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方法論記事

デング熱NS1抗原の比色および定量検出のためのスマートフォンアプリケーションと組み合わせたポータブル紙ベースのイムノアッセイ

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DOI:

10.3791/66130

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2024年1月26日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Islam Indonesia, 2School of Bioresources and Technology, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 3Department of Otolaryngology, Phramongkutklao Hospital and College of Medicine, 4Sensor Technology Laboratory, Pilot Plant Development and Training Institute, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 5Biosciences and Systems Biology Research Team, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Sciences and Technology Development Agency at King Mongkut's University of Technology Thonburi

この記事について

サマリー

ここでは、デング熱の診断ニーズに応えるため、臨床血清・血液サンプル中のデング熱NS1抗原濃度を定量するスマートフォンアプリ内蔵デング熱NS1紙ベース分析装置(DEN-NS1-PAD)をご紹介します。このイノベーションは、リソースが限られているものも含めて、さまざまな医療現場での臨床的意思決定を支援することで、デング熱の管理を強化します。

要約

ネッタイシマカによって媒介されるデングウイルス(DENV)感染症は、熱帯および亜熱帯諸国における主要な公衆衛生上の懸念事項です。年間約1,000万人の患者と20,000〜25,000人の死亡者、特に子供の間では、実用的な診断ツールが緊急に必要とされています。デング熱の非構造タンパク質1(NS1)は、感染初期にサイトカインの放出、血管漏出、内皮機能障害と関連しており、重度のデング熱のマーカーとなる可能性があります。

ラテラルフローアッセイ(LFA)やマイクロ流体紙ベースの分析デバイス(PAD)などの紙ベースのイムノアッセイは、その簡便性、迅速性、安価性、特異性、および解釈の容易さから、診断検査として人気を博しています。しかし、デング熱NS1検出のための従来の紙ベースのイムノアッセイは、通常、目視検査に依存しており、定性的な結果しか得られません。この限界に対処し、感度を高めるために、スマートフォンアプリケーションを比色および定量リーダーとして統合した、紙ベースの分析装置(PAD)でのポータブル性の高いNS1デング検出アッセイ、つまりDEN-NS1-PADを提案しました。この開発システムにより、臨床サンプル中のNS1濃度を直接定量することができます。

患者から採取した血清・血液サンプルを用いて、システムの試作性能を実証しました。結果はすぐに得られ、設備の整った医療施設とリソースが限られている環境の両方で、臨床評価に採用できます。紙ベースのイムノアッセイとスマートフォンアプリケーションのこの革新的な組み合わせは、デング熱NS1抗原の検出と定量を強化するための有望なアプローチを提供します。このシステムは、肉眼の能力を超えて感度を高めることにより、特に遠隔地やサービスの行き届いていない地域におけるデング熱管理における臨床的意思決定を改善する大きな可能性を秘めています。

概要

デングウイルス(DENV)感染症は、蚊が媒介する病気としては最も急速に広がり1、世界では年間3億9,000万人以上が9,600万人の症候性感染症に感染し、200万人が重症化し、2万5,000人以上が死亡しています1,2。世界保健機関(WHO)によると、推定39億人がデング熱のリスクにさらされています。~70%がアジア太平洋諸国、主に東南アジアに住んでいます3.2019年にWHOに報告されたデング熱の症例数は420万人で、タイでは少なくとも136,000人のデング熱患者と144人のデング熱感染による死亡例が144件ありました4。タイでのデング熱の流行は、4月から12月までの雨季に、都市部と農村部、特に北東部で発生します。

DENV感染症は、無症候性症状、軽度のデング熱(DF)から重度のデング出血熱(DHF)まで、さまざまな臨床症状を示します。重度のDHF状態の主な特徴は、血管透過性の増加であり、ショックと臓器機能障害が続きます1。血管漏出を引き起こす可能性のある分子経路を理解することは、効果的なデング熱治療薬を開発する上で非常に重要です。デング熱の非構造タンパク質1(NS1)は、ウイルス感染初期に分泌される糖タンパク質であり5,6、ウイルスRNA複製の補因子として機能します7。NS1は、サイトカインの放出を誘発し、Toll様受容体4(TLR4)および内皮グリコカリックス8,9に結合することにより、血管漏出に寄与します。In vitroの研究により、NS1は内皮細胞と相互作用し、アポトーシスを誘導することが示されています。この状態は、内皮機能障害および血管漏出に寄与し得る10。血清インターロイキン(IL)-10レベルと相関するNS1抗原レベルは、重度の臨床疾患を有する患者で有意に増加した11。デング熱NS1は、IL-10を誘導し、DENV特異的T細胞応答を抑制することにより、疾患の病因にも寄与します12,13。さらに、デング熱NS1タンパク質は重篤な臨床疾患に関連しており、発症後3日間のNS1>600ng mL-1の濃度はDHF14の発症と関連していた。

