ヒト真皮線維芽細胞を用いた自己組織化細胞シート培養の実証と3次元腱・靭帯様オルガノイドの手動生成

Summary

ここでは、腱の基礎研究に有望なツールと、腱組織工学のための潜在的な足場のない方法を提供する3ステップオルガノイドモデル(2次元[2D]拡張、2D刺激、3次元[3D]成熟)を実証します。

Abstract

腱と靭帯(T / L)は、筋骨格系を結合する強力な階層的に組織化された構造です。これらの組織は、厳密に配置されたコラーゲンI型に富む細胞外マトリックス(ECM)とT/L系統細胞を主に平行に並べています。怪我の後、T/Lはリハビリテーションに長い時間を必要とし、故障のリスクが高く、多くの場合、満足のいく修復結果が得られません。近年のT/L生物学研究の進歩にもかかわらず、残された課題の1つは、T/L分野には、 in vitroでT/L形成プロセスを再現できる標準化された分化プロトコルがまだないことです。例えば、間葉系前駆細胞の骨と脂肪の分化には、標準的な2次元(2D)細胞培養と特異的刺激培地の添加のみが必要です。軟骨への分化には、3次元(3D)ペレット培養とTGFβの補給が必要です。しかし、腱への細胞分化には、非常に整然とした3D培養モデルが必要であり、理想的には動的な機械的刺激にもさらされる必要があります。私たちは、自己組織化された細胞シートから3次元の棒状構造を形成する3段階(膨張、刺激、成熟)のオルガノイドモデルを確立し、ECM、オートクライン、パラクリン因子を持つ自然な微小環境を作り出しています。これらの棒状オルガノイドは、豊富なECM内に多層の細胞構造を持ち、静的な機械的ひずみにさらされても非常に簡単に扱うことができます。ここでは、市販の真皮線維芽細胞を用いて3ステップのプロトコールを実証しました。この細胞タイプが、強固でECMに富んだオルガノイドを形成することを示すことができました。記載された手順は、培地に関してさらに最適化され、動的軸方向の機械的刺激に向けて最適化され得る。同様に、代替細胞源は、T/Lオルガノイドを形成し、T/L分化を起こす可能性についてテストすることができます。要するに、確立された3D T/Lオルガノイドアプローチは、腱の基礎研究のモデルとして、さらには足場のないT/Lエンジニアリングにも使用できます。

Introduction

腱と靭帯(T / L)は、体に不可欠なサポートと安定性を提供する筋骨格系の重要な構成要素です。これらの結合組織は、その重要な役割にもかかわらず、変性や損傷を起こしやすく、痛みや運動障害を引き起こします¹。さらに、それらの限られた血液供給と遅い治癒能力は慢性的な怪我につながる可能性がありますが、老化、反復運動、不適切なリハビリテーションなどの要因は、変性や怪我のリスクをさらに高めます²。安静、理学療法、外科的介入などの従来の治療法では、T/Lの構造と機能を完全に回復させることはできません。過去数年間、研究者は T/L 障害の効果的な治療法を模索するために、T/L の複雑な性質をよりよく理解しようと努めてきました ^3,4,5。T/Lは、主にI型コラーゲン線維とプロテオグリカンで構成される、階層的に組織化された細胞外マトリックス(ECM)優位の構造によって区別されますが、これはin vitroで再現することが困難な特徴です⁶。従来の2次元(2D)細胞培養モデルは、T/L組織の特徴的な3次元(3D)組織を捉えることができず、翻訳の可能性を制限し、T/L再生の分野における革新的な進歩を妨げていました。

