細胞スフェロイドの量産のための3次元音響組立装置

従来の2D培養モデルと比較して、よりin vivoのような構造的および形態学的特性を提供する3Din vitro培養モデルは、組織工学、疾患モデリング、薬物スクリーニングなどのさまざまな生物医学的アプリケーションにおいて有望なシステムとして認識されています^1,2,3.3D培養モデルの1つのタイプとして、細胞スフェロイドは通常、細胞凝集を指し、細胞間および細胞マトリックスの相互作用の強化を特徴とする3Dスフェロイド構造を作成します^4,5,6。そのため、細胞スフェロイドの作製は、多様な生物学的研究を可能にする強力なツールとなっています。

スフェロイドを得るために、吊り下げ液⁷、非粘着プレート⁸、またはマイクロウェル装置⁹を含む様々な技術が開発されている。原理的には、これらの方法は、細胞と基質の間の相互作用を最小限に抑えながら、重力などの物理的な力を利用することで、細胞の組み立てを容易にするのが一般的です。しかし、多くの場合、労働集約的なプロセスが必要であり、生産性が低く、回転楕円体サイズ^10,11を制御するための課題があります。重要なことは、所望のサイズと均一性を十分な量で得るスフェロイドを製造することが、特定の生物学的用途を満たすために最も重要であるということです。上記の方法とは対照的に、音波は、外力駆動技術^12,13,14の一種として、外力^15,16,17,18によって細胞凝集を促進する原理に基づいて、高品質でスループットの高い細胞スフェロイドの大量生産の可能性を示しています15,16,17,18.電磁力や磁力とは異なり、音響ベースの細胞操作技術は非侵襲的でラベルフリーであり、優れた生体適合性を備えたスフェロイド形成を可能にします^19,20。

一般に、定在弾性表面波(SAW)およびバルク弾性波(BAW)ベースのデバイスは、対応する定在音場^21、22、23によって生成される音響ノード(AN)を利用して、回転楕円体を生成するために開発されてきました。特に、BAWをベースとした音響組立装置は、製造の簡便性、操作の容易さ、拡張性に優れるというメリットから、細胞スフェロイドの作製に注目されている^24,25。我々は最近、ハイスループットでスフェロイドを生成する能力を持つ簡便なBAWsベースの音響アセンブリデバイスを開発しました²⁶。提案されたデバイスは、X/Y/Z平面にそれぞれ配置された3つのチタン酸ジルコン酸鉛(PZT)トランスデューサを備えた正方形のポリメチルメタクリレート(PMMA)チャンバーで構成されています。この配置により、セルアセンブリを駆動するための浮上音響ノード(LAN)の3Dドットアレイパターンを作成できます。^AN27,28,29の1Dまたは2Dアレイしか作成できない、以前に報告されたBAWまたはSAWベースのデバイスと比較して、本デバイスは、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)溶液内での迅速な細胞凝集体形成のためのLANの3Dドットアレイを可能にします。その後、細胞凝集体は、3日間の培養後、光硬化したGelMAスキャフォールド内で生存率の高いスフェロイドに成熟しました。最後に、下流アプリケーション用のGelMAスキャフォールドから、均一なサイズの多数のスフェロイドが簡単に得られました。

1. 3次元音響組立装置の製作

1. まず、厚さ1mmのPMMAシートをレーザー切断³⁰で4枚準備し、次にそれらを接着して、内幅21mm、高さ10mmの正方形のチャンバーを形成します。
2. 次に、チャンバーの底部に厚さ1mmのPMMAシートを貼り付けて、バイオインクのホルダーとして使用します。
3. チタン酸ジルコン酸鉛(PZT)トランスデューサー3個(長さ20 mm、幅10 mm、厚さ0.7 mm、一次共振周波数3 MHz、 材料表参照)をチャンバーの直交する3つの壁の外側にそれぞれ慎重に取り付けます。下部のPZT探触子がチャンバーの下の中央にあることを確認します。
4. 各PZT探触子の2つの導電性領域にはんだ付けワイヤ。
5. 最後に、下部のPZTが他のカウンタートップと接触しないように、デバイスを中空のベースに固定します。

2. 音響組立システムのセットアップ

1. まず、音響装置を顕微鏡ステージに取り付け、チャンバー内部を上から観察できるようにします。
2. PZT探触子のない装置の側面にデジタルマイクロスコープを配置し、チャンバー内部を側面から観察できるようにします。
3. 3つのPZTトランスデューサからのワイヤを直列に接続し、3つのパワーアンプと関数発生器の3つの出力チャンネルに接続します( 材料表を参照)。
4. 各PZTトランスデューサの関数発生器の設定をプログラムし、正弦波、周波数、振幅などのパラメータを指定します。
5. 滅菌を確実にするために、音響装置のチャンバーを75%アルコールで5分間満たし、その後、滅菌PBS溶液で徹底的に洗浄します。続いて、クリーンベンチ内でチャンバー内にUV光を最低1時間照射する。

