方法論記事

生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する

DOI：

10.3791/66156

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2023年12月22日

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1Department of Translational Neuroscience, College of Human Medicine, Michigan State University, 2Neuroscience Program, Michigan State University, 3Hauenstein Neuroscience Center, Mercy Health Saint Mary’s

この記事について

サマリー

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ここでは、初代海馬げっ歯類ニューロンのトランスフェクションと生細胞共焦点イメージングを組み合わせて、軸索輸送に対する病理学的タンパク質誘発性の影響を解析し、これらの影響を媒介する機構経路を特定する方法を示します。

要約

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軸索に沿った貨物の双方向輸送は、機能的なシナプス、神経接続、および健康なニューロンを維持するために重要です。軸索輸送は複数の神経変性疾患で中断され、投射ニューロンは、細胞材料を長距離輸送し、かなりの軸索質量を維持する必要があるため、特に脆弱です。タウ、アミロイドβ、α-シヌクレイン、スーパーオキシドジスムターゼ、ハンチンチンなど、いくつかの疾患関連タンパク質の病理学的修飾は輸送に悪影響を及ぼし、病理学的タンパク質が疾患において毒性を発揮する可能性のある共通のメカニズムを提供します。これらの毒性メカニズムを研究する方法は、神経変性疾患を理解し、潜在的な治療介入を特定するために必要です。

ここでは、培養した初代げっ歯類の海馬ニューロンを複数のプラスミドと同時トランスフェクトし、蛍光タグ付きカーゴタンパク質の生細胞共焦点イメージングを使用して、病理学的タンパク質が高速軸索輸送に及ぼす影響を研究します。私たちは、げっ歯類からの初代海馬ニューロンの採取、解離、および培養から始めます。次に、ニューロンにプラスミドDNAコンストラクトを共トランスフェクションして、蛍光タグ付きカーゴタンパク質と野生型または変異型のタウ(病理学的タンパク質の例として使用)を発現させます。軸索は、ニューロファシンの細胞外ドメインである軸索初期セグメントタンパク質に結合する抗体を使用して生細胞で同定され、関心のある軸索領域を画像化して蛍光カーゴ輸送を測定します。

無料で入手できるImageJマクロであるKymoAnalyzerを使用して、病理学的タンパク質の存在によって影響を受ける可能性のある軸索輸送の速度、一時停止頻度、および指向性貨物密度を広範囲に特徴付けます。この方法により、病理学的タウタンパク質の発現に関連するカーゴ一時停止頻度の増加の表現型を特定します。さらに、遺伝子サイレンシングshRNAコンストラクトをトランスフェクションミックスに添加して、輸送妨害の媒介における他のタンパク質の役割を試験することができます。このプロトコルは、他の神経変性疾患関連タンパク質との使用に容易に適応でき、これらのタンパク質が軸索輸送をどのように妨害するかのメカニズムを研究するための再現性のある方法です。

概要

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ニューロンは、機能的なシナプスと神経接続を維持するために、軸索に沿った貨物の双方向輸送に依存しています。軸索輸送障害は、アルツハイマー病(AD)やその他のタウオパチー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病など、いくつかの神経変性疾患の病因に重大な貢献をしていると考えられています1,2,3。実際、いくつかの疾患関連タンパク質の病理学的修飾は輸送に悪影響を及ぼします(4)でレビュー。神経変性疾患を理解し、治療介入の潜在的な標的を特定するためには、病理学的タンパク質が疾患において毒性を発揮するメカニズムを調査する方法を開発する必要があります。

