼球の周りの皮膚をエタノールで殺菌します( 材料表を参照)。側面の目の皮膚をそっと押して、眼球をうっ血させて突き出させます。
   3. 肘ピンセットで眼球を固定し、眼球を正確かつ迅速に取り除きます。遠心チューブに血液を滴下させます( 材料表を参照)。その過程で、マウスの心臓をタップして採血を高速化します。
   4. 採取した血液を室温で30分間保存し、3,500× g で10分間遠心分離します。上清を採取し、IL-6含有量検出キットの指示に従ってIL-6レベルを検出します( 材料表を参照)。
3. 結腸直腸組織の分離
   1. 採血後、動物倫理に従って5%の過剰摂取イソフルランと子宮頸部脱臼を吸入してマウスを安楽死させます( 資料表を参照)。
   2. マウスを極低温解剖学的環境に保管します。マウスを仰臥位で固定します。下腹部の毛をハサミで切り、エタノールで殺菌します。
   3. まぶた鉗子で2つの大腿根と腹部正中線の交点をつまみます( 材料表を参照)。はさみで横切開を約1〜1.5cm切ります。
   4. 横切開の中間点から剣状突起に向かって腹部の正中線に沿って縦方向の切開を切ります。
   5. 肛門の方向に大腸周囲組織を切除し、結腸直腸を周囲の組織から分離します。大腸を傷つけないように注意してください。
   6. 腹部の皮膚を横に押して、結腸直腸を完全に露出させます。まぶた鉗子で腹腔から結腸直腸を取り除き、肛門から盲腸までのセグメントを切り取ります(除く)。全長は約10cm。得られた結腸直腸組織を4°Cの生理食塩水に保存します。
4. 直腸の長さと重さの評価
   1. 生理食塩水を5mLの針( 材料表参照)で4°Cで抽出し、結腸直腸の内部を洗い流します。次に、結腸を吸収紙の上に置き、組織の水分を吸収します。
   2. 結腸直腸組織の重さを量り、A4用紙に置いて長さを測定します。
5. 大腸の腫瘍の数を測定する
   1. 大腸を縦に切って完全に広げ、大腸内の腫瘍の数と大きさを観察します。
6. 結腸直腸の病理学的分析
   1. 結腸直腸を4%パラホルムアルデヒドで24時間固定します。固定された直腸組織を溶融パラフィンに埋め込み、組織凍結ミクロトームによって厚さ5μmで連続的に切片化します。
   2. Hou et ^al.24の手順に従って、切片をキシレンで脱ワックスし、次いで段階濃度のエタノールで脱水します。ヘマトキシリン溶液で5分間染色した後、切片を純水ですすいでください。その後、0.5%エオシン溶液で1分間染色します( 材料表参照)。
   3. 再度グラジエント脱水とキシレン透明処理を行う。切片を密封し、光学顕微鏡(材料表を参照)で観察し、Xie et al.25によって説明されているように写真を撮ります。
7. 大腸の免疫組織化学的分析
   1. 上記の方法に従って切片を脱ワックスし、脱水する。Gok et ^al.26 によって記述されているように、高圧熱修復技術で切片の抗原を修復します。
   2. 切片を内因性ペルオキシダーゼ遮断薬に室温で15分間浸します。ヤギの血清で切片を密封します( 材料表を参照)。
   3. 一次抗体ZO-1(1:1000)、オクルージン(1:1000)、KI67(1:500、 材料表参照)を切片に加え、4°Cで一晩インキュベートします。 切片をPBSバッファー( 材料表参照)で洗浄し、汎用二次抗体(1:5000、 材料表参照)を添加し、37°Cで30分間インキュベートします。
   4. DABソリューション( 材料表を参照)を発色用のセクションに追加します。切片をヘマトキシリン溶液で対比染色します。
   5. 脱水し、透明化し、切片を再び密封します。光学顕微鏡でタンパク質の発現を観察します。

Representative Results

Discussion

大腸がんは世界で最も多いがんの1つであり、毎年約1,148,000人が新たに発症し、576,000人以上が死亡しています。大腸がんは、遺伝性、散発性、UC-CRC³¹など、さまざまな原因に応じて3つのタイプに分けることができます。UCなどの炎症性腸疾患患者における大腸がんの発生率は、一般集団のそれよりも有意に高い。UCは、典型的な腺腫-腺癌経路とは異なる炎症性-がん経路を介して大腸がんの発症を刺激する⁶。現在、UC-CRCの原因は不明であり、主に長期の再発性慢性炎症によって引き起こされ、死亡率は最大60%です^32,33。UC-CRCには有効な治療法はなく、近年研究のホットスポットとなっています。UC-CRCの分子メカニズムを理解することは、UC-CRCの早期発見と正確な治療に不可欠です。

