方法論記事

細胞スフェロイドの量産のための3次元音響組立装置

DOI：

10.3791/66078

⸱

2023年10月13日

 ,  ,  , 
1School of Automation, Hangzhou Dianzi University, 2Key Laboratory of Medical Information and 3D Bioprinting of Zhejiang Province, Hangzhou Dianzi University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞スフェロイドは、生物学的応用の分野における1つの潜在的なモデルと見なされてきました。本稿では、均一な細胞スフェロイドを頑健かつ迅速に作製するための効率的な方法を提供する3D音響アセンブリデバイスを使用して細胞スフェロイドをスケーラブルに生成するためのプロトコルについて説明します。

要約

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細胞スフェロイドは、多くの生物学的分野で幅広い用途を獲得している有望な3次元(3D)モデルです。このプロトコルは、3D音響アセンブリデバイスを使用して、操作可能な手順で高品質でハイスループットな細胞スフェロイドを製造する方法を提示します。音響アセンブリデバイスは、3つのチタン酸ジルコン酸鉛(PZT)トランスデューサで構成され、それぞれが正方形のポリメチルメタクリレート(PMMA)チャンバーのX/Y/Z平面に配置されています。この構成により、3つの信号が印加されたときに浮上音響ノード(LAN)の3Dドットアレイパターンを生成することができます。その結果、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)溶液中の細胞をLANに駆動し、3次元で均一な細胞凝集体を形成することができます。次に、GelMA溶液をUV光硬化および架橋して、細胞凝集体の増殖をサポートする足場として機能します。最後に、成熟したスフェロイドの塊が得られ、続いて穏やかな条件下でGelMAスキャフォールドを溶解することによって回収されます。提案された新しい3D音響細胞アセンブリデバイスは、細胞スフェロイド、さらにはオルガノイドのスケールアップ製造を可能にし、生物学分野で大きな可能性を秘めた技術を提供します。

概要

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従来の2D培養モデルと比較して、よりin vivoのような構造的および形態学的特性を提供する3Din vitro培養モデルは、組織工学、疾患モデリング、薬物スクリーニングなどのさまざまな生物医学的アプリケーションにおいて有望なシステムとして認識されています1,2,3.3D培養モデルの1つのタイプとして、細胞スフェロイドは通常、細胞凝集を指し、細胞間および細胞マトリックスの相互作用の強化を特徴とする3Dスフェロイド構造を作成します4,5,6。そのため、細胞スフェロイドの作製は、多様な生物学的研究を可能にする強力なツールとなっています。

スフェロイドを得るために、吊り下げ液7、非粘着プレート8、またはマイクロウェル装置9を含む様々な技術が開発されている。原理的には、これらの方法は、細胞と基質の間の相互作用を最小限に抑えながら、重力などの物理的な力を利用することで、細胞の組み立てを容易にするのが一般的です。しかし、多くの場合、労働集約的なプロセスが必要であり、生産性が低く、回転楕円体サイズ10,11を制御するための課題があります。重要なことは、所望のサイズと均一性を十分な量で得るスフェロイドを製造することが、特定の生物学的用途を満たすために最も重要であるということです。上記の方法とは対照的に、音波は、外力駆動技術12,13,14の一種として、外力15,16,17,18によって細胞凝集を促進する原理に基づいて、高品質でスループットの高い細胞スフェロイドの大量生産の可能性を示しています15,16,17,18.電磁力や磁力とは異なり、音響ベースの細胞操作技術は非侵襲的でラベルフリーであり、優れた生体適合性を備えたスフェロイド形成を可能にします19,20。

一般に、定在弾性表面波(SAW)およびバルク弾性波(BAW)ベースのデバイスは、対応する定在音場21、22、23によって生成される音響ノード(AN)を利用して、回転楕円体を生成するために開発されてきました。特に、BAWをベースとした音響組立装置は、製造の簡便性、操作の容易さ、拡張性に優れるというメリットから、細胞スフェロイドの作製に注目されている24,25。我々は最近、ハイスループットでスフェロイドを生成する能力を持つ簡便なBAWsベースの音響アセンブリデバイスを開発しました26。提案されたデバイスは、X/Y/Z平面にそれぞれ配置された3つのチタン酸ジルコン酸鉛(PZT)トランスデューサを備えた正方形のポリメチルメタクリレート(PMMA)チャンバーで構成されています。この配置により、セルアセンブリを駆動するための浮上音響ノード(LAN)の3Dドットアレイパターンを作成できます。AN27,28,29の1Dまたは2Dアレイしか作成できない、以前に報告されたBAWまたはSAWベースのデバイスと比較して、本デバイスは、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)溶液内での迅速な細胞凝集体形成のためのLANの3Dドットアレイを可能にします。その後、細胞凝集体は、3日間の培養後、光硬化したGelMAスキャフォールド内で生存率の高いスフェロイドに成熟しました。最後に、下流アプリケーション用のGelMAスキャフォールドから、均一なサイズの多数のスフェロイドが簡単に得られました。