従来のキネシンの発見、運動タンパク質を調節するキナーゼおよびホスファターゼ依存性経路、病理学的タンパク質が軸索輸送の調節を妨害するメカニズムなど、軸索輸送に関するいくつかの重要な洞察が、単離されたイカ軸索形質モデル4,5を用いてなされた。イカの軸索形質と病理学的形態のタウタンパク質との灌流は、前向性高速軸索輸送(FAT)を阻害し、この効果はタウのホスファターゼ活性化ドメインの曝露に依存し、タンパク質ホスファターゼ1(PP1)を活性化します6,7,8。PP1はグリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK3)を活性化し、GSK3はキネシン軽鎖をリン酸化してカーゴの放出を引き起こします。ADの別の病理学的タンパク質はアミロイドβです。オリゴマー型のアミロイドβは、カゼインキナーゼ2を介して双方向のFATを阻害し、カゼインキナーゼ2はキネシン軽鎖をリン酸化します9。さらに、ポリグルタミン増殖を有する病理学的ハンチンチンタンパク質と家族性ALS関連SOD1変異体は、それぞれc-Jun N末端キナーゼおよびp38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性を介してイカ軸索プラズム内の軸索輸送を妨害する10,11。

イカ軸索プラズムモデルは、病理学的タンパク質が軸索輸送に及ぼす影響を理解するための貴重なツールであり続けていますが、装置や標本へのアクセスが限られているため、より広く使用されることがありません。私たちは、げっ歯類(マウスおよびラット)の初代ニューロンの生細胞共焦点顕微鏡イメージングを使用して輸送アッセイを開発しました。このモデルは、広く利用可能な細胞源と顕微鏡システムを使用した、容易に適応可能で操作可能な哺乳類ニューロンベースのアプローチを表しています。例えば、さまざまな病理学的タンパク質(例えば、疾患関連修飾を有する)を発現させ、これらのタンパク質の特異的修飾が軸索の輸送にどのように影響するかを同定します。同様に、さまざまな蛍光標識カーゴタンパク質を使用して、カーゴ特異的な変化を調べることができます。さらに、これらの効果を媒介する可能性のある選択されたタンパク質の発現(すなわち、ノックダウンまたは過剰発現)を標的とすることにより、基礎となる分子メカニズムを比較的容易に研究できます。この方法は、さまざまな動物モデルに由来する初代ニューロンにも容易に適応できます。

私たちは、以前に初代海馬ニューロンで使用されていた生細胞軸索輸送アッセイを説明する詳細なプロトコルを提示し、変異タウタンパク質が前頭側頭葉性認知症(FTLD;P301LまたはR5Lタウ)は、蛍光標識されたカーゴタンパク質の一時停止頻度を双方向に増加させる12。さらに、PP1γアイソフォームのノックダウンは、一時停止効果12を救った。これは、上記のようにPP1によって開始されるシグナル伝達経路の異常な活性化を通じて媒介される病理学的タウ誘発性破壊のモデルを支持する6,7,12を提供する。別の研究では、S199/S202/T205(タウオパチーに関連する病原性AT8ホスホエピトープ)でのタウの偽リン酸化が、貨物の一時停止頻度と前向性セグメントの速度を増加させることを示しました。これらの影響は、タウ13のN末端ホスファターゼ活性化ドメインに依存していました。これらの例は、病理学的タンパク質が哺乳類ニューロンの軸索輸送をどのように妨害するかのメカニズムを特定するためのこのモデルの有用性を強調しています。

この論文では、初代マウス海馬ニューロンの採取、解離、培養から始まり、蛍光タンパク質と融合したカーゴタンパク質によるニューロンのトランスフェクション、そして最後に生細胞イメージングと画像解析のアプローチについて詳しく説明します。例として、この方法を使用して、小胞関連タンパク質であるシナプトフィジンの双方向輸送に対する修飾タウの影響を研究する方法を示します。ただし、目的の病原性タンパク質と輸送貨物タンパク質には柔軟性があるため、これは軸索輸送を研究するための汎用性の高いアプローチになります。

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プロトコル

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これらのプロトコルは、ミシガン州立大学の施設内動物管理および使用委員会によって承認されました。このプロトコルは、C57BL/6JバックグラウンドのTau Knockoutマウスおよび野生型Sprague Dawleyラットにうまく適用されています。他の株も同様に許容できるはずです。

