高齢Dunkin-Hartleyモルモットの関節内注射後の膝のマイクロコンピュータ断層撮影分析

変形性関節症(OA)は、米国の成人3,250万人に影響を及ぼしています。これは、関節軟骨の進行性の喪失、関節内および関節周囲の組織の軽度の炎症、および骨棘および骨嚢胞の形成によって引き起こされます^1,2。症状は通常、病気の後期に現れ、現在の治療法では緩和的な緩和しか得られず、全身性の副作用もあります。疾患修飾薬の欠如は、疾患の根本的なメカニズムについての理解が不十分であることに起因しています³。その結果、OAを治療するための改良された薬剤に対する重要かつ継続的な医学的ニーズがあります。

疾患プロセスのさまざまな要素を調べるOAのいくつかの動物モデルが利用可能です⁴。前十字靭帯の切断や内側半月板の不安定化など、いくつかの手術モデルが存在しますが、これらは侵襲的であり、高度な技術スキルが必要です⁵。化学的に誘導されたモデルは、OA 疼痛メカニズムの研究に一般的に使用される比較的侵襲性の低い手順です⁶.そのような広く使用されているマウスモデルの1つは、ヨードアセテートナトリウム(MIA)の関節内膝注射によるOA誘導です。このモデルは、再現性があり、堅牢で、迅速な痛みのような表現型を生成し、MIA投与量⁷を変更することで等級付けできます。このモデルを誘導する技術的な詳細は、以前に説明した⁷。この手法をモルモットのようなより大きなげっ歯類に変換することは、解剖学的な違いのために困難です。いくつかの違いには、モルモットの隣接する骨と関節腔を囲む筋肉組織の増加と、マウスに見られる遠位癒合と比較して関節式の腓骨と脛骨が含まれます⁸。ダンキン・ハートレーモルモットは、広く入手可能なモルモット系統であり、この疾患を自然に発症するOA動物モデルとして確立されており、関節内注射による新規治療薬の疾患進行への影響を調査するための堅牢なモデル^{を提供している9。}ダンキン・ハートレーのモルモットは3ヶ月で変形性関節症を発症し始め、雄は進行が加速し、より重度の表現型¹⁰を示します。モルモットでは、変形性関節症は年齢とともに進行し、12か月で、関連する病状が画像¹¹で明らかになります。Dunkin-Hartleyモデルのような自然発進性OAモデルは、OAを誘発するための介入を必要とせず、したがってヒトにおける疾患表現型の発達と進行を再現し、それによって強力な翻訳モデル^{を提供する10}。さらに、OAの自発的な発生により、新しい治療法が特定の動物の片膝に一方的に投与される場合の内部制御が可能になります。この内部統制により、データ解析時の動物間ばらつきの影響を最小限に抑え、動物の総数を減らすのに役立つ可能性があります。

X線マイクロコンピューター断層撮影(μCT)分析は、OAの重症度を定量的に評価できる強力なツールです¹²。μCTは、回転する試料または回転するX線源および検出器¹³から得られた複数の高解像度X線画像のスキャンを含む。次いで、3次元(3D)体積データが、積層画像スライス¹⁴の形で再構築される。石灰化骨はμCTで優れたコントラストを示すため、このモダリティを使用して3D特徴を評価し、OA15,16,17に関連する変化の定量的分析を実行できます。μCTは、病理組織学や歩行分析など、より広く使用されているツールに比べていくつかの利点があります。 組織の1つまたは少数のセクションの組織学的評価とは対照的に、μCTは関節全体をスキャンし、OA病変のより全体的な評価を提供します¹⁸。歩行分析では、時間の経過に伴う関節機能の症状の変化を識別できますが、関節の変化は、OAに関連する機能変化よりもずっと前に発症します。μCTは、跛行の発症前にOA発症のより感度の高い尺度を提供できます。特に関連性のある 2 つの定量的測定には、骨密度と海綿の厚さが含まれ、どちらも OA^19,20 の進行を通じて増加します。分析を軟骨下板と海綿骨に分割すると、それぞれに異なる特徴があるため、より堅牢な測定と比較を実現するのに役立ちます。

