良性胃体および外皮上皮の生検からの患者由来胃オルガノイドの確立と特性評価

サマリー

胃患者由来オルガノイドは研究での利用が増加しているが、標準化された播種密度を持つ単一細胞消化物からヒト胃オルガノイドを生成するための正式なプロトコルが不足している。このプロトコルは、上部内視鏡検査中に得られた生検組織から胃オルガノイドを確実に作成するための詳細な方法を提示します。

要約

胃患者由来オルガノイド(PDO)は、胃の生物学と病理学を研究するためのユニークなツールを提供します。その結果、これらのPDOは、幅広い研究用途での使用が増加しています。しかし、標準化された初期細胞播種密度を維持しながら、単一細胞消化物から胃PDOを産生するための公表されたアプローチは不足しています。このプロトコルでは、重点は隔離された単一細胞からの胃のオルガノイドの開始および分裂によってオルガノイドを継代の方法の提供にある。重要なことに、このプロトコルは、最初の細胞播種密度への標準化されたアプローチが、良性の生検組織から胃オルガノイドを一貫して生成し、オルガノイド増殖の標準化された定量化を可能にすることを示しています。最後に、胃PDOは、オルガノイドが体の生検に由来するか、胃の胞状領域に由来するかに基づいて、さまざまな形成速度と増殖速度を示すという新しい観察結果を裏付ける証拠があります。具体的には、オルガノイド開始に門生検組織を使用すると、胃本体の生検から生成されたオルガノイドと比較して、より多くのオルガノイドが形成され、20日間にわたってオルガノイドの成長が速くなることが明らかになりました。本明細書に記載されているプロトコルは、研究者に胃PDOを正常に生成および操作するためのタイムリーで再現性のある方法を提供します。

概要

オルガノイドは、オルガノイドの元となった器官の構造や機能に似た、ミニチュアの3次元(3D)細胞構造です^1,2。これらのラボで培養されたモデルは、幹細胞または組織特異的細胞を制御された環境で培養することによって作成され、これらの細胞が自己組織化してさまざまな細胞型に分化できるようにします^1,2,3。オルガノイドの主な利点の1つは、従来の2次元(2D)細胞培養よりもヒトの生物学をより詳細に再現できることです^1,2,3。特に、ヒトオルガノイドは、その起源組織の遺伝的多様性を維持することが示されている^3,4,5。オルガノイドは、ヒトの臓器発生を研究し、疾患をモデル化し、制御された実験室環境で潜在的な治療法をテストするユニークな機会を提供します。さらに、オルガノイドは個々の患者サンプルから誘導できるため、個別化医療のアプローチと個別化治療の開発の可能性が可能になります^3,6,7。

研究者は、ヒト胃オルガノイドを使用して、胃の生物学と病理学のさまざまな側面を調査してきました。顕著な例としては、患者由来オルガノイド(PDO)を使用して胃がんの化学^{療法反応を予測し8,9,10}、ヘリコバクター・ピロリ感染に対する上皮反応をモデル化することが挙げられます11,12,13。ヒト胃オルガノイドは、頸部細胞、ピット細胞、その他の支持細胞など、胃に見られるさまざまな種類の細胞で構成されています^11,14。胃オルガノイドは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)から作製するか、生検で得られた胃組織から直接単離された幹細胞、または胃切除標本から作製することができる^11,14。胃組織からの胃幹細胞の単離は、通常、胃腺を単離して培養するか、組織サンプルを酵素的に消化して単一細胞を遊離することによって行われます^9,13,15。重要なことに、これらの技術のいずれかを使用して生成された胃オルガノイド内の細胞の分化は、類似していることが示されています¹³。本明細書に記載のプロトコールは、単一細胞消化物に焦点を当てる。

オルガノイドは、従来の細胞培養と臓器全体のギャップを埋める科学的イノベーションです。この分野の研究が進むにつれ、オルガノイドは幅広い用途でより効果的な治療法や治療法の開発に貢献する態勢を整えています。胃PDOの利用が増加していることを考えると、その生成に対する標準化されたアプローチがタイムリーに必要とされています。ここでは、上部内視鏡検査中に獲得した良性の胃生検組織から単離された単一細胞からヒト胃PDOを生成するためのプロトコルが記載されている。重要かつユニークなのは、標準化された数の単一細胞が播種のために決定され、胃PDOを確実に生成し、その後の特性評価を可能にすることです。この技術を使用すると、胃本体または胃前庭部のいずれかの生検から生成されたオルガノイドの形成と成長の信頼できる違いが実証されます。

プロトコル

このプロトコルで利用されるすべてのヒト組織は、ペンシルベニア大学治験審査委員会(IRB#842961)によって承認された胃組織収集研究を通じて、組織収集にインフォームドコンセントを提供した個人から収集されました。この研究の参加者は、日常的なケアの一環として上部内視鏡検査を受け、18歳以上であり、インフォームドコンセントを提供できる必要がありました。実施されたすべての研究は、ペンシルベニア大学が定めたガイドラインに準拠しています。