DHF患者におけるデング熱NS1抗原の持続性は、重症デング熱6のマーカーとして使用できる可能性があります。臨床サンプル中のNS1を検出するには、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)や迅速検査15など、いくつかの方法があります。臨床現場でNS1タンパク質の濃度を測定するためのゴールドスタンダードは、ELISA法です。しかし、ELISA法は高価であり、熟練した人員と実験設備を必要とする16。そのため、ポイントオブケア検査(POCT)でNS1タンパク質を検出・定量する技術の開発は、現在も進行中です。過去10年間で、ラテラルフローアッセイ(LFA)やマイクロ流体紙ベースの分析デバイス(μPAD)などの紙ベースのイムノアッセイは、その簡便性、迅速性、安価さ、特異性から、診断テストとして人気を博しています17,18,19。紙ベースのイムノアッセイでは、金ナノ粒子(AuNP)20、磁性ナノ粒子21,22、量子ドット23、蛍光物質24,25など、いくつかの標識がシグナルを生成するために使用されています。AuNPは、製造コストが安価で、製造が容易で、安定性があり、読み出しが簡単なため、紙ベースのイムノアッセイで使用される最も一般的な標識です。現在、デング熱NS1のラテラルフローアッセイ(LFA)は、臨床現場で使用されていることで有名です26,27。しかし、従来のLFAラベル検出は肉眼で行うのが一般的で、定性的な結果しか得られません。

過去10年間で、50億台以上のスマートフォンが世界中で広く使用されており、ポータブル検出を開発する可能性があります28,29。スマートフォンは、内蔵の物理センサ、マルチコアプロセッサ、デジタルカメラ、USBポート、オーディオポート、ワイヤレス、およびアプリケーションソフトウェアなどの多機能容量を有しており、様々なバイオセンサプラットフォームでの使用に適している30。さらに、無線技術により、データを迅速に送信することができ、リアルタイムおよびオンサイト監視に使用することができる31。Mudanyaliらは、紙ベースのイムノアッセイとスマートフォンを組み合わせて、マラリア、結核、HIV用のポータブルで機器不要、迅速、低コスト、ユーザーフレンドリーなPOCTプラットフォームを開発しました32。Lingらは、牛乳中のアルカリホスファターゼ活性を定量的に検出するために、スマートフォンのカメラと組み合わせたラテラルフローアッセイを報告しました33。Houらは、ラテラルフローアッセイにおける色または蛍光からの定量的シグナルのためのスマートフォンベースのデュアルモダリティイメージングシステムも開発した34。さらに、スマートフォンを比色および定量的リーダーとして使用すると、肉眼ではターゲット35の存在を自信を持って報告できない一方で、感度を向上させることができる。

デング熱診断のブレークスルーを示すDEN-NS1-PAD36,37,38(以下、デバイスと呼ぶ)は、ポータブルで効率的なソリューションを提供します。ワックス印刷によるマイクロ流体紙ベースの技術を用いて、画像処理によりNS1を高感度かつ特異的に定量する装置です。その実用性をさらに高めるために、比色測定と定量読み取りのためのユーザーフレンドリーなスマートフォンアプリを開発しました。タイの病院からの患者サンプルを使用した臨床検証は、リアルタイムの患者評価への直接的な影響を強調しています。当社のイノベーションは、合理化されたポイントオブケアデング熱管理における極めて重要な進歩を示し、リソースが限られている医療環境における診断に革命を起こすことを約束します。

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プロトコル

タイ王国陸軍医療局、プラモンクットクラオ病院、バンコク、タイの治験審査委員会の倫理委員会(IRBRTA 1218/2562)が承認を与えました。この調査を実施するにあたり、必要なすべての倫理規定を遵守しました。