この方法の全体的な目標は、研究者がモルモットの関節内注射を成功裏に行うのを支援することです。提示されたプロトコルは、5匹(n = 2)、9匹(n = 1)、および12ヶ月齢(n = 2)の無傷の雄のダンキンハートリーモルモットを利用しました。手順は、他のモルモットの株や関節内膝注射が必要な年齢に外挿できます。Dunkin-HartleyモデルのようなOAの自発的モデルでは、疾患の進行と連続治療への反応は、数週間から数か月にわたる長期間にわたって監視されることがよくあります⁹。この拡張プロトコルは、複数の関節内注射をもたらすため、痛み、跛行、感染症などの有害事象を防ぐための適切な注射技術を持つことが重要です。これらはすべて、動物の福祉に影響を与え、研究結果を混乱させる一方で、追加の動物を研究に必要とする可能性があります。提示されたプロトコルは、モルモットの関節内注射の方法論とその後のμCTデータの分析を説明しています。

ここに記載されているすべての方法は、サウスカロライナ医科大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されています。この研究は3Rの原則に従っています。

1.関節内注射剤

1. 実験を開始する前に、ダンキンハートリーモルモットが施設に順応するのを少なくとも1週間待ちます。
   注:生後5ヶ月(n=2)、9ヶ月(n=1)、および12ヶ月齢(n=2)のオスモルモットを用いた。男性はOAの進行が加速し、より重度の表現型を示します。
2. 電気カミソリで膝の部分を剃ります。
   注:内側の乳首に注意してください。
3. イソフルランチャンバーでモルモットを麻酔し、O₂ 混合物(流速2.5 L / min)に3〜5%のイソフルランを供給し、次にモルモットを非再呼吸麻酔回路に接続されたノーズコーンに移します。注射中に麻酔の手術面を維持するためにイソフルランを調整し、通常は0.5〜1 L / minの酸素流量と1〜3%のイソフルランで。
   注:関節内注射は、軽度の一時的な痛みを引き起こします。動物は、痛みを伴う刺激の知覚を防ぎ、注射の精度を向上させるために、処置中に麻酔をかけられます。提示された研究では、非ステロイド性抗炎症薬を含む鎮痛剤の投与は、OAの進行を妨げる^{でしょう21}。麻酔が与えられ、鎮痛薬がモデルを混乱させる可能性があるため、動物が注射後の関節触診で足を引きずったり痛みの兆候を示したりした副作用を示さない限り、鎮痛薬は投与されませんでした。研究者は、日常的な注射に鎮痛薬を使用することを検討する必要があります。副作用が発生した場合は、鎮痛薬が推奨されます。鎮痛レジメンは、研究を開始する前に、施設の獣医師と話し合い、IACUCによって承認されるべきです。
4. モルモットがつま先のつま先つまみ反応がないため、適切な麻酔深度にあることを確認します。
5. 乾燥や怪我を防ぐために、滅菌眼用潤滑剤を両目に置きます。
6. ベタジンを滅菌水で10%に希釈します。
7. 200プルーフのエタノールを滅菌水で70%エタノールに希釈します。
8. 無菌性を維持するために、バイオセーフティキャビネットに注射用の溶液を準備します。提示されたプロトコルでは、滅菌ビヒクル(1xリン酸緩衝生理食塩水)を使用して両膝を注射しました。研究目的に応じて解決策を変更することができます。
   注:無菌性を確保するために、注射セッションの直前に注射用の新鮮な溶液を希釈してください。未使用の溶液は、各注入セッションの終了時に廃棄する必要があります。
9. 滅菌済みの1回限りのインスリン注射器に注射用溶液を充填します。関節スペースがボリュームで過負荷になるのを防ぐために、達成可能な最小ボリュームを利用するように注意してください。本研究では、50μLを使用しました。
10. モルモットとノーズコーンを清潔な面に置き、熱サポート用の加熱パッドと頭の下にパッドを付けてわずかに持ち上げます。
11. 手術用ガウン、ヘアネット、滅菌手袋、マスクを着用して注射手順を行います。
12. 10%のベタジンをコットンボールに注ぎ、両方の膝の部分を拭きます。
13. 70%エタノールをコットンボールに注ぎ、両方の膝の部分を拭きます。
14. 1.12 と 1.13 をさらに 2 回繰り返します。
    注:デモンストレーションの目的で、対応するビデオは、10%ベタジンと70%エタノールで膝と注射部位を一度洗浄する方法を示しています。その後、注射部位を円運動を用いてさらに2回、これらの溶液を交互に洗浄した。無菌技術を達成するためには、スクラブ溶液とアルコールを交互に使用した3つの連続スクラブが推奨されます。