3. 細胞培養と採取の手順

1. まず、ヒト肝細胞がん細胞株であるC3A細胞を、10%ウシ胎児血清と1%ペニシリンストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を使用して、T25細胞培養フラスコで培養します( 材料表を参照)。
2. C3A細胞が約80%のコンフルエントに達したら、次のように細胞継代を行います:まず、培養フラスコの底をPBSで2回洗浄します。次に、2 mLの0.05%トリプシン-EDTAを細胞培養フラスコに加え、37°Cでインキュベートして細胞剥離を促進します。2 mLの完全培地を添加してトリプシン化プロセスを停止します。
3. 細胞溶液を15mLのチューブに移し、室温で200× g で5分間遠心分離して、細胞ペレットを得ます。

4. バイオインクの調製

1. 0.3 gのGelMAと0.025 gのLAP( 材料表を参照)を5 mLのリン酸緩衝液(PBS)に溶解して、0.5%(w/v)のフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)を含む6%(w/v)のGelMA溶液を調製します。混合物を47°Cのウォーターバスに1時間放置します。
2. 細胞と混合する前に、GelMA溶液を0.22 μmフィルター( 材料表を参照)に通して滅菌します。
3. 上記の細胞ペレット(ステップ3.3)を細胞培養培地に再懸濁します。少量の細胞を0.4%トリパンブルー溶液で染色し、細胞計数にクリーンな血球計算盤を使用します。
4. 上記で得られた細胞密度に基づいて計算された適量のC3A細胞を滅菌したGelMA溶液と混合し、細胞密度が2〜10⁶ 細胞/mLのバイオインク×調製します。
5. 組み立てられた細胞スフェロイドを可視化するには、C3A細胞を2 μMセルトラッカー(DiO色素、 材料表を参照)で37°Cで20分間インキュベートして予備染色します。続いて、標識細胞を新鮮な細胞培養培地で3回洗浄してから使用してください。

5. 音響装置を用いた細胞スフェロイドの組み立て

1. 1 mL以上のバイオインクを滅菌チャンバーにピペットで入れます。液面とチャンバー底部の間の対面距離が、音響波長の半分の整数倍であることを確認してください。
   注:この距離は、追加するバイオインクの量を調整することで制御できます。音響波長(λ)は、式λ = c / fを使用して推定できます(cは媒質内の音速を表し、fはPZTトランスデューサの周波数を表します)。
2. 関数発生器とパワーアンプをオンにして、各PZTトランスデューサの作動を開始します。
   注意: 最適な平行線セルラーパターンを実現するために、最初に各PZTトランスデューサを個別に作動させることをお勧めします。これは、各PZT探触子の一次共振周波数付近で0.001MHzのステップサイズで周波数掃引を行うことで実現できます。その後、これらの最適な信号を3つのPZT探触子すべてに同時に印加して、期待される3Dドットセルラーパターンを取得します。各入力信号を印加する前に、穏やかに撹拌して細胞がバイオインク内に均一に分散していることを確認してください。
3. 青色光(405 nm、60 mW/^cm2、30 s)を使用してバイオインクを架橋し、音響的に組み立てられた細胞凝集体をカプセル化する3Dハイドロゲル足場を作成します。その後、関数発生器とパワーアンプの電源を切ります。
4. 3Dハイドロゲルスキャフォールドをチャンバーからペトリ皿に慎重に移し、清潔なカミソリを使用して小片(2mm×2mm×2mmなど)に切断します。
5. 培養用の細胞培養培地を加えます。
   注:培地は毎日交換することを忘れないでください。

6. 細胞スフェロイドの回収

1. まず、倒立顕微鏡を使用して、足場のさまざまな層での回転楕円体の形成を観察します。
2. 3日間の培養後、培地を除去し、ハイドロゲル足場をPBSで2回十分に洗浄します。
3. スキャフォールドを2 mL以上のGelMA溶解バッファーとともに、細胞培養培地と1:200の希釈で細胞インキュベーター内で30分間インキュベートします。このステップは、ヒドロゲルの足場を溶解することを目的としています。
4. 前のステップの溶液をチューブに移し、室温で200 × g で5分間遠心分離して、細胞スフェロイドペレットを得ます。
5. 上清を廃棄し、下流のアプリケーション用にペレットを新鮮な培地に再懸濁します。

