骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病における骨髄微小環境集団の同定

Summary

ここでは、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病のマウスモデルから骨髄微小環境集団を分離および特徴付けるための詳細なプロトコルが提示されます。この技術は、疾患の進行に伴う内皮細胞や間葉系間質細胞を含む非造血骨髄ニッチの変化を特定します。

Abstract

骨髄微小環境は、間葉系間質細胞、内皮細胞、骨系細胞、線維芽細胞などの異なる細胞集団で構成されており、造血幹細胞(HSC)を支えています。骨髄微小環境は、正常な造血幹細胞をサポートするだけでなく、骨髄異形成症候群(MDS)や急性骨髄性白血病(AML)などの造血幹細胞障害の発症にも関与しています。造血幹細胞におけるMDS関連変異は、特に高齢者において、分化不全および進行性骨髄不全を引き起こす。MDSは、未熟な骨髄芽球の急速な蓄積を特徴とする疾患である治療抵抗性AMLに進行することがよくあります。骨髄微小環境は、これらの骨髄性腫瘍の患者で変化することが知られています。ここでは、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病のマウスモデルから骨髄微小環境細胞を単離し、表現型的に特徴付けるための包括的なプロトコルが説明されています。骨髄ニッチ集団における変化を単離し、特徴づけることは、疾患の開始と進行におけるそれらの役割を決定するのに役立ち、骨髄間質集団における癌を促進する変化を標的とする新しい治療法の開発につながる可能性があります。

Introduction

骨髄微小環境は、造血細胞、非造血間質細胞、および細胞外マトリックスからなる^1,2。この微小環境は、造血幹細胞の自己複製を促進し、系統分化を調節し、骨組織に構造的および機械的支持を提供することができる1,2,3,4,5。間質ニッチには、骨系細胞、線維芽細胞、神経細胞、および内皮細胞⁶が含まれ、造血ニッチは、リンパ系および骨髄系集団^1,2,3からなる。骨髄微小環境は、正常な造血幹細胞をサポートするだけでなく、MDSやAML ^7,8,9,10,11などの造血幹細胞疾患の発症にも役割を果たす可能性があります。骨系細胞の変異は、MDS、AML、およびその他の骨髄増殖性腫瘍の発症を促進することが示されています^10,12,13,14。

骨髄異形成症候群は、造血幹細胞の突然変異から生じる前白血病疾患のグループです。MDSは、造血幹細胞の分化や異形成細胞の産生のブロックと関連していることが多く、骨髄不全につながることがよくあります。MDSは、米国で最も一般的に診断される骨髄性腫瘍であり、35%〜45%の3年生存率と関連しています¹⁵。MDSは、急性骨髄性白血病への形質転換のリスクが高いことと関連していることが多い。MDS由来のAMLはほとんどの治療法に耐性があり、再発する可能性が高いため、これは致命的な合併症になる可能性があります。造血幹および前駆細胞の転座または変異によりde novoで発生するAMLも、標準的な化学療法に耐性を示すことが多い^16,17。MDSとAMLは主に高齢者の疾患であり、大多数が60歳以上と診断されているため、ほとんどの患者は根治的骨髄移植に不適格です。したがって、疾患進行の新たな調節因子を同定する必要性は極めて大きい。骨髄微小環境は悪性細胞¹⁴を支持することができるので、疾患の進行に伴う骨髄ニッチの変化を定義することは、腫瘍ニッチのリモデリングを阻害することを目的とした新規治療薬の同定につながり得る。したがって、疾患進行の新たな調節因子を同定する必要性は極めて高い。この目的のためには、悪性細胞を支持する可能性のある骨髄間質細胞集団の変化を特定し、特徴付けることが重要です。

AMLおよびMDSのいくつかのマウスモデルが生成されており、疾患の開始および進行中の骨髄微小環境の変化を研究するために使用できます^{6,1,19,20,21,22}。ここでは、レトロウイルス誘発性AML ^6,20のマウスモデル、ならびに高リスクMDSからAMLへの形質転換¹⁹の市販のNup98-HoxD13(NHD13)モデルを用いて、骨髄間質細胞集団の変化を同定するプロトコルが記載されている。de novoAML細胞を移植したマウスは、20〜30^日でこの病気に屈します6。NHD13マウスは、15〜20週頃に血球減少症と骨髄異形成を発症し、最終的にAMLに変化し、マウスの約75%が32週頃にこの病気に屈します。マウスモデルの骨髄微小環境集団を解析するために、骨を採取し、骨髄と骨棘を酵素消化を用いて消化し、次に磁気選別によって細胞をCD45-/Ter119-非造血集団のために濃縮します。同様の分析は以前にも報告されています^が11,13,22,23,24,25、それらはしばしば骨髄または骨のいずれかに焦点を当てており、両方のソースからの細胞を分析に組み込んでいません。これらの集団の特性評価と遺伝子発現解析を組み合わせることで、細胞造血微小環境が疾患の開始と進行をどのようにサポートするかを包括的に理解することができます(図1)。以下に説明するプロトコルは、レトロウイルス誘発性AMLモデルと遺伝的MDSモデルに焦点を当てていますが、これらの戦略は、関心のあるマウスモデルの骨髄ニッチの変化を研究するために簡単に適応させることができます。