2. 関節内注射

1. 手順全体を通してモルモットを仰臥位に置きます。
2. 新しい滅菌手袋を着用し、膝関節を触診します。
   注:提示されたプロトコルとビデオでは、オートクレーブ滅菌されたニトリル手袋が使用されました。無菌技術には、オートクレーブ滅菌されたニトリル手袋または外科用手袋を含む滅菌手袋を使用する必要があります。
3. 手動で膝を90°に曲げます。
4. 指を膝蓋骨の遠位に移動して、後肢を曲げたり伸ばしたりして、関節空間の遠位面の溝を見つけます。
   注:膝蓋骨は、関節腔の真上にある小さくてしっかりした構造として、この位置で触診することができます。脛骨は、膝蓋骨の遠位にある骨の構造として感じることができます。脛骨と膝蓋骨の位置が決定されると、溝のように感じられる関節は、膝蓋骨の遠位と脛骨の近位にあるそれらの間にあります。
5. インスリン針を関節腔内の膝蓋骨の遠位の正中線に慎重に挿入します。針は、関節腔に入るために皮膚の1〜2mm下に挿入する必要があります。
   注:膝を曲げているときの関節スペースの最大のアクセスウィンドウは、膝蓋骨の直接遠位にある正中線上の四肢の前面にあります。正中線上で前後方向に注入すると、骨構造を貫通することなく関節腔に正確に注入するのに役立ちます。関節腔への正確な注入は、外側から内側へのアプローチを使用して達成できますが、特に膝を曲げるとアクセスウィンドウが狭くなります。
6. 50μLの溶液をゆっくりとジョイントに注入します。針が簡単に挿入され、内容物が抵抗なく注入されることを確認してください。
   注意: 針を深く挿入しすぎると、関節や骨に損傷を与え、望ましくない炎症や痛みを引き起こす可能性があるため、挿入しすぎないように注意してください。関節腔に対応する溝が見つからない場合、針は大腿骨、膝蓋骨、または脛骨を貫通する可能性があります。したがって、関節腔に対応する溝を自信を持って触診することは、関節周囲注射や骨構造の貫通に関連する損傷を防ぐために有益です。皮下の注入部位に気泡が発生した場合は、注入が浅すぎて液が皮下腔に入ってしまっています。使用する薬剤の特性に応じて、薬物は拡散を介して関節腔に入る場合もあれば、別の注射の試みが必要な場合もあります。
7. 完了したら、針を鋭利なビンに捨てます。
   注:練習やトレーニングの目的で、同様のサイズのげっ歯類またはモルモットの死体の関節腔に染料を含む液体を注入します。次に、関節を解剖して注射の位置を確認します。
8. 関節を数回曲げたり伸ばしたりして膝をマッサージすると、関節空間内での薬物の拡散が促進されます。
9. 手順2.1〜2.5を対側肢で1回繰り返し、1x PBS溶液を使用します。