1. 初代海馬ニューロンの採取

  1. 4ウェルガラス底チャンバースライドに、ろ過した0.5 mg/mLポリ-d-リジン(PDL)をホウ酸緩衝液(12.5 mMホウ酸ナトリウム十水和物および50 mMホウ酸)でコーティングします。750 μL/ウェルを添加し、室温で一晩インキュベートします。
  2. チャンバースライドを滅菌脱イオン水で4回洗浄します。最後の洗浄後は風乾し、4°Cで短期間保存(<1週間)してください。
    注:PDLは培養物に有毒であるため、洗浄前および洗浄の合間にスライド上で乾燥させないでください。PDLコーティングされたスライドの長期保存は、ニューロンの健康に影響を与える可能性があり、コーティングとプレーティングの間の間隔を一定に保つことで、培養生存率のラン間のばらつきが減少することがわかりました。
  3. 時限妊娠したマウスまたはラットを入手します。
    注:時限妊娠動物は、さまざまな会社から注文することも、社内で飼育することもできます。胚期ゼロ日とは、膣栓が見つかった日を指し、このアプローチにより、E16-18マウスの初代海馬および皮質ニューロンの培養に成功しています。ラットのニューロンも胚の18日目に採取されます。
  4. E18では、承認された方法で妊娠中の女性を安楽死させます。腹壁を切り取り、2つの子宮角を取り除きます。氷冷した0.9%生理食塩水を含むシャーレに移します。生理食塩水がきれいになるまですすいでください。
    注:腹腔内注射により、ペントバルビタールナトリウム(少なくとも100 mg / kg)の過剰投与を投与します。.
  5. 子犬の首を切る。大孔(頭蓋骨の後ろの開口部)から始めて、マイクロダイセクションハサミを使用して正中線に沿って皮膚と頭蓋骨を切断し、ハサミの下端を頭蓋骨の内部部分に角度を付けて脳組織への損傷を防ぎます。
  6. 上にある皮膚を取り除き、頭蓋骨を慎重に取り除いて脳を露出させます。
  7. 鉗子を使用して口/鼻の領域を保持し、頭蓋骨を回転させて、0.9%生理食塩水で満たされたペトリ皿の上で脳が下を向くようにします。頭蓋骨から脳をひっくり返し、神経と脳幹を切断して、脳を生理食塩水に放出します。
  8. 海馬を解剖するために、ペトリ皿を解剖顕微鏡の下に置きます。ハサミを脳の正中線に挿入し、上刃が大脳半球の1つを外側に押し出すようにハサミを傾け、半球を皮質下領域から分離するように切ります。
  9. 前頭皮質が切断部位の前方にあり、海馬が切断部位の後部になるように、皮質を垂直に切り込みます。はさみの下端を結果の穴に挿入し、後端で止まる皮質の頂点に沿って慎重に切ります。
  10. 鉗子を使って、皮質を慎重に振り抜き、後部カットを仕上げます。海馬は三日月形に似ている必要があります。残りの皮質を慎重にトリミングして、海馬が丸みを帯びた三日月形を維持するようにします。
  11. 鉗子とはさみを使用して、海馬から髄膜をそっと取り除きます。
    注:海馬組織の損傷や引き裂きを控えながら、収集される非ニューロン細胞の数を減らすために、脳からすべての髄膜を取り除くことが重要です。
  12. 海馬を4等分し、氷冷カルシウムおよびマグネシウムフリーバッファー(CMF;0.1% グルコース、2.5 μg/mL アムホテリシン B、および 50 μg/mL ゲンタマイシンを含むダルベッコ PBS)。
    注:最良の結果を得るには、解離ごとに5〜10匹の子犬から海馬を収集します。各海馬は、マウスには約300,000個、ラットには約500,000個の細胞を提供する必要があります。