Protocol

すべての動物実験は、ロチェスター大学動物資源委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。マウスはロチェスター大学の動物飼育施設で飼育され、飼育されました。高リスクMDSをモデル化するために、市販のNHD13マウスモデル¹⁹が採用されています。このモデルでは、発症前の8週齢の雌のNHD13マウスで骨髄間質細胞を解析します。De novo(デ・ノボ)AMLは、前述の^ように生成されます^6,11,20。MLL-AF9やNRasなどのAMLを誘発するがん遺伝子にはGFPまたはYFPのタグが付けられており、フローサイトメトリーを用いた非白血病GFP-骨髄集団の解析が可能です。簡単に説明すると、10週齢の雌のC57BL/6JマウスにマウスGFP/YFP+ AML細胞を移植し、移植後2週間で骨髄を採取します。この研究ではデモンストレーション目的で雌マウスを使用していますが、このプロトコルは雄または雌のマウスで実施できます。また、1つの大腿骨またはすべての長骨を使用して行うこともできます。

1. 骨髄採取

注:動物の解剖プロトコルの詳細については、Amend et ^al.26を参照してください。

1. 乳鉢と乳棒を70%エタノールで洗浄し、冷やしたFACS緩衝液(表1)ですすぎ、収穫を開始する前に氷の上に置いて冷まします。また、MACsバッファー(表1)をベンチに置き、室温に達するようにします。
2. 施設の動物ケアと使用のガイドラインとプロトコルに従って動物を安楽死させます。
3. ベンチトップで、マウスの毛皮が濡れるまで70%エタノールを徹底的にスプレーします。鉗子と湾曲したハサミを使用して、腹部の皮膚を持ち上げ、マウスの腹部から外側に長さ約0.5mmの長さの2つの切開を行います。次に、腹部から遠位に0.5mmの切開を行います。引き下げて、マウスの足から皮膚と毛皮を取り除きます。
4. はさみを骨盤に対して垂直に置き、鉗子で大腿骨を引き上げながら押し下げます。大腿骨頭は骨盤から切り離す必要があります。膝蓋大腿関節で大腿骨と脛骨を分離します。骨を氷上の6ウェルプレートのFACSバッファーに入れます。
5. ラボグレードの組織を使用して骨から組織を除去し、洗浄した骨を氷上の新鮮なFACSバッファーを含む新しい6ウェルプレートに入れます。
6. すべての骨がバッファーに浸されるように、すべての骨を2〜5 mLのFACSバッファーを含む乳鉢に入れます(処理する骨の数に基づいてバッファーの量を調整します)。骨髄組織が放出されるまで、乳棒を使用して円を描くように骨を押しつぶして粉砕します。
7. 3 mLのシリンジを使用して、乳鉢から液体を引き上げたり洗い流したりして、骨髄を均質化します。
8. 3 mLのシリンジを使用して、モルタルから液体を引き上げ、70 μmのセルストレーナーで濾過し、氷上で50 mLのチューブに入れます。骨/組織の塊をフィルターからFACSバッファーでモルタルに戻し、ステップ1.7に戻って均質化して2回目の濾しを行います。これが骨髄画分を構成する。
9. 残りの骨片(スピキュール)をFACS緩衝液で乳鉢に洗い流し、FACS緩衝液を使用して15 mLチューブに洗い流し、細胞収量を最大にします。これが骨棘画分です。

2.骨髄の消化

1. 骨髄を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄みをデカントして廃棄します。
2. 骨髄を2 mLの骨髄消化混合物(表1)に再懸濁し、15 mLチューブに移します。ローテーター上で37°Cで45分間インキュベートします。
3. 10 mLのFACSバッファーを添加して、酵素消化を停止します。混合物を70 μmのセルストレーナーで濾過し、新しい50 mLチューブに入れます。
4. 混合物を400 x g で4°Cで7分間ペレット化します。
5. 骨髄ペレットを1 mLのRBC溶解バッファーに再懸濁します( 材料表を参照)。氷上で4分間インキュベートします。
6. 10 mLのFACSバッファーを添加して溶解を停止します。混合物を70 μmのセルストレーナーで濾過し、新しい50 mLチューブに入れます。
7. 混合物を300 x g で4°Cで5分間ペレット化します。 上清を除去し、ペレットを100 μLのFACS緩衝液に再懸濁します。