現在、UC-CRCの動物モデルを構築する方法は数多くあり、その形成メカニズムも異なります。IL-10またはMuc2/4遺伝子ノックアウトは、上皮バリア欠損を引き起こし、マウスに自然大腸炎を誘発する可能性があるため、UC ^34,35,36に関連する遺伝的欠損に基づいて動物CRCモデルを構築するためによく使用されます。それにもかかわらず、遺伝子ノックアウトによって誘導されるUC-CRCの動物モデルは、疾患の完全な病因をシミュレートすることはできず、その操作方法は複雑であり、実験は費用がかかり、明らかな限界があります。化学誘導は、UC-CRC動物モデルを構築するための古典的で一般的な方法です^37,38。DSS、AOM、およびジメチルヒドラジンはすべて、UC-CRCの構築に一般的に使用される化学誘導剤です。しかし、これらの化学試薬を単独で用いて動物モデルを確立するには長い時間がかかり、成功率は低い³⁹。研究によると、AOMとDSSの組み合わせによって誘発されるUC-CRCの発生率はほぼ100%に達する可能性があります⁴⁰。他の方法と比較して、AOM / DSSの組み合わせには、操作が簡単で、制御性が高く、サイクルが短く、複製率が高いという利点があり、病理学と分子メカニズムの観点からヒトUC-CRCをよりよくシミュレートできます^40,41,42。AOM/DSSサイクル刺激を用いてUC-CRCモデルを構築することには多くの利点があるが、モデリング時間が長く、モデリング試薬が高価であり、ヒトUC-CRCの病態を十分にシミュレーションできないという欠点もある。

UC-CRCの治療標的となる可能性を探るため、化学発がん物質であるAOMとDSS誘導マウスを併用し、UC-CRCモデルを確立しました。この研究では、AOMとDSSの周期的刺激に曝露されたマウスは、さまざまな程度のUC-CRC関連症状を示しました。対照群と比較して、モデル群のDAIスコアは有意に増加し、体重減少、血便、軟便、または水様性下痢として現れました。一方、LJZDはDAIスコアを大幅に低下させました。結腸直腸の長さの短縮は、UC-CRC^43,44 の炎症反応の重要なマーカーです。本研究では、モデルマウスの大腸長は対照群よりも有意に短く、LJZDは短くなった大腸を改善することができました。結腸直腸粘膜は慢性炎症を発症し、それが徐々に結腸直腸組織の非定型過形成に発展し、最終的には癌を引き起こす⁴⁵。本研究では、モデル群のマウスの大腸組織の腫瘍数が対照群と比較して有意に増加し、それに伴って大腸組織の重量も増加した。LJZD治療後、腫瘍数は有意に減少し、結腸直腸重量は減少した。LJZDは、UCによって誘導される大腸がんの形成に有意な阻害効果があることが示唆されています。以前の研究では、LJZDが炎症を緩和し、in vivoでTNF-α、IL-6、およびIL-1βの発現レベルを低下させることができることがわかっています16,28,46。この研究では、モデル群のマウスの血清IL-6レベルは増加しましたが、LJZD処理後に血清IL-6の産生が有意に阻害されました。

AOM/DSS処理マウスでは、直腸組織の炎症性浸潤、粘膜バリアの破壊、粘液分泌の減少、杯細胞の不規則または消失、腸陰窩の歪みまたは萎縮、および腺構造の明らかな障害が観察されました。LJZD治療後、結腸直腸組織における杯細胞の形態は正常であり、凹部と腺の構造は規則的であり、粘膜バリアへの損傷は改善されました。上皮タイトジャンクション(TJ)は、主にZO-1やオクルージン²⁹など、細胞の完全性と透過性を維持するために不可欠な機械的障壁です。UC-CRC患者の結腸直腸組織におけるZO-1などのTJタンパク質の発現が有意に減少することが報告されています^47,48。本研究により、UC-CRCマウスの大腸粘膜組織構造が破壊され、組織中のZO-1とオクルージンの発現が減少する一方、LJZDはこの減少を逆転させる可能性があり、LJZDがZO-1とオクルージンの発現を増加させることにより、大腸粘膜バリアの完全性を保護する可能性が示唆されました。核随伴抗原(KI67)は、細胞周期調節に不可欠な要素であり、腫瘍細胞の増殖活性の指標として広く使用されている^30,49。この研究では、KI67タンパク質の発現が対照群と比較してモデル群で増加し、結腸直腸組織における有意な腫瘍細胞の増殖を示しました。LJZD治療後、KI67タンパク質の発現が減少し、LJZDがUC-CRCに良好な効果を有することが示された。

要約すると、AOM腹腔内注射とDSS循環刺激は、短期間でUC-CRCモデルを効果的に確立でき、組織病理学と分子形成メカニズムの点でヒトUC-CRCに似ています。古典的な処方箋として、LJZDはDAIスコア、結腸直腸組織重量、および炎症因子レベルを低下させ、結腸直腸長の短縮を効果的に阻害し、UC-CRCマウスのUCの段階で役割を果たすことができます。同時に、TJタンパク質の発現を増加させ、結腸直腸組織の病理学的損傷を大幅に改善し、KI67タンパク質の発現を減少させ、組織腫瘍の発生率を大幅に低減し、UCからCRCへの変換プロセスを阻害することができます。この研究は、UC-CRCの治療に新しいアイデアを提供します。

Materials

Azoxymethane	Sigma	A5486
5-amino salicylic acid	Kuihua Pharmaceuticals Group Jiamusi Luling Pharmaceutical Co., Ltd	3819413
C57BL/6J mice	Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd	NO 210726210100853716
Cover slip	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd	10212432C
DAB color development kit	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd	2005289
Dewatering machine 	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JJ-12J
Dextran sulfate sodium	Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd	MB5535
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Hematoxylin-eosin dye	Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd	B1000
IL-6	Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd	MM-0163M2
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22-10
KI67 primary antibody	Google Biotechnology Inc	GB121141
Neutral gum	Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd	10004160
Object slide	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd	10212432A
Occludin primary antibody	Affnity	DF7504
Orthostatic optical microscope	Nikon	Nikon Eclipse CI
Pathological microtome	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016
ZO-1 primary antibody	Abcam	ab221547