2. 初代海馬ニューロンの解離とプレーティング

  1. パスツールピペットでCMFを取り出し、すすぎの合間に静かに渦を巻くように、新鮮な冷たいCMF 4xでティッシュをすすぎます。
  2. CMFを取り出し、ろ過した0.125%トリプシン溶液3 mLを加えます(予熱した[37°C] CMFで2.5%トリプシンを希釈します)。組織を37°Cで正確に15分間インキュベートします。5分ごとに静かに渦を巻きます。
    注:使用直前にトリプシン溶液を作ってください。
  3. 5 mLのトリプシン不活化溶液(TIS;ハンクス平衡塩溶液、20% 新生児用ウシ血清、1x DNase I 溶液 [10x ストック: 5 mM 酢酸ナトリウム、1 μM 塩化カルシウム、0.5 mg/mL DNase I])。
  4. トリプシン溶液を取り出し、冷たいCMFで2回洗います。冷たいTISを3mL加えます。
  5. 3 mLシリンジを使用し、直径の針を徐々に小さくするトリチュレーションにより細胞を解離します:14 G針を使用して30倍、15 G針を使用して30倍、16 G針を使用して20倍、18 G針を使用して20倍、21 G針を使用して15倍。最初の4本の針で2秒のドローを使用し、21Gの針で3秒のドローを使用します。
    注:他のトリチュレーション方法(例えば、ファイヤーポリッシュガラスピペット14,15)もまた使用され得る。標準化された金属製シリンジ針を使用すると、細胞凝集と生存率のばらつきが大幅に減少することがわかりました。
  6. 21 Gの針を使用して、細胞懸濁液の液滴を顕微鏡スライドに置き、細胞凝集体を確認します。いくつかの塊が観察された場合は、22Gの針でさらに3回回転させ、再チェックします。均質な単一細胞懸濁液が得られるまでこのプロセスを繰り返し、プロセス全体を通して穏やかに粉砕するように注意します。
  7. 0.22 μmシリンジフィルターを使用して、5 mLのウシ胎児血清(FBS)をろ過します。細胞懸濁液を15mLのコニカルチューブ内のFBSに穏やかに重ねます。細胞(200 × g 、4°C)を5分間遠心分離します。
  8. ペレットを乱さずに、できるだけ多くのFBSを取り除きます。1 mLの温かい(37°C)抗生物質を含まない神経基礎培地(NBM;1x グルタミン代替品および1x B-27を補充)に再懸濁します。
  9. 細胞懸濁液をトリパンブルー(0.4%)で希釈し、細胞数を求めます。
    注:1:1の希釈は自動セルカウンターに適しており、血球計算盤による手動カウントには1:60の希釈を使用します。細胞プレーティングを継続するには、この時点でニューロンの生存率が90%以上である必要があります。これにより、解離後に健康なニューロン培養が行われる可能性が大幅に高まります。
  10. 175,000細胞/ウェル(70,000細胞/mm2)の密度で、750 μLの抗生物質フリーNBMに加温したPDLコーティングされた4ウェルチャンバースライドに細胞を播種します。さらに、PDLコーティングされた24ウェルプレートの4つのウェルに200,000細胞/ウェルを1.5 mLの抗生物質フリーNBMでプレートし、セクション3で説明するトランスフェクションのコンディショニング培地として使用します。湿度制御された37°C、5%CO2 チャンバーで細胞をインキュベートします。
    注:セルの密度は、結果に基づいて調整できます。高密度はニューロンのイメージングをより困難にし、低密度は培養の健康とニューロンの生存に悪影響を与える可能性があります。私たちの経験では、ラットのニューロンはマウスのニューロンに比べて低密度でプレーティングすることができます。

3. ニューロントランスフェクション

注:ニューロンは、トランスフェクション効率や輸送結果に顕著な変化を伴わずに、DIV 7またはDIV 8にトランスフェクションできます。これらの容量は、750 μL の容量/ウェルの 4 ウェルガラス底チャンバースライドの 4 ウェル用です。このプロトコルでは、脂質トランスフェクション試薬を使用したトランスフェクションについて説明します。培地およびトランスフェクション試薬は、使用前に室温まで温めてください。