3.骨棘の消化

1. ステップ1.9の骨の棘をボルテックスし、落ち着かせます。上澄み液をデカントし、骨を底に保持します。
2. 骨棘を1 mLの骨棘消化混合物に再懸濁します(表1)。
3. チューブをチューブローテーターの上に置き、37°Cで60分間加熱します。
4. 10 mLのFACSバッファーを添加して、酵素消化を停止します。混合物を70 μmの細胞ストレーナーでろ過し、赤血球で溶解および消化した骨髄を含む50 mLチューブに入れます。

4. 染色

1. 骨棘と骨髄細胞懸濁液を静かに混ぜます。
2. 10 μL の細胞懸濁液を使用して、0.4% トリパンブルーベースの染色を用いて血球計算盤で生細胞数をカウントします(公開プロトコル²⁷ に記載されています)。細胞懸濁液から50,000個の細胞を採取し、未染色コントロールを行います。
3. 残りの細胞を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を除去し、100 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
   注:抗体を滴定して、理想的な希釈率を決定することができます。抗体の選択(エピトープおよび蛍光色素)はカスタマイズできます。
4. 磁気枯渇抗体による染色には、FCブロック(25 x 10⁶ 細胞あたり1 μL)、CD45-APC(25 x 10⁶ 細胞あたり10 μL)、およびTer119-APC(25 x 10⁶ 細胞あたり4 μL)を追加します( 材料表を参照)。
5. 氷上で20分間インキュベートします。FACS緩衝液で洗浄し、50,000個の細胞(~50 μL)を除去してAPC染色コントロールとし、300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、100 μLのFACS緩衝液に再懸濁します。
6. 細胞懸濁液をマイクロビーズで染色して磁気を枯渇させるには、mIgG(25 x 10⁶ 細胞あたり8 μL)および抗APCマイクロビーズ(25 x 10⁶ 細胞あたり20 μL)を添加します( 材料表を参照)。
7. 氷上で20分間インキュベートします。10 mL FACSバッファーで洗浄し、300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。

5. 磁気選別による試料の枯渇

注意: この手順は、製造元の指示に従って、市販の手動磁気分離器を使用して実行されます。このステップは、自動セパレーターを使用して実行することもできます( 材料表を参照)。

1. LD カラムを 2 mL の MAC バッファーで洗浄して調製します(表 1)。廃液を廃棄し、収集チューブを交換します。
2. 最大 1 x 10⁸ 細胞を MAC 緩衝液に再懸濁し、35 μm セルストレーナーキャップ付きの 5 mL 試験管でろ過します。
3. LDカラムを磁気セパレータースタンドに置きます。5 mL の試験管をカラムの下に置き、溶出液を回収します。
4. 調製したLDカラムに細胞懸濁液を添加します。負の画分をコレクションチューブに流します。カラムを 1 mL の MACs バッファーで 2 回洗浄し、溶出液を同じチューブに回収します。これは、以下の手順5.6で使用される負の分数です。
5. LDカラムを磁気分離器スタンドから取り外し、新しい5 mL試験管に置きます。ピペットを使用してカラムに 3 mL のバッファーを分注し、カラムプランジャーを使用してポジティブ標識された細胞を洗い流します。
6. ネガティブフラクションとポジティブ画分を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 それらを100 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
7. 10 μL の陰性画分と陽性画分を 0.4% トリパンブルーでカウントします。以下の骨分析/内皮パネル染色の量は、この細胞数に基づいています。
8. 陽性画分から50,000個の生細胞をフローサイトメトリーゲーティングコントロールに使用します。

6.骨分析/内皮パネル染色

注:補正は、すべての適切な染色およびゲーティングコントロールを含む、標準的なフローサイトメトリープロトコルに従って実行する必要があります。

1. CD45/Ter119陰性画分(1 x 10⁶ 細胞あたり各抗体1 μL)の染色には、CD31-PE-Cy7、Sca-1-BV421、CD51-PE、およびCD140a-PE-Cy5を添加します( 材料表を参照)。
2. 氷上で20分間インキュベートします。2 mLのFACSバッファーで洗浄し、300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
3. 生染色用に 1 mL の FACS バッファーと 1:1000 に希釈した PI を加え、35 μm セルストレーナーキャップ付きの 5 mL 試験管でサンプルをろ過します。
4. マルチカラーフローサイトメーターで細胞を解析します。