1. 実験準備

1. 前述のように、コンディショニングされたL-WRNメディアを準備します¹⁶.必須ではありませんが、コンディショニング培地に含まれるWnt-3A、R-spondin、およびnogginの濃度は、メーカーの指示に従って市販のELISAキットを使用して確認できます( 材料表を参照)。
2. RPMI-抗生物質(RPMI-ABX)、PBS-抗生物質(PBS-ABX)、PBS-ジチオスレイトール(PBS-DTT)、消化バッファー、および胃オルガノイド培地を調製します(詳細な組成については 補足表1 を参照)。胃オルガノイド培地は4°Cで1週間安定です。
3. オートクレーブ鉗子、細かい解剖ハサミ、1.5 mLチューブ。
4. 基底膜マトリックス(マトリゲル)を氷上で融解し始めます。
5. 消化バッファーとトリプシン-EDTAを37°Cのウォーターバスで解凍します。
6. インキュベーターオービタルシェーカーを37°C、200rpmに設定します。

2. 生検組織からの単一細胞の単離

1. 上部内視鏡検査中に胃生検を収集します 施設の臨床プロトコルに従った¹⁷ 、おそらくジャンボ鉗子の使用を含む。先端が鈍い針を使用して鉗子から組織サンプルを抽出し、RPMI-ABX培地を含む15 mLのコニカルチューブに入れます。チューブを氷上に置いて、実験室に迅速に移します。
   注:少なくとも、2〜4回の生検を収集する必要があります。
2. 生検組織を円錐形チューブの底に落ち着かせます。ピペットを使用して培地を吸引し、生検を1 mLのPBS-ABXバッファーで2回洗浄します。組織片は円錐形のチューブに自然に沈殿するため、遠心分離の必要はありません。
3. 最低 20 mg の生検組織を、1 mL の PBS-DTT を含む 1.5 mL チューブに移します。
4. 細かい解剖ハサミを使用して、組織を1〜2mm以下の断片に切断します。
5. 卓上ミニ遠心分離機を15秒間使用して、チューブの底部に組織片を凝集させ、できるだけ多くの上清を吸引します。PBS-DTTの残存量は少量でも許容されます。
6. 50 mLのコニカルチューブに、新たに加温した消化バッファー5 mLを加えます。組織を失わずに小さな組織片を移すには、消化バッファー 500 μL を採取し、組織を含む 1.5 mL チューブに加えます。次に、1000 μLのピペットチップの先端をハサミで修正してチップの直径を大きくし、消化バッファーを含む50 mLのコニカルチューブに組織片を簡単に吸引して移せるようにします。
7. 消化バッファーと組織ミックスを37°Cで30分間インキュベートし、200rpmでオービタル振とうします。
8. 0.25% EDTAを含む加温したトリプシン5 mLを消化バッファーに加え、200rpmでオービタル振とうしながら、37°Cでさらに10分間インキュベートします。
9. 同量のAdvanced(Adv.)DMEM/F12培地を添加して消化バッファーとトリプシンを中和し、溶液を70 μmのセルストレーナーに通します。
10. 1400 x g で4°Cで4分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。 生検組織の初期サイズに応じて、小細胞ペレットが見えることもあれば見えないこともあります。
11. 細胞ペレットを1 mLのAdv. DMEM/F12培地に再懸濁し、Trypan Blueと血球計算盤を用いて生細胞数をカウントします。
12. 4°Cで4分間、1400 x g で遠心分離を行い、細胞を再度ペレット化し、上清を除去します。
    注: 図1 は、生検組織から単一細胞を単離するプロセスの概略図を示しています。

3. 基底膜マトリックス「ドーム」への単一細胞の埋め込み

1. カウントされた生細胞の数に基づいて、基底膜マトリックス50μLあたり10⁵ 個の生細胞の最終濃度を達成するために必要な基底膜マトリックスの量を計算します。
2. めっき前に基底膜マトリックスが重合しないように、以下を速やかに行ってください。融解した基底膜マトリックスを氷から取り出し、以前に計算した基底膜マトリックスの容量を細胞に加え、ピペッティングで約10秒間上下させて静かに混合します。
   注:このステップでは、気泡が発生しないようにすることが重要です。基底膜マトリックスを希釈しないでください。
3. 基底膜マトリックス/細胞混合物の50 μLアリコートを、24ウェル組織培養プレート内の個々のウェルの中央に迅速にピペットで移します。
4. すぐに24ウェルプレートを覆い、1回の滑らかな動きでプレートを逆さまにします。反転プレートを37°Cの組織培養インキュベーターに35分間入れて、基底膜マトリックスを重合させます。
   注:プレートを反転させることは、細胞がプレートの底に沈むのを防ぎ、基底膜マトリックスを3D「ドーム」形状に重合させるために不可欠です。
5. 予め温めた胃オルガノイド培地500 μLを各ウェルに加え、各「ドーム」の上部が培地に完全に浸かるようにします。「ドーム」を乱さないように、各ウェルの側面にメディアを分配します。
6. 2〜3日ごとにメディアを交換してください。