3. 関節内注射からの回復

1. イソフルランをオフにし、動物が意識を取り戻すまで酸素による100%の流れを維持します。
2. 歩行可能になるまで、動物を温熱サポートのために加熱パッドの上に置きます。
3. アイスパックを膝に30秒間塗布し、ペーパータオルをバリアとして使用して、注射による腫れを軽減します。
4. 動物を住居に戻す前に、歩行時の動物の歩行を評価します。
   注:歩行の異常が認められた場合は、鎮痛薬と支持療法が必要になる場合があります。正常な可動性を確保するために、麻酔からの回復後数時間後に再び歩行を評価することをお勧めします。

4. マイクロCT(CT)スキャン

1. 組織採取のために、100% 酸素と 5% イソフルラン混合物で麻酔の手術面を確立します。
2. つま先をつまむ刺激に対する反応がない麻酔の手術面を確認します。施設の方針と承認された動物使用プロトコルに従って、≥ 150 mg / kgのペントバルビタールを静脈内投与 することにより 、動物を人道的に安楽死させます。
   注:提示されたプロトコルでは、5匹のモルモットのそれぞれが両膝に1回の注射を受けた。動物は注射の1週間後に麻酔をかけられ、人道的に安楽死させられました。
3. 皮膚を周囲の筋肉組織から離剖することにより、両方の後肢を採取します。
4. 次に、大腿骨の中央軸と足首の近位でRongeursを使用して後肢を離散させます。
   注:使用したスキャンベッドと標本ホルダーは、成体のモルモットの後肢全体を収容することができませんでした。大型の試料ホルダーは、より大きな試料サイズ用に市販されています。
5. μCTを実施する前に、組織を中性緩衝ホルマリン溶液に72時間置いて固定します。
6. μCTスキャンソフトウェアを開き、ホルマリンを含むサンプルを、視野内の組織を維持しながらμCT検体フォルダーに収まる互換性のある容器に入れます。
7. メーカーの推奨に従って、暗視野および明視野の露光用にμCT装置を校正します。
8. Al+Cuフィルターで18μmの試料を走査します。オフセットカメラで360°の回転ステップを0.7°使用します。
   注: スキャンは自動的に保存されます。

5. 骨の微細構造パラメータを評価するための画像処理

1. μCT画像再構成のためのμCT再構成ソフトウェアをダウンロードしてインストールします。
2. ソフトウェアフォルダを選択し、ダブルクリックしてソフトウェアを開きます。
3. μCT画像から1つのスライスを選択するには、画像スライスをクリックします。
4. 再構築ファイルの保存先を選択します。 [参照 ] を選択し、Recon という名前の新しいフォルダーを作成します。選択したファイル形式は BMP(8) であるべきです。
5. ミスアライメント補正を確認します。
   注:通常、推定はほぼ正確ですが、手動で調整して、重なり合う画像をシフトして、右端と左端ができるだけ近くに揃うようにすることができます。
6. [設定]で、[スムージング]、[ビーム硬化]、[CS 回転]、および[リング アーティファクト]の各アルゴリズムを適用します。
   注:再構築する前にプレビュー画像を選択して鮮明度を判断すると便利な場合があります。微調整設定は、どの設定が最適かを判断するのにも役立ちます。
7. [開始] を選択して、再構築の処理を開始します。