近年、3Dオルガノイドモデルの開発により、基礎研究や様々な^{組織タイプのス}キャフォールドフリー組織工学を前進させる新たな可能性がもたらされました7,8,9,10,11,12,13。例えば、筋腱接合部を調査するために、Larkin et al. 2006は、ラット尾腱に由来する自己組織化腱セグメントとともに3D骨格筋構造を開発した¹⁰。さらに、Schiele et al. 2013は、マイクロマシニングされたフィブロネクチン被覆成長チャネルを使用することにより、ヒト真皮線維芽細胞の自己組織化を指示し、3D足場の助けを借りずに細胞線維を形成することを示し、胚性腱発生の重要な形質を捉えることができるアプローチ^である11。Florida et al. 2016による研究では、骨髄間質細胞が最初に骨と靭帯の系統に拡大され、次に自己組織化された単層細胞シートを生成するために使用され、次に実装されて、靭帯再生の理解を深めることを目的としたモデルである、天然の前十字靭帯を模倣した多相性の骨-靭帯-骨構造を作成しました¹².腱のメカノトランスダクションプロセスを解明するために、Mubyana et al. 2018は、単一の腱繊維を作成し、機械的負荷プロトコル¹³にかける足場のない方法を利用しました。オルガノイドは、組織の本来の構造、微小環境、機能性を模倣した自己組織化された3D構造です。3Dオルガノイド培養は、組織や臓器の生物学、病態生理学を研究するための、より生理学的に適切なモデルを提供します。このようなモデルは、異なる幹細胞/前駆細胞型の組織特異的分化を誘導するためにも使用できます^14,15。したがって、T/L生物学および組織工学の分野で3Dオルガノイドモデルを実装することは、非常に魅力的なアプローチになります^9,16。オルガノイド集合体に代替の細胞源を実装し、テノイド分化に向けて刺激することができます。この研究でデモンストレーションに使用された関連する細胞タイプの1つは、真皮線維芽細胞^7,17,18です。これらの細胞は、骨髄穿刺や脂肪吸引に比べて侵襲性が低く、増殖能力が高いため、かなり迅速に大量に増殖できる皮膚生検手順によって簡単にアクセスできます。対照的に、T/L常在性線維芽細胞などのより特殊な細胞タイプは、単離と増殖がより困難です。したがって、真皮線維芽細胞は、人工多能性胚性幹細胞に向けた細胞リプログラミング技術の出発点としても使用された¹⁹。T/Lの形成と維持を含むさまざまな細胞プロセスの主要な調節因子として作用することが報告されているトランスフォーミング成長因子-β3(TGFß3)などの特定の3D培養条件とシグナル伝達の手がかりに真皮線維芽細胞をさらすと、腱特異的遺伝子の発現とT/L典型的なECMの沈着につながるin vitroのテノジェニック分化を増強できます^20、21.

ここでは、市販の正常な成人ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)を細胞源として使用して、以前に確立および実装された3ステップ(2D拡張、2D刺激、および3D成熟)オルガノイドプロトコルについて説明し、実証し、 in vitro 腱形成を研究するための貴重なモデル^{を提供します7。}このモデルは in vivo T/L組織と同等ではないという事実にもかかわらず、細胞分化メカニズムの調査、 in vitroでのT/L病態生理学の模倣、およびT/L個別化医療および薬物スクリーニングプラットフォームの確立に使用できる、より生理学的に関連性の高いシステムを提供します。さらに、将来的には、3Dオルガノイドが、天然のT/L組織の寸法や構造的および生物物理学的特性によく似た、スケールアップされた機械的に堅牢な構造の開発に利用できるだけでなく、さらなる最適化によって、足場のないT/Lエンジニアリングに適しているかどうかを評価することができます。

Protocol

注:すべてのステップは、無菌技術を使用して実行する必要があります。

1. NHDFの培養と事前拡大

1. 成人の凍結保存された正常なヒト皮膚線維芽細胞(NHDF、1 x 10⁶ 細胞)を含むクライオバイアルを、ほぼ解凍するまで37°Cで急速に解凍します。
2. 1%ペニシリン/ストレプトマイシン(ペン/連鎖球菌)を補充した1mLの予熱した線維芽細胞増殖培地2(基礎培地、2%ウシ胎児血清(FCS)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、インスリンを含むすぐに使用できるキット)をゆっくりと加え、37°Cで細胞に予熱します。
3. 細胞を15mLの遠心チューブに移します。細胞を300 x g で室温(RT)で5分間遠心分離します。
4. 上清を取り除きます。細胞ペレットを予熱したNHDF培地12mLに再懸濁します。
5. 細胞をT-75フラスコに移し、横方向に短く振る。T-75フラスコを37°Cで5%_CO2 加湿インキュベーターに入れます。
6. 2日ごとに媒体を交換してください。NHDFが70%〜80%の合流度に達するまで顕微鏡で観察します。