1. 紙製イムノアッセイの装置作製

注:紙ベースのイムノアッセイデバイスは、以前に確立された方法36、37、およびタイ特許請求第19010081638号に従って製造されました。

  1. デザインとパターン描画:コンピュータ上で18個のPADワックスパターンを使用して紙分析装置(図1A、B)を設計します。
    注:デザインは特殊で、A5サイズの用紙を対象としています。PADの数は、ユーザーの要求に応じて用紙のサイズに関連しています。
  2. デザインしたパターンをワックスプリンターでセルロース紙に印刷します(材料表)。
  3. ワックス印刷した紙を実験用オーブンで150°Cで75秒間溶かします。 その後、その後のステップで必要になるまでシリカボックスに保管してください。
  4. 0.5 μL の 0.025% ポリ-L-リジン(PLL)を試験領域とコントロール領域の両方に塗布します。シリカボックス内で室温(RT)で2分間インキュベートした後、65°Cのオーブンで5分間加熱します。
  5. 0.5 μL の 1 μg μL-1 のヤギ抗マウス IgG 抗体をコントロール領域に、0.5 μL の 1 μg μL-1 捕捉抗体を試験領域に適用します。滴を室温のシリカゲルボックスで30分間乾燥させます。
  6. ブロッキングバッファーをサンプル領域に 2 μL、コンジュゲート領域に 3 μL、検出領域に 2 μL を塗布します。滴をシリカゲルボックス内の室温で30分間乾燥させます。
  7. 2 μLの金ナノ粒子-抗体複合体(AuNPs-Ab)溶液をコンジュゲート領域に塗布し、室温のシリカゲルボックス内で30分間乾燥させます。

2. 紙ベースのイムノアッセイの組み立て

  1. 粘着プラスチックバッキングカードの裏側にある保護フィルムを慎重に剥がして、粘着剤を露出させます。
  2. 処理したセルロース紙を粘着プラスチックのバッキングカードに合わせ、2つの層をしっかりと押し付けます。
    注意: デバイスの汚染や損傷のリスクを最小限に抑えるために、親水性フィールドに触れないでください。
  3. プラスチックフィルムを貼って紙をコーティングし、紙を押し付けます。
  4. 完全に組み立てられたデバイスのシートからはさみを使用して、目的のデバイスを切り取ります。
  5. これで、DEN-NS1-PAD(図1C)を使用する準備が整いました。長期安定性のために、4°Cで保管してください。

3. AuNPs-Ab複合体の作製

注:AuNPs-Abは、Prabowoらによって以前に記述されたように調製されました36。

  1. PBS 溶液中の 1 mg mL-1 抗 NS1 抗体 10 μL、40 nm AuNPs コロイド 1 mL、0.1 mL の 0.1 M ホウ酸バッファー (pH 8.5) を組み合わせます。
  2. 混合物を50rpmで60分間回転させ、室温でインキュベートします。
  3. 0.1 mL の 10 mg mL-1 BSA を BBS に添加し、50 rpm で回転させ、室温で 15 分間インキュベートします。
  4. 溶液を20,187 × g 、4°Cで30分間遠心分離します。
  5. 沈殿したAuNPs-Abから上清を慎重にピペットで分離します。
  6. AuNPs-Abを500μLのBBSに再懸濁し、超音波処理を用いて分散させる。
  7. 20,187 × g 、4°Cで30分間遠心分離を繰り返します。
    注:分散と遠心分離のプロセスを3回繰り返します。
  8. 懸濁液に50 μLのコンジュゲートバッファーを添加し、コンジュゲート領域に適用できるように準備を整えます。