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プロトコル

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1. 3次元音響組立装置の製作

  1. まず、厚さ1mmのPMMAシートをレーザー切断30で4枚準備し、次にそれらを接着して、内幅21mm、高さ10mmの正方形のチャンバーを形成します。
  2. 次に、チャンバーの底部に厚さ1mmのPMMAシートを貼り付けて、バイオインクのホルダーとして使用します。
  3. チタン酸ジルコン酸鉛(PZT)トランスデューサー3個(長さ20 mm、幅10 mm、厚さ0.7 mm、一次共振周波数3 MHz、 材料表参照)をチャンバーの直交する3つの壁の外側にそれぞれ慎重に取り付けます。下部のPZT探触子がチャンバーの下の中央にあることを確認します。
  4. 各PZT探触子の2つの導電性領域にはんだ付けワイヤ。
  5. 最後に、下部のPZTが他のカウンタートップと接触しないように、デバイスを中空のベースに固定します。

2. 音響組立システムのセットアップ

  1. まず、音響装置を顕微鏡ステージに取り付け、チャンバー内部を上から観察できるようにします。
  2. PZT探触子のない装置の側面にデジタルマイクロスコープを配置し、チャンバー内部を側面から観察できるようにします。
  3. 3つのPZTトランスデューサからのワイヤを直列に接続し、3つのパワーアンプと関数発生器の3つの出力チャンネルに接続します( 材料表を参照)。
  4. 各PZTトランスデューサの関数発生器の設定をプログラムし、正弦波、周波数、振幅などのパラメータを指定します。
  5. 滅菌を確実にするために、音響装置のチャンバーを75%アルコールで5分間満たし、その後、滅菌PBS溶液で徹底的に洗浄します。続いて、クリーンベンチ内でチャンバー内にUV光を最低1時間照射する。

3. 細胞培養と採取の手順

  1. まず、ヒト肝細胞がん細胞株であるC3A細胞を、10%ウシ胎児血清と1%ペニシリンストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を使用して、T25細胞培養フラスコで培養します( 材料表を参照)。
  2. C3A細胞が約80%のコンフルエントに達したら、次のように細胞継代を行います:まず、培養フラスコの底をPBSで2回洗浄します。次に、2 mLの0.05%トリプシン-EDTAを細胞培養フラスコに加え、37°Cでインキュベートして細胞剥離を促進します。2 mLの完全培地を添加してトリプシン化プロセスを停止します。
  3. 細胞溶液を15mLのチューブに移し、室温で200× g で5分間遠心分離して、細胞ペレットを得ます。

4. バイオインクの調製

  1. 0.3 gのGelMAと0.025 gのLAP( 材料表を参照)を5 mLのリン酸緩衝液(PBS)に溶解して、0.5%(w/v)のフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)を含む6%(w/v)のGelMA溶液を調製します。混合物を47°Cのウォーターバスに1時間放置します。
  2. 細胞と混合する前に、GelMA溶液を0.22 μmフィルター( 材料表を参照)に通して滅菌します。
  3. 上記の細胞ペレット(ステップ3.3)を細胞培養培地に再懸濁します。少量の細胞を0.4%トリパンブルー溶液で染色し、細胞計数にクリーンな血球計算盤を使用します。
  4. 上記で得られた細胞密度に基づいて計算された適量のC3A細胞を滅菌したGelMA溶液と混合し、細胞密度が2〜106 細胞/mLのバイオインク×調製します。
  5. 組み立てられた細胞スフェロイドを可視化するには、C3A細胞を2 μMセルトラッカー(DiO色素、 材料表を参照)で37°Cで20分間インキュベートして予備染色します。続いて、標識細胞を新鮮な細胞培養培地で3回洗浄してから使用してください。

5. 音響装置を用いた細胞スフェロイドの組み立て

  1. 1 mL以上のバイオインクを滅菌チャンバーにピペットで入れます。液面とチャンバー底部の間の対面距離が、音響波長の半分の整数倍であることを確認してください。
    注:この距離は、追加するバイオインクの量を調整することで制御できます。音響波長(λ)は、式λ = c / fを使用して推定できます(cは媒質内の音速を表し、fはPZTトランスデューサの周波数を表します)。
  2. 関数発生器とパワーアンプをオンにして、各PZTトランスデューサの作動を開始します。
    注意: 最適な平行線セルラーパターンを実現するために、最初に各PZTトランスデューサを個別に作動させることをお勧めします。これは、各PZT探触子の一次共振周波数付近で0.001MHzのステップサイズで周波数掃引を行うことで実現できます。その後、これらの最適な信号を3つのPZT探触子すべてに同時に印加して、期待される3Dドットセルラーパターンを取得します。各入力信号を印加する前に、穏やかに撹拌して細胞がバイオインク内に均一に分散していることを確認してください。
  3. 青色光(405 nm、60 mW/cm2、30 s)を使用してバイオインクを架橋し、音響的に組み立てられた細胞凝集体をカプセル化する3Dハイドロゲル足場を作成します。その後、関数発生器とパワーアンプの電源を切ります。
  4. 3Dハイドロゲルスキャフォールドをチャンバーからペトリ皿に慎重に移し、清潔なカミソリを使用して小片(2mm×2mm×2mmなど)に切断します。
  5. 培養用の細胞培養培地を加えます。
    注:培地は毎日交換することを忘れないでください。