2. 2D拡張

1. インキュベーターのT-75フラスコを取り出し、NHDF培地を取り出します。予熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。
2. 0.05%トリプシン-EDTAを3mL細胞に加えます。細胞がフラスコから剥がれるまで(約3分間)、5%_CO2 加湿インキュベーターで細胞を37°Cでインキュベートします。
3. 予熱したNHDF培地6mLを加えて、トリプシン作用を中和します。細胞を15mLの遠心チューブに移します。
4. 細胞を300 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を除去します。
5. 細胞ペレットを、10%ウシ胎児血清(FBS)、1x MEMアミノ酸、1%ペン/連鎖球菌を添加したダルベッコのModified Eagles Medium(DMEM)低グルコースに再懸濁し、37°Cで予熱します。
6. NHDFを10cmの接着細胞培養皿に8×10³ NHDF/cm 2(合計4.4×10 5 NHDFs/^cm2 )の密度でプレートする(合計で、10cm皿あたり4.4×10×⁵ NHDFs)。横にやさしく揺らします。
7. 10 cmの細胞培養皿を37°Cで5%_CO2 加湿インキュベーターに入れます。2日ごとに媒体を交換する
8. 100%のコンフルエントに達するまで顕微鏡で細胞をモニターします(約5日)。

3. 2D刺激

1. NHDFを含む10cmの細胞培養皿(ステップ2.6および2.7)をインキュベーターから取り出します。培地を取り出し、予熱したPBSで細胞を洗浄します。
2. 10% FBS、50 μg/mL アスコルビン酸、および 1% ペン/溶連菌を添加した DMEM 高グルコース培地 10 mL を 37 °C で予温して加えます。
3. ペトリ皿を37°Cの5%_CO2 加湿雰囲気に置きます。2日ごとに媒体を交換してください。
4. NHDFを顕微鏡で14日間監視します。