4. 断片化による オルガノイドの日常的な継代

1. オルガノイドの継代準備が整ったら、指定された各ウェルから培地を取り出します。
   注:継代の適切な時期を決定するには、代表的な結果のセクションを参照してください。
2. 氷冷したAdv. DMEM/F12培地1 mLを、地下のメンブレンマトリックス「ドーム」に直接分注します。これにより、「ドーム」の解体が容易に開始されます。「ドーム」のすべての破片がプレートから剥がれるまで、吸引と分注を続けます。
3. 培地と断片化された基底膜マトリックスの両方を次のウェルに輸送し、継代が予定されているすべてのウェルに対してこのプロセスを繰り返します。最終的な基底膜マトリックス「ドーム」を分解した後、培地とオルガノイドおよび基底膜マトリックスの混合物を 1.5 mL チューブに分注します。
4. 1000 μL チップを P1000 ピペットに取り付け、このチップを 200 μL チップに挿入します。これにより、オルガノイドを断片化するのに十分な直径のピペットチップが作成され、さらに大きな容量の吸引が可能になります。
5. オルガノイドと基底膜マトリックスの混合物を約25回上下に激しくピペットで移し、オルガノイドを細かく断片化します。
6. 断片化したオルガノイド混合物を卓上遠心分離機で4°C、2000 x gで30秒間遠心分離します。これにより、断片化されたオルガノイドのペレットが基底膜マトリックスおよび培地から分離されます。ピペットを使用して、培地と基底膜マトリックス上清を吸引します。ペレットが緩んでいるため、上澄み液を吸引するために真空を使用しないでください。
7. ウェル/ドームの数が1:2の比率(50 μL/ドーム)に分割されるように、融解したばかりの基底膜マトリックスの容量を計算します。新鮮な基底メンブレンマトリックスを加え、気泡を作らないように注意しながら、静かに上下にピペットで混ぜます。
8. オルガノイド断片と基底膜マトリックスの混合物 50 μL を 24 ウェルプレートの個々のウェルに迅速に分注します。
9. プレートを覆い、裏返して37°Cの組織培養インキュベーターに35分間入れ、基底膜マトリックスを重合させます。
10. 予め温めた胃オルガノイド培地500 μLを各ウェルに加えます。
    注: 図2 は、断片化による胃患者由来オルガノイドの継代の概要を示しています。

結果

その後の代表的な結果は、上部内視鏡検査を受けている5人の異なる患者の胃本体と胃の前部領域の両方の良性上皮から採取された生検から得られます。2〜4個の「ドーム」/ウェルを播種し、胃小体生検と前庭生検の両方について患者ごとに分析しました。オルガノイドは、5人の患者全員の胃体と胃前庭部生検組織から正常に生成されました。平均して、41のオルガノイドが「ドーム」/ウェルあたり分析されました。すべての画像は共焦点顕微鏡を使用して取得されたz投影であり、オルガノイドのサイズと球形度の定量化は、市販の画像解析ソフトウェアを使用して行われました( 材料表を参照)。

オルガノイドは一般に、単一細胞の播種後10日以内に同定可能です(図3A)。20日目までに、オルガノイドは大きくなり、通常は継代する必要があります。単一細胞播種後に形成されるオルガノイドの数は多少変動する可能性がありますが、体生検および幽閉胃生検から形成されるオルガノイドの数について予想される結果を 図3B...

ディスカッション

本明細書では、胃本体および前庭部からの良性上皮の生検から単離された単一細胞からヒト胃オルガノイドを確実に生成するための詳細なプロトコルが概説される。プロトコルの重要なステップは、タイミングと基底膜マトリックスの取り扱いを中心に展開します。生存率を維持するためには、生検組織を取得した後、できるだけ早くプロトコルを開始することが不可欠です。目的は、生検が実施されてから30分以内に生検組織の消化を開始することです。また、基底膜マトリックスの取り扱いも困難な場合があります。氷の上で解凍すると、液体のままです。ただし、4°Cを超える温度では重合します。したがって、基底膜マトリックスを氷から迅速に移し替えて、単一細胞またはオルガノイド断片と混合して「ドーム」をプレーティングすることは、1分以内に重合を開始するため、迅速に行う必要があります。チューブ内で重合すると、ピペットチップに吸引することはできません。これが発生した場合は、マトリゲルが解重合して液体に戻るまで、チューブを氷上に置くことができます。ピペッティングを静かに上下させて単一細胞またはオルガノイド断片を基底膜マトリックスと混合する場合、気泡を発生させないことも重要です。基底膜マトリックス「...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
アムホテリシン B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
ディスパーゼ II	Σ	D4693-1G
ジチオスレイトール (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
菌類	InvivoGen	NC9326704
ガストリン I	Σ Aldrich	G9145
ゲンタマイシン	1570060
グルタマックス	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN 細胞株	ATCC	CRL-3276
マトリゲル	コーニング	47743-715
メトロニダゾール	MP バイオメディカル	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA キット	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen 連鎖球菌	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA キット	R&Dシステム	ズDY4120-05
Wnt-3a ELISAキット	R&Dシステムズ	DY1324B-05
Y-27632	Sigma アルドリッチ	Y0503