  1. トランスフェクションストック試薬を調製するには、127.6 μL の低血清培地に 4.4 μL のトランスフェクション試薬を添加します。手で穏やかに揺らして混合し、室温で30分間インキュベートします。
  2. 脂質トランスフェクションインキュベーション中にDNAストックを調製します。200 ng の蛍光カーゴ DNA(pFIN mApple-synaptophysin、12,112 塩基対)と 200 ng の DNA を発現させ、目的のタンパク質(使用したタウプラスミドは pCMV tau-Flag コンストラクト、5,036 塩基対)を低血清培地または無血清培地に添加し、最終容量 32 μL12 にします。トランスフェクションエンハンサー試薬0.8 μL(DNA1μgあたり2 μL)を添加します。手でよく混ぜます。
    注:RFPの派生物(mAppleまたはmCherry)が最適ですが、GFPも使用できます。さらに、遺伝子サイレンシングsmall ヘアピンRNA(shRNA)を発現するDNAコンストラクトを、目的のタンパク質の発現で観察される表現型のメカニズムの試験に含めることができます。これを行うには、DNA混合物に3つのDNAコンストラクトのそれぞれ150 ngを含め、それに応じてトランスフェクションエンハンサー試薬の量を調整します。DNAまたはリポフェクション試薬のパラメータを変更すると、トランスフェクション効率に影響を与える可能性があり、トランスフェクションの効率の増減に基づいて調整できます。
  3. DNAの各チューブに32 μLの脂質トランスフェクションミックスを加えます。手でやさしく揺らして混ぜます。室温で30分間インキュベートします。
  4. ピペットの先端を培地の表面のすぐ下に置き、ウェル全体を蛇行した動きで動かして、64 μLのDNA/トランスフェクション試薬ミックスを細胞にゆっくりと加えます。すべてのウェルに添加した後、チャンバースライドを手で3回静かに揺らしてさらに混合し、チャンバースライドをインキュベーターに入れます。37°Cおよび5%CO2 で2時間インキュベートします。
    注:ニューロンは温度やpHの変化に非常に敏感で、急速に発生する可能性があるため、ニューロンがインキュベーターの外にいる時間を最小限に抑えてください。
  5. コンディショニング培地+ニューロファシン抗体によるトランスフェクションの2時間後に半培地交換を行います。培地を交換する直前に、24ウェルプレートで培養した細胞から1.5 mLのコンディショニング抗生物質を含まないNBMをプールします。0.75 μLのNeurofascin 186 (NF-186) 抗体 (500 ng/mL) を馴染培地に加えます。
    注:NF-186抗体は、軸索初期セグメント(AIS)に富むニューロファシンの細胞外ドメインを検出し、イメージング用の軸索を明確に特定します。
  6. トランスフェクションの18時間後に、二次抗体を含む馴化培地で培地を完全に交換します。AlexaFluor 647に標識したヤギ抗ウサギ二次抗体1 μLを、24ウェルプレートからプールしたコンディショニングNBM(抗生物質フリー)3 mLに加えます。よく混ぜます。