4. 3D成熟

1. インキュベーターから10cmの細胞培養皿を取り出し、DMEM高グルコース培地を取り出します。
2. 形成された細胞シートを細胞スクレーパーで皿から穏やかかつ迅速に剥離する。剥離しながら、同時に細胞シートを3D棒状オルガノイドに丸めます。
3. NHDFオルガノイドを手に取り、10cmの非接着性(細胞用)シャーレに入れます。このディッシュタイプは、オルガノイドからプラスチックへの細胞の流出を防ぐために使用されます。
4. この時点または翌日(3D成熟の0日目または1日目)に、湿重量、組織学的評価(1日目のオルガノイドはよりコンパクトになるため好ましい)、RNAおよびタンパク質の単離などのさらなる分析のために、いくつかのオルガノイドを採取します。
5. オルガノイドの端を金属ピンで次のように固定します。
   1. オルガノイドの片側をピンセットで注意深く保持し、別のピンセットで、軸方向伸び約10%の手動ストレッチを静かに適用します。軸方向の伸びを10%見積もるには、ミリメートル紙または定規を使用します。
   2. 次に、ピンセットで金属ピンを1本手に取り、オルガノイドの端からプラスチック皿に手動で押し下げて固定します。オルガノイドの2番目の端に2番目のピンでこの手順を繰り返します。
6. 10% FBS、1x MEM アミノ酸、50 μg/mL アスコルビン酸、10 ng/mL TGFβ3、および 1% ペン/連鎖球菌を添加した DMEM 高グルコース培地 10 mL を 37 °C で予温して加えます。
7. 10cmの皿を37°Cの5%_CO2 加湿雰囲気に置きます。2日ごとに媒体を交換してください。
8. オルガノイドを14日間定期的に観察してください。
   注意: ピンが緩む可能性があるため、手順4.5で説明したのと同じ方法を使用して再固定します。
9. 14日後、オルガノイドからDMEM高グルコース培地を取り出します。予熱したPBSでオルガノイドを洗浄します。
10. 精密スケールを使用して、0日目と14日目のオルガノイドの湿重量を測定します。
    1. 空の10cm皿をはかりに置き、重量をゼロにすることで、オルガノイドの重量のみが測定されるようにします。10cm皿から培地を完全に取り出し、オルガノイドの湿重量を1つずつ測定します。
       注:この研究では、0日目にドナーあたり3つのオルガノイドを、14日目にドナーごとに2つのオルガノイドを計量しました。
11. 研究目的に応じて、NHDFオルガノイドの一部をさらに組織学的分析に導入するか、その後のDNA、RNA、およびタンパク質の単離のために滅菌DNA/RNAフリーチューブを使用して液体窒素で直ちに凍結し、-80°Cで保存します。
12. 組織学的調査では、各オルガノイドをPBS(中性pHに調整)した予冷(4°C)4%パラホルムアルデヒド5mLに氷上で45分間固定し、続いて室温(各2 x 5分)でPBS洗浄します。
13. 組織学用のガラス瓶にオルガノイドを入れて、ショ糖勾配を使用して固定オルガノイドを凍結保護します。オルガノイドを10%ショ糖のPBS溶液中で4°Cで2時間インキュベートし、続いて20%スクロース/PBSを4°Cで2時間インキュベートし、最後に30%スクロース/PBSを4°Cで一晩インキュベートします。 最初にピペッティングしてスクロース溶液を交換し、次に新しい溶液で満たします。
14. オルガノイドをクライオ培地に埋め込みます。
    1. 発泡スチロールの箱に入れたドライアイスの上に銅板を置き、10分間冷まします。
    2. 次に、クライオメディウムをあらかじめ充填したプラスチック製のクライオモールドを銅板の上に置き、ピンセットを使用してオルガノイドをクライオモールドの底にそっと押し付けます。凍結培地が完全に凍結するまで待ちます。
    3. 長いオルガノイドの場合は、まずメスで半分に切り、2つの半分を互いに平行に冷凍金型に入れます。組織学的分析を受けることを意図した各オルガノイドについて手順を繰り返します。
15. 凍結切片まで-20°Cでサンプルを保管します。
16. クライオトームを使用して、オルガノイドを縦方向に厚さ10 μmの切片に切断し、標準プロトコル⁸を使用してヘマトキシリンやエオシン(H&E)などの組織学的染色を行います。

Results

3D T/Lオルガノイドモデルは、市販のNHDFを実施することで以前に確立され、ここで実証されました(n = 3、ドナーあたり3つのオルガノイド、NHDFは継代5〜8で使用されました)。モデルのワークフローを 図 1 にまとめます。 図2 は、T-75フラスコでの膨張前(図2A)と、10cm細胞培養皿での2D増殖ステップでの培養の開始時と5日間の培養後(図2B)のNHDF培養の代表的な位相差画像を示しています。 図2C (代表的な位相差画像)は、10cmの細胞培養皿で14日間培養した後の2D刺激中のNHDFの合流を示しています。続いて、細胞シートを手作業で剥離し、同時に3D棒状オルガノイド(0日目、オルガノイドの長さは約6cm、幅約0.4cm)に圧延し、10%の静圧下で14日間培養しました(図3、0日目と14日目、代表的な巨視画像)。3D成熟プロセスの14日目までに、オルガノイドは輝く白い外観を示し、収縮し、最初のオルガノイドよりも密度が高いように見えました。オルガノイドの湿重量は、形成時(0日目)と3D成熟ステップの14日目に測定されました(図4)。湿重量の有意な減少が観察され、このプロトコルステップの期間中のオルガノイド内の収縮とECM構造の再編成が示されました。体重の変化に加えて、収縮によりオルガノイドの長さも減少しました(14日目のオルガノイドの長さは約3.5cm、幅は約0.3cm)。このプロセスでは、金属ピンが緩み、再固定する必要がありました。したがって、3D成熟の14日間は、オルガノイドを頻繁にモニタリングすることをお勧めします。オルガノイドの形態を評価するために、3D成熟ステップの1日目と14日目に採取したNHDFオルガノイドから縦切片を取得し、H&E染色を行いました(図5)。1日目、オルガノイドは、主に少量のECMに囲まれた細胞で構成される切断された層を示しました。さらに、オルガノイド層内の細胞は、加えられた静的引張荷重の方向として使用される縦方向のオルガノイド軸に沿って整列しませんでした。NHDFの核は、さまざまなサイズと形状の丸い形を示しました。14日目のオルガノイドのH&E分析では、エオシンシグナルの顕著な増加が明らかになり、3D成熟過程でのECM沈着が示唆されました。この時点で、オルガノイドは融合した層を示し、その領域には整列した細胞が含まれていました。細胞はしばしばグループに分かれていました。ただし、一部の場所ではセル列にも編成されていました。核の大部分は同様のサイズを持ち、時には細長いこともありました。