6. 再構成画像からのマイクロアーキテクチャデータの収集

1. Dataviewerをダウンロードしてインストールします。
2. VOIを選択し、サンプルを垂直方向に整列させると、後で分析が容易になります。
3. 編集したVOIを新しいフォルダとして保存します。
4. CTAnalyserをダウンロードしてインストールし、マイクロアーキテクチャパラメータの骨特性解析を行います。
   注:CTAnalyserの無料版は機能が制限されているため、フルライセンスを取得することをお勧めします。
5. 分析を軟骨下板と海綿骨に分割し、別々の範囲の画像として保存します。
   注:分析を分割する必要はありませんが、軟骨下板と海綿骨は異なる特徴を持っているため、別々の分析が堅牢な測定と比較に役立ちます。
6. 分析する画像の範囲を選択します。開始する画像スライスをクリックして、軟骨下板から開始します。
7. 各画像の関心領域を選択し、関心領域タブをクリックしてボーンを囲んでいることを確認します。
8. 「バイナリ選択」タブを選択します。ヒストグラムを調整して、背景とボーンが完全に分離するようにします。
9. [Bone Mineral Density (BMD)] タブを選択します。そのデータを新しい分析データ フォルダーに保存します。
10. [カスタム処理] を選択し、[内部] タブに移動します。
11. 最初に しきい値処理 を実行し、[ Automatic Otsu] を選択し、[ Run] を選択します。
12. 次に、[ ノイズ除去 ] を選択し、[ 黒い斑点の削除] を選択し、[ 実行] を選択します。
13. [ノイズ除去] を繰り返し、[白い斑点の削除] を選択し、[実行] を選択します。
14. [3D 解析] を選択し、[基本値] と [追加値] を選択します。
15. 手順6.2.2〜6.4.5を繰り返して、海綿骨分析の画像をリセットします。
    注: 出力ファイルが BMD データと同じファイルを含む新しいフォルダーにあることを確認してください。

生きた動物に関節内注射を行う前に、正しい注射位置を確保するために、上記のプロトコルを3匹のラット死体で実践しました。練習セッションでは、上記の方法論を使用して、50 μL の 70% 新しいメチレン ブルー染料を両方の膝関節に注入しました。これは、6回の練習用注射に相当します。注射後、膝蓋骨の遠位と膝蓋靭帯を通る関節腔の頭蓋面を切開して膝関節を解剖し、関節空間を視覚化し、色素沈着の位置を確認しました。新しいメチレンブルー染料は明るい青色の溶液であるため、染料の堆積位置を大まかに視覚化できます。死体注射の代表的な画像を図1に示します。図1Aは、関節腔内の色素の存在を示しており、正しい注入位置と技術を示しています。これらの練習セッションでは、膝関節の注入が6回すべて成功しました(成功率100%)。デモンストレーションの目的で、誤った注入位置の例を図 1B-C に示します。注射を皮下腔に投与すると、図1Bに示すように、体液が蓄積して皮下にブブレが発生します。関節腔が注入されない場合、図1Cに示すように、膝関節内に染料は存在しません。

5匹のモルモットはそれぞれ、パイロット実験の一環として、1xリン酸緩衝生理食塩水を用いた片側膝注射手術を受け、注射の実現可能性とその後の加齢性OA変化のμCT分析を確認しました。動物は、全体的な健康状態と有害事象について、手順に続いて少なくとも1日1回視覚的に評価されました。これらの動物のいずれも(0%)、痛み、跛行、感染症など、注射に関連する有害事象を経験しませんでした。.注射の7日後、動物は麻酔の手術面下に置かれ、膝の収穫とその後のμCT分析のために人道的に安楽死させられました。

以前に発表されたように、μCT分析は、OAの重症度に関連する定量的変化を経時的に測定する能力を含む、モルモットの膝の変化を評価するために利用することができる22,23。発表された研究では、μCTを使用して、年齢の異なるモルモットのOA変化を確認しました。これらの結果は、OAの進行を遅らせることを目的とした新しい治療法を評価する将来の研究のベースラインデータとして使用できます。上記の方法論により、将来の研究でμCT解析を標準化することができます。軟骨下板(図2A)と海綿骨(図2B)は、骨の性質が大きく異なります。そのため、これらの領域は別々に分析され、注入の 1 週間後にはより堅牢な結果が得られます。