4. モバイルアプリケーション開発

  1. 画像処理・機械学習開発
    1. DEN-NS1-PADのオートフォーカス画像を900枚以上収集し、さまざまな濃度、カメラの銘柄(12〜13メガピクセル)、回転(90° と 180°)、照明設定などのさまざまな条件をキャプチャして、教師あり画像モデルのデータセットを収集します。それぞれの条件で 30枚 を目安にしてください。
    2. 教師あり学習のために収集された画像内のテスト領域と制御領域として、2 つの関心領域を識別し、注釈を付けることで、グラウンド トゥルースにラベルを付けます。
    3. 背景ストリップを識別するアルゴリズムを設計します。テスト領域と制御領域の間の中心線を特定し、その中点を計算し、同じ回転方向を維持しながら、2 つの主要領域の平均サイズに比例する正方形の領域を確立します。
    4. ステップ 4.1.1 と 4.1.2 のデータセットとグラウンド トゥルース ラベルを使用して画像セグメンテーション モデルを作成し、関心領域を特定するためのイメージ セグメンテーション モデルにトレーニングします。
  2. アプリケーションアルゴリズム
    1. 学習済みのイメージ セグメンテーション モデルを新しいイメージに適用して、テスト領域、コントロール領域、および背景領域を自動的に特定します。
    2. 基本的な画像処理手法を使用して、3 つの関心領域 (テスト、コントロール、バックグラウンド) のそれぞれについて単一の強度値を取得します。
    3. イメージを 3D 配列表現 (y, x チャネル) に変換して、ピクセル値にアクセスします。
    4. RGB値を平均化して画像をグレースケールに変換し、式(255-x)で反転を適用します。
    5. 背景領域の値を差し引いて、テスト領域と制御領域の値を正規化します。
    6. あらかじめ設定された検量線を使用して、NS1 の濃度を計算します。
    7. 正規化されたグレースケール強度から導出されたカットオフ値0.1103に基づいて、結果を正または負に分類する37。

5. 検量線と感度

  1. 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、および1.0 μg mL-1の濃度でキャリブレーションするために、ヒト血清中のNS1サンプルを調製します。
  2. 各濃度 50 μL をサンプル領域に滴下し、3 回に分けて測定を行います。
  3. サンプルがデバイスに完全に吸い込まれるのを待ちますが、結果が得られるまでに20〜30分かかる場合があります。
  4. 5分間のインキュベーション後、デジタルカメラまたはスマートフォンを使用してデバイスの画像をキャプチャします。
  5. ImageJ とカスタム・モバイル・アプリケーションを使用して、テスト領域と制御領域を分析します。
  6. ImageJ とモバイルアプリケーションからのデータに基づいて検量線を作成します。
  7. 以下の式(1-3)を使用して、ブランク限界(LOB)、検出限界(LOD)、および定量限界(LOQ)を計算します。
    LOB = ブランク データの平均 + 1:645* ð (ブランク データの標準偏差) (1)
    LOD = LOB +1:645*ð (最低濃度データの標準偏差) (2)
    LOQ = 空白データの平均 + 10*ð (空白データの標準偏差) (3)

6.臨床サンプルを用いた紙ベースのイムノアッセイの実施

  1. 入院初日に 30 人の患者から 300 μL の末梢血を採取し、適切な臨床慣行に従って紫色のトップ EDTA チューブに処理します。
  2. 血液を2,884 × g 、4°Cで20分間遠心分離します。
  3. ピペットを使用して、液体成分(プラズマ)を清潔なポリプロピレンチューブに移します。
  4. プラズマは、その後の分析のために、すぐに-20°Cの冷凍庫に保管してください。
  5. 20 μLの血漿をデバイス上部のサンプル領域に塗布します。次に、30 μLの洗浄バッファー(0.05% v/v Tween 20 in 1x phosphate buffered saline)を加えます。
  6. サンプルがデバイスに完全に吸い込まれるのを待ちますが、結果を得るには20〜30分かかる場合があります。
  7. デジタルカメラまたはスマートフォンを使用して、室温で5分間インキュベートした後、デバイスの画像を撮影します。
  8. ImageJ とカスタム・モバイル・アプリケーションを使用して、テスト領域と制御領域を分析します。

7. モバイルアプリケーションによる定量化

注:紙ベースのイムノアッセイの強度は、モバイルアプリケーションで分析されます(図2)。

  1. 開発したモバイルアプリケーションをスマートフォンで開きます。
  2. [ カメラを使用 ] または [ギャラリーからアップロード ] を選択して、データ ソースを選択またはアップロードします。これを行うには、カメラでキャプチャするか、デバイスのギャラリーから画像を選択します。
  3. 分析セクションに移動し、画面上の [分析 ] ボタンをタップします。
  4. アプリケーションがデータを分析し、結果を表示するのを待ちます。