図1:2D拡張、2D刺激、3D成熟の3つのステップで構成される3D T/Lオルガノイドモデルの漫画。 当初、NHDFはT-75フラスコで70%〜80%の合流に達するまで事前に拡張されていました。続いて、10cmの細胞培養皿にDulbeccoのModified Eagles Medium(DMEM)低糖培地を用いて5日間NHDFを培養しました(2D増殖)。次に、アスコルビン酸を添加したDMEM高グルコース培地で細胞を14日間の培養(2D刺激)で刺激しました。続いて、NHDFを10cmの付着皿から切り離し、3D棒状オルガノイドに巻いて移動させ、アスコルビン酸と形質転換成長因子β3(TGFß3)を添加したDMEM高グルコース培地で満たされた10cmの非接着性細胞培養皿に14日間固定しました(3D熟成)。形成された3Dオルガノイドは、0、1、14日目などの異なる時点で、湿重量の評価、組織学的評価、RNAおよびタンパク質の単離、およびその他の分析(透過型電子顕微鏡法、生体力学的測定など)を受けることができます。漫画はBioRenderソフトウェアで生成されました。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2:膨張前、2D膨張、および2D刺激ステップ中のNHDFの代表的な位相コントラスト画像(A)T-75フラスコでの膨張前処理中のNHDF。(B)10cm細胞培養皿中の2D増殖ステップの1日目および5日目のNHDF。(C)2D刺激の1日目および14日目のNHDFは、10cmの細胞培養皿にステップします。スケールバー:200μm。画像は、高解像度カメラを搭載した倒立顕微鏡で撮影しました。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3:NHDF 3Dオルガノイドの総形態。 3D成熟ステップの0日目と14日目のNHDFオルガノイドの代表的な巨視画像。スケールバー:1cm。画像は携帯電話のカメラで撮影されました。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4:NHDF 3Dオルガノイドの湿重量分析。 オルガノイドの湿重量測定は、3D成熟プロセスの終わりである0日目と14日目に行われました。グラフは平均値と標準偏差(NHDF n = 3、0日目に3人のオルガノイド/ドナー、1日目に組織型検査のために採取された1人のオルガノイド/ドナーのために14日目に2人のオルガノイド/ドナー)を示しており、各ドットは個々のオルガノイドを表し、各色付きの形状は異なる個々のドナーを表しています。データは平均±標準偏差として表され、対応のないパラメトリックt検定が使用されました。統計上の差:**p ≤0.01。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図5:NHDF 3Dオルガノイドの組織学的解析。 1日目と14日目の3D成熟プロセス中に、NHDFオルガノイドのヘマトキシリンとエオシン(H&E)が染色された切片の代表的な画像。右の画像 - 低倍率の画像、左の画像 - 次のようなインジケーター付きの拡大ビュー:黄色の矢印 - 切断されたレイヤー。黄色の矢じり - さまざまなサイズと形の核。黒い矢印 - 融合層とECM堆積。黒い矢じり - 細胞列、同様のサイズと伸びを持つ核。黒い星 - グループ内のセル。スケールバー:100μmこの 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