骨密度(BMD)は、生後5か月および9か月のモルモットと比較して、生後12か月のモルモットの方が高くなっています(図3)。平均軟骨下板BMDは、生後12か月、9か月、5か月齢のモルモットでそれぞれ0.898 g/cm3、0.952 g/cm 3、0.588 g/cm3でした。これは、生後12か月のモルモットの軟骨下BMDが生後5か月と比較して1.53倍増加していることを示しています。平均海綿骨BMDは、生後12か月のモルモットで0.825 g/cm3、生後9か月のモルモットで0.839 g/cm3、5か月齢のモルモットで0.427 g/cm3 でした。これは、生後12か月のモルモットの小柱BMDが生後5か月と比較して1.93倍増加したことを意味します。全体として、Dunkin-HartleyモルモットのBMDは、生後5か月から12か月齢になるにつれて増加します(図3)。

また、さまざまな年齢のモルモット間でも海綿の厚みに違いがありました (図4)。平均小柱の厚さについては、生後9か月(0.403 mm)と比較して12か月齢(0.558 mm)で1.38倍、生後5か月(0.225 mm)のモルモットと比較して12か月齢(0.558 mm)で2.48倍の増加があります。したがって、Dunkin-Hartleyモルモットでは、5か月から12か月の老化に伴い、小柱の厚さの平均が増加します。

組織学的変化とModified Makinスコアは、2DでのOA変化を評価するための検証済みで広く利用されているアプローチであり、μCT所見を裏付けています(図5)。モルモットの年齢とともに、修正マンキンスコアが増加しました(図5A)。組織学的には、プロテオグリカンの喪失、低細胞性、亀裂などのOAの徴候は、モルモットが生後5か月から12か月になるにつれて有病率が増加します(図5B-D)。

図1:正しい注入位置と正しくない注入位置の代表的な画像。 (A)関節腔内に新しいメチレンブルー染料が存在するラットの膝を解剖した。参考のために膝の左側にスケールが含まれています。(B)膝が浅い注射を示し、皮下腔にブレブが形成されます。(C)パネルBの膝を解剖し、関節腔内に新しいメチレンブルー染料が存在しないことを確認した。参考のために膝の右側にスケールが含まれています。すべての画像で、頭蓋骨は画像の上部にあり、尾部は下部にあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:軟骨下板と海綿骨の測定フィールドのセグメンテーション。 軟骨下板は、海綿骨とは異なる特性を持っています。これらの領域を個別に分析することで、OA進行の過程を通じて異なる領域間を比較できます。領域 A (赤) は、解析に使用された軟骨下板セグメントの領域の冠状ビューを示しています。領域B(緑)は、分析に使用される海綿骨セグメントの冠状ビューを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:老化したダンキンハートレーモルモットの骨ミネラル密度の変化。 骨密度(BMD)は、モルモットの生後5か月(n = 2)、9か月(n = 1)、および12か月(n = 2)で評価されました。測定は、軟骨下板と海綿骨で 2 つの異なる測定のために行われました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:老化したダンキンハートレーモルモットの小柱の厚さの変化。 海綿の厚さの測定は、生後5か月(n = 2)、9(n = 1)、および12か月(n = 2)のモルモットから行われました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:ダンキン・ハートレーモルモットのOA変化の組織学的解析 (A)生後5ヶ月(n=2)、9ヶ月(n=1)、12ヶ月(n=2)のモルモットの組織学的サンプルの修正マンキンスコア。Modified Mankinスコアは、軟骨構造、細胞性、潮汐マーク、および骨棘形成の個々のスコアを合計することによって計算されました。(B)生後5ヶ月のモルモットのトルイジンブルーで染色した代表的な組織像。(C)生後9ヶ月のモルモットのトルイジンブルーで染色した代表的な組織像。黒 *= プロテオグリカンの損失。D. 生後12ヶ月のモルモットのトルイジンブルーで染色した代表的な組織像。黒 *= 亀裂;白 *= 低細胞性。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

何一つ