4. ニューロンイメージング

  1. トランスフェクションの2日後にイメージングの準備をします。共焦点顕微鏡の生細胞チャンバーアタッチメントを37°C(60倍対物レンズとレンズオイルを含む)に温め、チャンバーを5% CO2に平衡化します。
  2. 高倍率対物レンズと生細胞チャンバーを使用して、細胞をイメージングします。
    注:レーザー走査型共焦点顕微鏡では60x 1.40 NA対物レンズを使用しますが、高いイメージングフレームレートを達成できる場合は、他の共焦点顕微鏡(スピニングディスクなど)または広視野蛍光顕微鏡システムも使用できます。
  3. 接眼レンズを使用して、カーゴタンパク質を含むチャネル内のトランスフェクションされたニューロンを視覚的に識別します。次に、ニューロンを画像化して、Cy5チャネルのAISを特定します(図1)。
  4. 視野を 32 ピクセル x 128 ピクセル の長方形のボックスに設定し、 AIS から遠位の軸索の領域を画像化するように移動します。貨物輸送の方向性とROIの向きに注意して記録します。ボックス上のドットは、後続の画像や動画の上部と右側にそれぞれ表示されます。画像のどちら側が細胞体に最も近く、どちらが軸索末端に最も近いかを記録して、ステップ5.1のキモグラフポリラインを正しい向きで描画できるようにします。
    注:関心領域を選択する場合、孤立した軸索の画像化された領域は比較的まっすぐで、各端で視野と交差する必要があります。セグメント全体が同じ焦点面内にある必要があります。エリアには、貨物の積極的な輸送が明確に表示されている必要があります。過度に明るいニューロンは、通常、カーゴタンパク質と目的のタンパク質を、ニューロンに毒性がある可能性が高く、避けるべきレベルで発現します。
  5. 561 レーザー出力を 1.40 に、ピンホールを 7.8 に、サイズ を 128 px2 に、速度 を 32 フレーム/秒に設定します。ゲインを調整して、バックグラウンド信号によって隠されることなく、個々の貨物小胞の輸送を視覚化します(通常、10〜50の場合、高品質のキモグラフが得られます)。
    注:非常に低いレーザー出力は、高感度のGaAsP検出器により達成可能であり、移動する貨物の潜在的な光毒性効果や光退色を防ぎます。ピンホールのサイズは、軸索がスライドの表面に完全に平らにならない可能性があるため、ROI全体が画像化されるように、焦点深度を増やすためにできるだけ広く設定されます。
  6. ROI のドロップダウン メニューから [Draw Rectangular ROI...] を選択して、ROI を設定します。視野全体をカバーするように ROI を描画します。ROIを右クリックし、[Use as Stimulation ROI: S1]を選択します。
  7. [ND Setup] タブに次の手順を含めて、ND セットアップを準備します。
    注:これは、一度設定され、ムービーが収集されるたびにソフトウェアによって実行される5ステップの収集プロトコルです。
    1. Acquire Image は、事前刺激の参照画像を収集します。
    2. 刺激;ROI:S1;インターバル: NoDelay;持続時間 1.64 秒、ループ数: 7. このステップは、レーザーのいくつかのパルスでバックグラウンド蛍光を漂白します。
    3. 画像を取得します。このステップでは、刺激後の参照画像を収集します。
    4. 待っています。 アクションなし、2分このステップでは、蛍光貨物が漂白されたROIを再入力するための回復期間を提供します。
    5. 取得;インターバル: NoDelay;所要時間5分、ループ:8,615。このステップでは、5分間のイメージング期間に最大速度で画像を収集します。
  8. ND Setupプロトコルを設定したら、ND SetupタブのApply Stimulation Settingsボタンをクリックします。貨物輸送のイメージを作成する準備ができたら、[今すぐ実行]をクリックします。これにより、ステップ 4.7 から ND Acquisition プロトコルが開始されます。
    注: フレーム レートは 32 フレーム/秒に設定されていますが、実際のフレーム レートは遅くなる可能性があります (~28.7 フレーム/秒)。この値は、セクション5で正確なキモグラフ分析のために記録する必要があります。理想的には、生細胞輸送イメージングは、貨物の動きをよりよく解読するために、可能な限り最速のフレームレート(>25フレーム/秒など)で行われます。
  9. 視野を画像全体にリセットします。次に、ROIボックスを含めた 561 チャンネルと 647 チャンネルのフルニューロンの画像を収集して保存します。目的のタンパク質の発現を後固定確認するために、画像が撮影されたXY座標を記録します。
  10. 解析のために、少なくとも 2 つのニューロンから輸送ビデオを収集します。各独立した複製が、個々の一次ニューロンの収集から測定された変数の平均から来ていることを確認してください(つまり、個々のニューロンではありません)。
    注:特定の一次ニューロンの収集について、条件ごとに2〜4個のニューロンからビデオを収集します。
  11. 培地を取り出し、予熱した4%パラホルムアルデヒドと室温で20分間インキュベートして細胞を固定します。バッファーを取り出し、TBSで細胞をそれぞれ3 x 5分間洗浄します。
    注:パラホルムアルデヒド固定には、細胞骨格構造を維持する一般的なバッファーである細胞骨格バッファーを使用します(10 mM 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸[MES]、138 mM KCl、3 mM MgCl2、および4 mM EGTA、pH 6.1)。他のバッファー(TBS、PBSなど)も固定に使用できます。
  12. 解析したニューロンが、免疫細胞蛍光染色により、目的のタンパク質と蛍光タグ付きカーゴタンパク質の両方を発現していることを確認します。ヒトタウ(Tau12)を染色して外因性タウの発現を確認し、β-IIIチューブリン(Tuj1)を染色して、イメージングプロセス全体を通じてニューロンが健康を維持していることを確認。
    注:これらの方法を使用して、トランスフェクトされたほぼすべての細胞で両方のDNAコンストラクトの共発現を観察します。