Discussion

この研究で実証された結果は、T/L 組織を研究するための NHDF 3D オルガノイド モデルの確立と特性評価に関する貴重な洞察を提供します。3ステップのプロトコルにより、T/Lニッチの典型的な特徴を示す3D棒状オルガノイドが形成されました。このモデルは、以前にKroner-Weigl et al.2023 :⁷ で報告されており、ここで非常に詳細に実証されています。

図2に示す位相差画像は、膨張および刺激ステップ中のNHDFコンフルエンスとシート形成の進行を示しました。3D成熟プロセスは、細胞シートを手作業で3D棒状オルガノイドに圧延し、静的な張力下で14日間培養することによって行われました。オルガノイドは、14日目までに輝く白色の外観と密度の増加を示し、オルガノイド内の収縮と構造的再編成を示唆しています。このことは、成熟期が、より組織化されたT/L組織模倣構造を達成するために重要であることを示しました。

さらに、重量分析により、0日目から14日目の間にオルガノイドの湿重量が有意に減少したことが明らかになり、成熟過程におけるオルガノイド内の有意な収縮とECMの再編成が再び示されました。重要なことに、湿重量測定値は、オルガノイド内または皿内の取り扱いおよび残留培地のために、実験間で異なる場合があります。さらに、オルガノイドは、後述するように、0日目に細胞シート圧延によって形成された層が分離され、融合していないため、最初はより多くの培地を含む可能性があります。時間が経つにつれて、層は結合してよりコンパクトになり、したがって、媒体が押し出される可能性があります。

H&E染色による形態学的評価により、オルガノイドの構造特性に関するさらなる洞察が得られました。1日目、オルガノイドは、主に薄い細胞周囲ECMに囲まれた丸い核を持つ細胞で構成される切断された層を示しました。引張荷重の軸に平行な細胞整列の欠如は、オルガノイドのより組織化された細胞およびECM構造を達成するためにさらなる成熟が必要であることを示唆した。1日目から14日目の間に収縮とオルガノイドの重量と寸法の減少にもかかわらず、H&E染色ではエオシン陽性領域の増加が示され、ECM沈着の増強が示唆されました。さらに、目に見える層はなくなり、細胞は細長い核を持ち、平行な細胞列に配置されることもありました。このことから、オルガノイド内の細胞は、ECMの沈着、構造、アライメントだけでなく、自身の配置を変えることで自己組織化し、天然のT/L組織形成の挙動を模倣していることが指摘されました。

全体として、これらの知見は、T/L生物学の研究、 in vitro 腱形成、さらには足場のないT/L工学のさらなる開発のための貴重なツールとしてのNHDFオルガノイドモデルの可能性を浮き彫りにしています。しかし、3Dオルガノイドモデルの取り扱いを成功させるための3つの重要なステップがあります:1)プロトコルの2D刺激段階でのタイトな細胞シートの形成。初代細胞を使用する場合、これは主にドナー細胞の特性に依存します。したがって、複数のドナーを並行して評価することが重要です。2)セルシートの手動圧延。これには、すばやく転がす必要がありますが、同時に、セルスクレーパーを使用してセルシートを穏やかに転がします。したがって、最初にこの手順を訓練するために最初のオルガノイドを計画することをお勧めします。3)オルガノイドの端にピンを安定して固定すること。この固定により、オルガノイドの軸方向の伸びが確保され、変形や塊状の構造への崩壊が防止されます。また、3次元成熟期にはECMのリモデリングを経験するため、ピンが突然外れてしまうことがあるため、各オルガノイドをこまめにモニタリングし、ピンを固定し直すことが重要です。