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結果

製造方法の選択は、紙ベースのイムノアッセイデバイスで再現性のあるアッセイ性能を確保するために極めて重要です。私たちの研究では、紙ベースのイムノアッセイを実証する文脈で、さまざまな製造プロセスと材料を調査しました。私たちが選択した方法は、ワックス印刷システムを利用して、紙ベースのマイクロ流体デバイス内に疎水性バリアを作成します。このアプローチは、そのシンプルさ、スピード、一貫した結果により際立っています。注目すべきは、タンパク質の吸着を妨げ、セルロース紙の疎水性を高める可能性のあるフォトレジスト化学物質の使用を回避できるという利点があることです。さらに、ワックスプリンティングにより、流体チャネルの寸法が一定になり、再現性のあるアッセイ性能に貢献します。

疎水性バリアの形成に続いて、イムノアッセイに必要な試薬をセルロース紙の表面に塗布しました。PLLは、静電吸着により、アミン官能基の正電荷と負電荷を帯びた抗体の両方と相互作用することにより、生体分子の固定化を支援しました。このステップにより、抗体の修飾と固定化、および製造プロセス中の標識抗体複合体の適用が容易になります。重要なのは、この...

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ディスカッション

スマートフォンベースのリーダーシステムの重要な設計パラメータの1つは、サンプルの再現性のある画像処理を提供する能力です。この研究では、シンプルさと利便性のために、イメージングボックスやアクセサリを使用せずに、12〜13MPカメラを搭載した3つの異なるスマートフォンブランドから画像をキャプチャしました。カメラの解像度、画像撮影時間、照明条件、環境など、画像キャプチャのさまざまな条件は、デバイス上のテストおよびコントロールスポットの色の強度に影響を与える可能性があります。PADの照明と乾燥に対する異なる画像撮影時間の影響は、正規化された信号強度を使用することによって最小限に抑えられ、それはさまざまな時間に撮影された画像間で一貫していました36。背景信号減算は、色強度測定の精度を高め、照明条件の影響を効果的に軽減するための戦略として登場しました。私たちの発見は、環境への影響を最小限に抑える上でのベースラインまたはバックグラウンド減算技術の有効性を強調する以前の研究と一致しています39,40<...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

M.H.P.は、インドネシア・イスラム大学(UII)からの奨学金研究基金に感謝しています。著者らは、モバイルアプリケーションの開発と原稿への貢献を通じて、貴重な専門知識と支援をしてくれたNutchanon Ninyawee氏に感謝の意を表します。さらに、タイ科学研究イノベーション(TSRI)の2023年度基礎研究費(プロジェクト番号。FRB660073/0164)は、モンクット王工科大学トンブリ校のプログラムスマートヘルスケアの下で。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<強>材料
0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.2) 
0.1%のTween 20、10%のスクロース、および1%のカゼインを含むBBS  コンジュゲート領域処理およびブロッキングバッファー
ホウ酸緩衝生理食塩水 (BBS) (pH 8.2 で 25 mM ホウ酸ナトリウムと 150 mM 塩化ナトリウム) に 1% BSA を添加。
Bovine serum albumin fraction V (BSA)との結合プロセス中の洗浄バッファーAuNPs  PAA Lab GmbH(ドイツ)K41-001 
カゼインメルク9005-46-3
クロマトグラフィーペーパーグレード2 GEヘルスケア3002-911 
クリアラミネートフィルム3M (文房具店)
リン酸水素二ナトリウムメルク7558-79-4
ダブルテープサイド文房具店
ヤギ 抗マウス IgG 抗体 MyBiosource(米国)MBS435013
金ナノ粒子(40 nm)  Serve Science Co., Ltd. (タイ)
ヒトIgGポリクローナル抗体  メルクAG711-M
マウスデング熱NS1モノクローナル抗体 MyBiosource (USA)MBS834415
マウスデング熱NS1モノクローナル抗体 MyBiosource (USA)MBS834236
NS1 serotype 2 antigensMyBiosource (USA)MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as telution buffer
バッキングカード 10x30 cmPacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL)Sigma AldrichP4832
Potassium Chlorideメルク104936
一リン酸カリウムメルク104877
塩化ナトリウムメルク7647-14-5
四ホウ酸ナトリウム シグマ アルドリッチ1303-96-4
ショ糖メルク57-50-1
トゥイーン 20シグマ アルドリッチ9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 マルチモード リーダーBioTek
携帯電話Huawei Y7、iPhone 11、Samsung a20
フォトスキャナーエプソン パーフェクション V30
オーブンMemmert
ワックスプリンター Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection ドキュメントGoogle Cloud
ImageJNational Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 ソフトウェア
抗体Boric acid Merck 10043-35-3 プラスチック

参考文献

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