Results

本稿では、MDSおよび白血病マウスモデルから、内皮細胞や間葉系間質細胞などの骨髄微小環境集団を解析するためのフローサイトメトリーベースの手法について説明します(図1)。 図2 は、前方散乱および側方散乱プロファイルによる消化およびCD45/Ter119枯渇画分の細胞(P1)の選択から始まる、目的の集団を検出するためのゲーティング戦略を示しています。白血病サンプル中の細胞のゲーティングの例をP1に示します(図2A)。シングレットが選択され、ダブレットはこの分析から除外されます(P2)(図2B)。 図2C は、プロピジウムヨウ素陰性の生細胞P3を選択するためのゲートを示しています。非造血間質集団に着目するため、CD45-/Ter119-、P4(APC、Y軸) 対SSC-Aが選択されています(

Discussion

マウス白血病モデルは、侵攻性骨髄性白血病の進行を促進する細胞内因性およびニッチ主導のシグナルを特定するために広く使用されています^6,19,21。ここでは、MDSおよびAMLのマウスモデルにおける骨髄微小環境の細胞組成を定義するための包括的なフローサイトメトリーベースのプロトコルが提示されます。

実験サンプルからフローサイトメトリーデータを取得する前に、蛍光のオーバーラップを慎重に補正することが重要です。また、適切な染色およびゲーティングコントロールをすべて含めることも不可欠です。これらのステップにより、実験者は、陽性または陰性の抗体染色が目的の細胞マーカーの正確な発現を表し、蛍光スペクトルの重複または自家蛍光のアーチファクトではないことを確認できます。このプロトコルは指定セル表面のマーカーを記述するが、抗体のパネルは実験必要性に基づいて拡張することができる。例えば、CD144(Ve-Cadheri...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mLピペットのヒント	ジェネシー・サイエンティフィック	24-165RL
1.7 mL 微量遠心チューブ	AVANT	L211511-CS
10 µLピペットのヒント	ジェネシー・サイエンティフィック	24-140RL
10 mL 個別包装滅菌血清ピペット	Globe scientific	1760
1000 mL 真空ろ過フラスコ	NEST	344021
15 mL 遠心分離チューブ	VWR	10026-076
2 mL 吸引ピペット	NEST	325011
200 & micro;Lピペットのヒント	ジェネシー・サイエンティフィック	24-150-RL
25 mL 個別包装滅菌血清ピペット	グローブ	1780
5 mL 個別包装滅菌血清ピペット	グローブ	1740
5 mL ポリスチレン丸底チューブ  12 x 75 mm スタイル	ファルコン	352054
5 mL ポリスチレン丸底チューブ セルストレーナーキャップ付き 12 x 75 mm スタイル	ファルコン
50 mL 遠心分離チューブ	NEST	602052
6 ウェル、平底、低蒸発蓋	ファルコン	353046
防水防湿バリア付き吸収性アンダーパッド	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro セパレーター	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen 精製ラット 抗マウス CD16/CD32 (マウス BD FC ブロック)	BD Biosciences	553141	0.5 mg/mL
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) 抗体 (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	664
Carbon dioxide Gas Tank	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 & micro;m ナイロン	ファルコン	352350
コールパーマーエッセンシャルモルタルと乳棒;瑪瑙、125 mL	コールパーマー	EW-63100-62
コラゲナーゼ Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
コラゲナーゼ I 型	STEMCELL	7415
Corning ミニ遠心分離機	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼ I	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II、粉末	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
エタノールアブソリュート、KOPTEC、BP、Ph. Eur.、USP (200 Proof)	VWR	89125-174	の分析仕様に適合
細かいはさみ - シャープ	ファインサイエンスツール	14061-10
ファンデーションB ウシ胎児血清	GeminiBio	900-208
ギルソン PIPETMAN L ピペットスターターキット	フィッシャーサイエンティフィック
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
血球計算盤	Fisher	02-671-10
インキュベーター	バイン	ダーC150-UL
キムワイプ	キムテック	K222101
LABGARDクラスII、タイプA2 生物学的安全キャビネット	Nuaire	NU-425-400
LDカラム	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSEボルテックスミキサー	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACSマルチスタンド	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix チューブ ローテーター	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	ミリポアシグマ	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) マウス	ジャクソン研究所
PE anti-mouse CD51 抗体 (RMV-7)	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a 抗体 (RUO)	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL 水溶液	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS セパレータ	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plusシリーズ遠心分離機	Thermo Scientific
TER-119 モノクローナル抗体 (TER-119)、APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
トリパンブルー溶液 0.4%	Gibco	15-250-061
超高純度 0.5 M EDTA、pH 8.0	インビトジェン	15575-038