6. 細胞スフェロイドの回収

  1. まず、倒立顕微鏡を使用して、足場のさまざまな層での回転楕円体の形成を観察します。
  2. 3日間の培養後、培地を除去し、ハイドロゲル足場をPBSで2回十分に洗浄します。
  3. スキャフォールドを2 mL以上のGelMA溶解バッファーとともに、細胞培養培地と1:200の希釈で細胞インキュベーター内で30分間インキュベートします。このステップは、ヒドロゲルの足場を溶解することを目的としています。
  4. 前のステップの溶液をチューブに移し、室温で200 × g で5分間遠心分離して、細胞スフェロイドペレットを得ます。
  5. 上清を廃棄し、下流のアプリケーション用にペレットを新鮮な培地に再懸濁します。

7. スフェロイド生存率解析

  1. ハイドロゲルスキャフォールド内、または回収したスフェロイド中の細胞スフェロイドの生存率を、生染色/死染色キットを用いて評価します( 材料表を参照)。
  2. 1 μLのカルセイン-AMと2 μLのヨウ化プロピジウム(PI)を含む1 mLのPBS溶液と、異なる培養時点でサンプルを37°Cで15分間インキュベートします。
  3. ハイドロゲルスキャフォールド内のサンプルについては、PBSで直接2回洗浄します。回収したスフェロイドは、室温で200×gで5分間遠心分離してスフェロイドペレットを得、2回洗浄してから観察してください。
  4. 蛍光顕微鏡で試料を観察し、蛍光画像を撮影します。
  5. ImageJ を使用して、Calcein-AM と PI の両方で染色した総面積に対する Calcein-AM で染色した面積の比率を計算し、スフェロイドの生存率を決定します。

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結果

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本研究では、細胞スフェロイドを大量生産するための3次元音響アセンブリ装置を設計した。音響装置は、チャンバー外面のX面とY面に取り付けられた2つのPZT探触子と、チャンバーの底部に1つのPZT探触子を備えた正方形のチャンバーで構成されていました(図1A、B)。2つの関数発生器からの3つの出力チャンネルを3つのパワーアンプに接続し、3つの独立した正弦波信号を生成してPZTトランスデューサを作動させました(図1C)。

チャンバーのX/Y/Z面に取り付けられた3つのPZT探触子を作動させるのに最適な共振周波数は、それぞれ3.209 MHz、3.283 MHz、3.215 MHzでした。3つのPZTトランスデューサすべての最適な振幅は、オシロスコープで測定した10ピークtoピーク出力電圧(Vpp)でした。 図2A は、3D音響組立装置を用いて生成された細胞凝集体の作用機構を示す。信...

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ディスカッション

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3D音響アセンブリデバイスなどの技術を使用して、ハイスループットで細胞スフェロイドを効率的かつ安定的に作製することは、生物医学工学と薬物スクリーニングの進歩に大きな期待を寄せています1,2,3。このアプローチにより、簡単な手順で細胞スフェロイドの大量生産が簡素化されます。

ただし、この音響デバイスを使用する際に考慮すべき重要な要素があります。定在波の生成は、3次元ドットアレイ音場の構築に不可欠です。このデバイスでは、各次元に1つのPZTトランスデューサのみが存在し、音響励起源として機能します。したがって、各次元について、PMMAチャンバーまたはPMMA水面の反対側の壁間の対面距離が波長の半分の整数倍であることが重要です。使用したPZTトランスデューサーの一次周波数は1MHzで、水中またはバイオインクの波長は約500μmになります。その結果、水平寸法については、音響装置内のPMMAチャンバーの2つの...

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開示事項

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著者は何も開示していません。

謝辞

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TISの研究は、中国の国家重点研究開発プログラム(2022YFA1104600)と中国浙江省自然科学基金会(LQ23H160011)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22-μmフィルターメルクSLGSM33SSGelMA溶液滅菌に使用
35mm細胞培養皿コーニング430165細胞培養に使用
共焦点顕微鏡ニコンA1RHD25蛍光細胞観察
DiO色素BeyotimeC1038細胞染色に使用した色素
DMEMGibco12430054細胞培養培地
FBSGibco10099141C細胞培養培地サプリメント
機能発生器RigolDG5352RF信号発生用
GelMARegenovoなしバイオインクの調製に使用
GelMA溶解バッファーEFLEFL-GM-LS-001GelMA足場の溶解に使用
倒立顕微鏡ニコンTi-U細胞観察
LAPSigma-Aldrich900889光開始剤として使用
Live-Dead kitBeyotimeC2015M細胞毒性分析
PBSGibco10010002バッファーとして使用
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15070063細胞培養汚染を防止
パワーアンプミニ回路LCY-22+増加RF信号の電圧振幅
PZTトランスデューサYantaiXingzhiwen Trading Co.,Ltd.PZT-41音響組立装置用機能ユニット
T25細胞培養フラスココーニング430639細胞培養用
パンブルー Gibco15250061Cell counting
Trypsin-EDTA Gibco25200056細胞解離酵素
ミリ

参考文献

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