7. スフェロイド生存率解析

1. ハイドロゲルスキャフォールド内、または回収したスフェロイド中の細胞スフェロイドの生存率を、生染色/死染色キットを用いて評価します( 材料表を参照)。
2. 1 μLのカルセイン-AMと2 μLのヨウ化プロピジウム(PI)を含む1 mLのPBS溶液と、異なる培養時点でサンプルを37°Cで15分間インキュベートします。
3. ハイドロゲルスキャフォールド内のサンプルについては、PBSで直接2回洗浄します。回収したスフェロイドは、室温で200×gで5分間遠心分離してスフェロイドペレットを得、2回洗浄してから観察してください。
4. 蛍光顕微鏡で試料を観察し、蛍光画像を撮影します。
5. ImageJ を使用して、Calcein-AM と PI の両方で染色した総面積に対する Calcein-AM で染色した面積の比率を計算し、スフェロイドの生存率を決定します。

本研究では、細胞スフェロイドを大量生産するための3次元音響アセンブリ装置を設計した。音響装置は、チャンバー外面のX面とY面に取り付けられた2つのPZT探触子と、チャンバーの底部に1つのPZT探触子を備えた正方形のチャンバーで構成されていました(図1A、B)。2つの関数発生器からの3つの出力チャンネルを3つのパワーアンプに接続し、3つの独立した正弦波信号を生成してPZTトランスデューサを作動させました(図1C)。

チャンバーのX/Y/Z面に取り付けられた3つのPZT探触子を作動させるのに最適な共振周波数は、それぞれ3.209 MHz、3.283 MHz、3.215 MHzでした。3つのPZTトランスデューサすべての最適な振幅は、オシロスコープで測定した10ピークtoピーク出力電圧(Vpp)でした。 図2A は、3D音響組立装置を用いて生成された細胞凝集体の作用機構を示す。信号が印加されると、細胞は音響放射力(ARF)の影響下で音響ノードに駆動されます。細胞スフェロイドを可視化するために、細胞を2 μM DiO(緑色蛍光)で事前に染色しました。音響細胞の組み立て後、共焦点顕微鏡を使用して、音響的に組み立てられた3D細胞凝集体を観察しました。これらの細胞凝集体は、均一な緑色蛍光シグナルを持つ規則的な3Dドットアレイパターンに配置されていることが観察されました(図2B)。また、明視野画像のさまざまな上面図では、各層で形成された凝集体が2Dドットアレイパターンで配置されていることが示されました(図2C)。

異なる時点でのハイドロゲル内の細胞凝集体の増殖が観察されました。その結果、組み立てられた凝集体は徐々に統合され、3日目までにタイトなスフェロイドを形成し、スフェロイドの直径が増加しました(図3A、B)。細胞スフェロイドの生存率を評価するために、生染色/死染色を実施しました。良好な細胞生存率(>90%)は3日目前に達成されましたが、1週間の培養後には生存率がわずかに低下しました(図3C、D)。

スフェロイドの回収には、GelMA溶解バッファーを使用してハイドロゲル足場を解離させ、カプセル化された細胞スフェロイドを遊離させました(図4A)。その結果、3日間の培養後、ヒドロゲル足場の小片をGelMA溶解緩衝液で37°Cで30分間処理しました。放出されたスフェロイドは、アルブミンの発現と望ましい生存率とともに、狭いサイズ分布で良好な球形形態を維持しました(図4B-D)。

図1:3D音響組立装置。 (a)3つのPZTトランスデューサを取り付けたPMMAチャンバからなる3D音響組立装置の上面図を示す模式図。(B)実際の3D音響組立装置を示す写真。(C)2つの関数発生器と3つの電力増幅器を接続した3次元音響組立装置の写真。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:音響的に組み立てられた細胞凝集体。 (a)3D音響集合体デバイスによって生成された細胞凝集体の作用機構を示す模式図で、細胞は音響放射力によって音響ノードに駆動される。(B)3D音響的に組み立てられた細胞凝集体を異なる視点から示した共焦点画像。(C)ハイドロゲル足場内の様々な層で形成された細胞凝集体を示す明視野画像。スケールバーは250μmを表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:GelMAスキャフォールド内での細胞凝集体からスフェロイドへの成長。 (A)3日間の培養期間後のコンパクトな細胞スフェロイドの形成を示す明視野画像。(B)回転楕円体サイズの定量化。(C)培養1週間後のハイドロゲル足場内のスフェロイドの生染色/死染色。(D)細胞スフェロイド生存率の定量化。スケールバーは250μmを表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:音響的に作製された細胞スフェロイドの回収。 (A)音響的に作製された細胞スフェロイドを回収するステップを示す図。(B)回収したスフェロイドを異なる倍率で表示した明視野画像。スケールバーは250μmを表します。 (C)回収したスフェロイドの生存率と機能性の分析。スケールバーは 100 μm を表します。 (D)回収後の回転楕円体のサイズ分布。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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