現在のモデルは、まだT/L組織に対する 生体内 模倣のレベルに達しておらず、多くの制限を抱えています。例えば、オルガノイド 当たり の細胞数が多く、手順が完了するのに35日を必要とするが、3D軟骨原性ペレットモデルなどのほとんどの分化プロトコルは21日に設定されている²²。プロトコル手順の洗浄ステップは、 in vitroで培養された初代ヒト細胞に代謝上の影響を与える可能性のあるPBSではなく、生理学的にバランスの取れた洗浄緩衝液、例えば、Hanks Balanced Salt Solution(HBSS)またはEarles Balanced Salt Solution(EBSS)を用いて実施することが望ましい。オルガノイドの2D刺激および3D成熟段階で使用される培地に関しては、DMEMと10%FBS製剤が選択されたのは、それが広く受け入れられている分化プロトコルの基礎であり、オルガノイド形成特性について異なる細胞タイプ間で標準化および比較することを意図しているためです²³。.異なる実験室環境での3ステップオルガノイドプロトコルの再現は、使用する細胞の種類、細胞の質と継代、およびドナー依存性細胞の特性によって影響を受ける可能性があります。装置のばらつき、特に2D刺激段階で使用された10cmの細胞培養皿²⁴ の品質は、細胞シート形成の頑健性に潜在的に影響を及ぼす可能性がある。さらに、3D成熟に伴うECM収縮により、ピン を介した オルガノイドの軸方向の固定が緩む可能性があります。そのため、前述のように、こまめなモニタリングが推奨されます。直径および強度に関して異なるピンをテストおよび選択することも、ピンの脱落のリスクを低減することができる²⁵。ただし、手動ストレッチにピンを使用すると堅牢ではなく、ばらつきを処理する傾向があります。したがって、追跡研究では、オルガノイドのエッジを保持するためのクランプメカニズムを開発することが非常に重要であり、このステップの標準化につながるだけでなく、オルガノイドの動的伸張を可能にすることもできます。一般に、オルガノイドモデルを変更する2つの方法、1つはオルガノイド あたりの 細胞数と手順時間を減らし、特に in vitro 研究でよりユーザーフレンドリーにすること。そして2番目のアップスケーリング-潜在的な腱置換戦略として大型動物モデルでオルガノイドの挙動をテストするために、オルガノイドの寸法を大きくします。

ここで実証されたモデルは、オルガノイドが異なる細胞タイプと組み合わされて微小破裂した場合の腱の発達、病態生理学、そしておそらく修復と再生の根底にあるメカニズムを調査するためのプラットフォームを提供できます。Kroner-Weigl et al. 2023⁷ の研究では、NHDFによって形成されるオルガノイドはT/L細胞由来のオルガノイドよりも大きく、細胞性が高いため、細胞の増殖や挙動を制御することが困難であるという、NHDF細胞の種類に関するいくつかの限界が特定されたことに言及することが重要です。細胞アポトーシスに関しては、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL)ベースのアッセイでは、14日目⁷のオルガノイド全体に死細胞の証拠は示されず、3D成熟ステップ中に栄養素、老廃物、および酸素が適切に拡散したことが示唆されました。興味深いことに、形態学的な違いにもかかわらず、多くのT/L関連遺伝子(異なるコラーゲンタイプ、強膜(SCX)、モホーク(MKX)などを含む)の定量的PCRによるパイロットスクリーニングは、NHDFとT/Lオルガノイドの間で同等の遺伝子発現を示唆した⁷。したがって、この細胞タイプでは、T/L分化をサポートするためにさらなる最適化が必要であり、2D刺激および3D成熟ステップで使用される培地(血清濃度、成長因子、ビタミンなど)を調整し、成熟時間を延長したり、オルガノイドを動的な機械的伸張にさらしたりすることに基づくことができます。プロトコルを進化させることで、オルガノイドの組成、構造、機能特性がさらに改善され、複合体の in vivo T/L組織ニッチをよりよく模倣できるようになります。さらに、代替細胞源は、T/Lオルガノイドを形成する能力と、T/L分化を受けることができるかどうかを調べることができます。Yan et al. 2020⁹は、若年/健常および高齢/変性腱幹/前駆細胞(Y-TSPCおよびA-TSPC)を使用して3Dオルガノイドモデルを採用し、細胞の挙動と、T/Lの老化によって腱形成能力が変化するかどうかを3Dで調べました。彼らは、A-TSPC 3Dオルガノイドは組織形態が悪く、内部の細胞は増殖速度が低いが、老化関連マーカーのレベルの上昇と並行してアポトーシスが高いことを報告しました⁹。したがって、T/L 3Dオルガノイドモデルは、腱の老化に関与する分子および細胞メカニズムを研究するための有望なプラットフォームであり、さらに、腱の修復と再生のための新しい薬理学的治療法をテストするために使用できます。別のアプローチとして、Chu et al. 2021は、靭帯形成の分化を評価するために、3Dオルガノイドモデルに歯科卵胞細胞(DFC)を実装しました。この細胞型は非常によく組織化されたオルガノイドを形成し、DFCが歯周靭帯(PDL)組織で分化するための魅力的な細胞源であることを示唆しており、歯周炎の有望な治療戦略を開発できる可能性があります⁸。