5. キモグラフの生成と解析

注:キモグラフは、さまざまなプログラムを使用して生成および分析できます。ここでは、無料で入手できるKymoAnalyzer (v. 1.01) ソフトウェアについて、6つのImageJ (v. 1.51n) プラグインを使用して簡単に説明します16.これらのプラグインは、EncaladaラボのWebサイト(https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer)の開発者からダウンロードできます。このソフトウェアの使用方法の詳細については、このサイトを参照してください。

  1. ステップ4.9で生成した動画を実験条件に基づいてグループ化し、再現します。 BatchKymographGeneration マクロ を実行し、適切なフォルダーを選択します。キモグラフポリラインを描画して、その特定の画像の近位端から始まる軸索をトレースします。得られたキモグラフは、選択したフォルダに保存されます(図2)。
  2. トラックを手動で割り当てるには、 トラック マクロを実行し、個々のムービー フォルダを選択し、[ はい ] を選択してトラックを追加し、クリックして各パーティクルの軌跡を追跡します。トラックの上部で最初のクリックを実行し、粒子の速度または方向が変わるポイントで再度クリックすると、ポリラインが粒子のトレースをキモグラフにオーバーレイします。ポリラインを線路全体に敷設したら、[ OK]をクリックします。すべてのトラックが割り当てられるまで繰り返します。
  3. 残りのマクロを実行し、イメージングパラメータに基づいて フレームレート と ピクセルサイズ を割り当てます。まず、 CargoPopulation、 NetCargoPopulation、 Segmentsの順に実行します。プロンプトが表示されたら、ムービーの ピクセルサイズ と フレームレート を入力します(これらの設定では、それぞれ0.22μm と 28.7フレーム/秒)。最後に、 poolData マクロ を実行して、選択したフォルダー内のすべてのキモグラフからトランスポート パラメーター データを計算してプールします。
  4. データファイルから結果をプロットし、個々のニューロン採取の実験条件内で解析されたすべてのニューロンの平均値で表される独立した反復数とさまざまな条件を比較します。

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結果

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これらの方法を使用して、野生型または疾患関連の形態のタウタンパク質の存在下での軸索輸送を特徴付け、疾患における病理学的タウ誘発性神経毒性の潜在的なメカニズムを調べました12,13。KymoAnalyzerソフトウェアは、特定のフォルダ内のすべてのキモグラフからさまざまなパラメータを計算し、プールします。輸送速度は、貨物が移動しているとき(セグメント速度)と、一時停止を含む全体的な速度(正味速度)のみが計算されます。貨物量は、総量、密度(#tracks/μm)、フラックス(#tracks μm-1・s-1)で算出します。ランレングスは、個別に計算されるか、または組み合わされて、一時停止間の平均移動距離を決定します。貨物の一時停止は、時間と頻度、および貨物が動いていない時間の割合(つまり、0.1 mm/s<移動)によって特徴付けられます。ほとんどの測定値は、順行方向と逆行方向、および合計(両方向の組み合わせ)で計算されます。さらに、方向の反転の頻度とタイミングが計算されます。...

