ヒト好中球における好中球細胞外トラップ形成を定量化するリアルタイムハイスループット技術(英語)

サマリー

本稿では、膜透過性依存性二重色素アプローチと組み合わせた生細胞解析システムを利用して、好中球細胞外トラップ(NET)を定量する自動化されたハイスループット法を紹介します。

要約

好中球は、自然免疫系の重要な部分を形成する骨髄系細胞です。過去10年間で、好中球ががん、自己免疫疾患、およびさまざまな急性および慢性炎症状態の病因において果たす重要な役割は、抗菌防御に不可欠な構造である好中球細胞外トラップ(NET)の形成を含む複数のメカニズムを通じて免疫調節不全の開始と永続化に寄与することが明らかになりました。偏りがなく、再現性があり、効率的な方法でNET形成を定量化する技術の限界により、健康と疾患における好中球の役割をさらに理解する能力が制限されていました。本稿では、細胞内および細胞外のDNAをイメージングするために2つの異なるDNA色素を用いた膜透過性依存性二重色素アプローチと組み合わせたライブセルイメージングプラットフォームを用いて、NET形成を受ける好中球を定量する自動化されたリアルタイムのハイスループット法について説明する。この方法論は、好中球の生理機能を評価し、NET形成を標的とすることができる分子をテストするのに役立ちます。

概要

好中球細胞外トラップ(NET)は、さまざまな炎症刺激に応答して好中球から押し出されるウェブ状のクロマチン構造です。NETは、DNA、ヒストン、およびさまざまな抗菌タンパク質/ペプチドで構成されており、感染性病原体を捕捉して殺し、炎症反応を引き起こします¹。

NETは病原体に対する宿主防御に有益である一方で、様々な自己免疫疾患²、血栓症³、代謝性疾患⁴、がんの転移増殖5の潜在的なドライバーとして注目^{されています。}そのため、NET形成の阻害は、これらの疾患の潜在的な治療選択肢です。しかし^{、いくつかの}有望なNETを標的とする分子が開発中であるにもかかわらず6、このメカニズムに特異的に作用する承認された治療法はまだありません。これは、少なくとも部分的には、NET形成のための客観的で、偏りがなく、再現性があり、ハイスループットの定量化方法の欠如に起因しています。

我々は、2色生細胞^{イメージングプラットフォームを利用した}新しい手法を確立し、報告^した

プロトコル

健康なヒト被験者からの好中球は、国立衛生研究所(NIH)治験審査委員会(IRB)が承認したプロトコルに基づいてインフォームドコンセントが提供された後に取得されました。プロトコルは、NIHヒト研究倫理委員会のガイドラインに従います。

1. 好中球の染色とアッセイプレートの調製

1. 各施設のガイドラインに従って、適切な書面によるインフォームドコンセントで末梢血を採取し、任意の方法で好中球を分離します。例えば、フィコール-デキストラン法^10,11は、ヒト末梢血から好中球を単離するために一般的に使用される方法です。
   注:ここで説明する方法はヒト好中球を使用しますが、マウス好中球も同様のプロトコルを使用して分析できます。
2. 好中球をRoswell Park Memorial Institute(RPMI; 材料表を参照)1640培地で2.0 x 10⁶ 好中球/mLで再懸濁し、好中球懸濁液を1.5 mL遠心チューブに入れます。
   注:FBS中のアルブミンはNET形成を減少させる可能性があり¹² 、FBS中の熱安定性ヌクレアーゼはNETを分解する可能性があるため、通常はウシ胎児血清(FBS)を....

結果

この方法では、位相差、赤色蛍光(膜透過性色素)および緑色蛍光(膜不透過性色素)の画像を各時点で取得できます。NET形成過程に伴い、位相差や赤色蛍光像に形態変化が観察され、膜が破れると緑色蛍光が観察されます(図1)。このアッセイでは、NETを形成する好中球は、ウェブ状の構造を形成するのではなく、一般的に丸いです。これは、機械の分解能が十分に高くないため、微細なウェブ状の構造を捕捉できず、膜が破られると放出される前に、膜不透過性の緑色色染料がクロマチンを染色するためです。4時間のインキュベーション後に回収した96ウェルプレートの共焦点イメージングを用いてNETを可視化^{できることを以前に} 示しました7。

解析定義を適切に設定すると、画像内のすべての好中球が赤色の物体としてマークされ、NETを形成する好中球が緑色の物体としてマークされます(図2)。機械は、各時点で赤と緑のオブジェクトの数をカウントします。NET形成の経時変化.......

ディスカッション

ex vivoでNETを定量する現在の方法には、好中球、NET、および潜在的な治療標的を偏りのないハイスループットな方法で研究する能力を制限するいくつかの欠点があります^10,14。例えば、NETの定量のためのゴールドスタンダードと考えられている免疫蛍光染色後のNET形成細胞の直接計数は、スループットが低く、オペレーターの主観的な見方に依存します。膜不透過性DNA色素の蛍光を検出するプレートアッセイは、NETの代替マーカーである細胞外DNAを客観的かつハイスループットに定量しますが、この方法では形態学的情報が得られないため、他の種類の細胞死によるDNA放出をNETと誤認する可能性があります。一方、この分析法は、^NET7のハイスループットで客観的な定量を提供します。好中球の形態変化や経時変化の情報が得られることから、NETは他の細胞死と正確に区別することができます。最近の論文では、様々な疾患におけるNETの病原性の役割が示唆されており

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AKT阻害剤	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
膜不透過性DNAグリーン色素	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S7020
核赤色色素	Enzo	ENZ-52406	好中球ペレットは染色後に青みがかった色になります。
RPMI	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11835030	フェノールレッド含有RPMIが使用できます。