将来的には、異なる細胞タイプ(筋線維芽細胞、マクロファージなど)を含めることで、モデルはさらに複雑になる可能性があり、オルガノイド内の細胞特異的挙動と細胞クロストークに関する新しい洞察を提供し、T/L生物学、生理学、病態生理学のより包括的な理解に貢献する可能性があります8,9,16,26。

3Dオルガノイドモデルは、組織工学や再生医療の用途にいくつかの利点があります。それらは、ヒト組織の細胞組成と組織、および細胞間および細胞間および細胞とマトリックスの相互作用を厳密に模倣し、それによって疾患メカニズムと薬物応答を研究するための生理学的に適切なプラットフォームを提供します²⁷。オルガノイドは、さまざまな薬剤の有効性だけでなく潜在的な副作用を評価するためのハイスループットスクリーニングプラットフォームとして使用でき、動物実験に代わる信頼性が高く低コストの代替手段を提供します。さらに、健康な状態と病気の状態を直接比較できるため、さまざまな病状に関連する重要な分子および細胞の変化の発見、早期疾患発見のためのバイオマーカーの特定、疾患メカニズムの高度な理解の促進、および標的療法の開発が可能になります^28,29。

まとめると、T/L組織生物学とさまざまな細胞タイプの in vitro テノジェニックプロセスを研究するための有望なプラットフォームを提供する、以前に確立された3D T/Lオルガノイドモデルのステップを非常に詳細に示しました。このモデルのさらなる実装、最適化、および研究は、足場のない T/L エンジニアリング戦略の進歩につながり、ひいては T/L 療法の改善に貢献できる可能性があるため、強く推奨されます。

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List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アスコルビン酸	Sigma-Aldrich、タウフキルヒェン、ドイツ	A8960
10 cm接着細胞培養皿	Sigma-Aldrich、タウフキルヒェン、ドイツ
10cm非粘着性シャーレ	Sigma-Aldrich、タウフキルヒェン、ドイツ
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, オランダ	4583
クライオモールド規格	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-スクロース	AppliChem Avantor VWR International GmbH、ダルムシュタット、ドイツ	A2211
DMEM高グルコース媒体	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
ウシ胎児血清	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
線維芽細胞増殖培地 2	PromoCell、ハイデルベルク、ドイツ	C-23020
H&E染色キット	Abcam	ab245880
高解像度カメラ付き倒立顕微鏡	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with Axiocam 506
MEMアミノ酸	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
メタルピン	EntoSphinx、パルドゥビツェ、チェコ共和国	04.31
正常なヒト真皮線維芽細胞	PromoCell、ハイデルベルク、ドイツ	C-12302
パラホルムアルデヒド	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco、Thermo Fisher Scientific、ダルムシュタット、ドイツ	15140122
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, ヴィースバーデン, ドイツ	8420-B3
トリプシン-EDTA 0,05%DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	トライ-1B