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ディスカッション

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さまざまな神経変性疾患に関連する複数の病理学的タンパク質が、ニューロンの高速軸索輸送を妨害するという証拠が増えています。これは、これらの疾患に共通する神経毒性のメカニズムである可能性を表しています。これらのタンパク質が輸送を妨害するプロセスをよりよく理解するには、特定の問題に対処できるツールとモデルが必要です。ここで説明する方法は、げっ歯類の初代海馬ニューロンにおける貨物輸送に悪影響を及ぼす病理学的タンパク質が関与するメカニズムを調べることを可能にする。

初代ニューロンは、高速軸索輸送調節のすべての機能的側面を維持しながら、簡単に操作できるシステムを提供します。リポソームベースのニューロンのトランスフェクションは、特に効率的ではありませんが(通常、5〜15個のトランスフェクションされたニューロンを観察します)、他の方法に比べていくつかの利点があります。まず、効率が比較的低いため、ユーザーは単離されたニューロンの個々の細胞体から投影されるプロセスを視覚的に追跡できます。AISの生細胞マーカー(すなわち、ニューロファシ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

これらのプロトコルの側面の開発と最適化に尽力してくれたChelsea TiernanとKyle Christensenに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01 NS082730(N.M.K.)、R01 AG044372(N.M.K.)、R01 AG067762(N.M.K.)、およびF31 AG074521(R.L.M.)によって支援されました。NIH/National Institute on Aging, Michigan Alzheimer's Disease Research Center Grant 5P30AG053760 (N.M.K. and B.C.);保健問題担当国防次官補室は、査読付きアルツハイマー病研究プログラム賞W81XWH-20-1-0174(BC)を通じて。アルツハイマー病協会研究助成金20-682085(BC);セッキアファミリー財団(NMK)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.4% トリパンブルーGibco15250-061
1.7 mL 微量遠心チューブDOTRN1700-GMT
2.5% トリプシンGibco15090-046
3 mL シリンジ 21 G 針付きFisher14-826-84
10 mL プラスチックシリンジFisher14-823-2A
14 G 針Fisher14-817-203
15 G 針MedlineSWD200029Z
16 G 針Fisher14-817-104
18 G 針Fisher14-840-97
22 G 針Fisher14-840-90
32% パラホルムアルデヒドFisher50-980-495
AlexaFluor 647 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)InvitrogenA21244RRID:AB_2535813
アムホテリシン BGibco15290-026
アルーガ微小胚性カプセル鉗子、湾曲; 4" RobozRS-5163オートクレーブ
B-27 サプリメント (50x)、無血清GibcoA3582801
BioCoat 24 ウェル Poly D リジンプレート フィッシャー08-774-124
ホウ酸シグマB6768-1KG
塩化カルシウムシグマC7902
カストロビエホ 3 1/2インチ 長さ 8 x 0.15 mm 角度シャープハサミロボズRS-5658オートクレーブ
細胞計数装置自動または手動
生細胞チャンバーアタッチメント付き共焦点顕微鏡
共焦点イメージングソフト
D-(+)-グルコースSigmaG7528
DNase I (Worthington)FisherNC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineGibco14200-075
EGTAFisherO2783-100
Fatal-Plus SolutionVortechPharmaceuticals, LtdNDC 0298-9373-68ペントバルビタールナトリウム;他の承認された安楽死方法が使用できます 
ウシ胎児血清Invitrogen16000044
ゲンタマイシン試薬溶液Gibco15710-072
GlutaMAXGibco35050-061グルタミン代替品
ハンクスの平衡塩溶液Gibco24020-117
ImageJ version 1.51nImageJLife-Line version 2017 5月30日:https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (バージョン 1.01)Encalada ラボパッケージには、6 つのマクロすべてが含まれています: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
リポフェクタミン 3000Invitrogen100022050P3000 トランスフェクション エンハンサー試薬と併用
塩化マグネシウムフィッシャーAC223211000
MES 水和物シグマM8250
マイクロ解剖ハサミ 3.5インチ ストレートシャープ/シャープロボズRS-5910オートクレーブ
ニューロバサルプラス ミディアムギブコ A3582901
ニューロファシン (A12/18) マウス IgG2aUC デイビス/NIH ニューロマブ75-172RRID:AB_2282826; 250 ng/mL;マウスニューロンではなく、ラットニューロンで機能します
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgGCell Signaling15034RRID:AB_2773024; 500 ng/mL;マウスニューロンで働き、ラットニューロンでテストしていません
新生児ウシ血清Gibco16010-167
Opti-MEMGibco31985-062
P3000Invitrogen100022057
ペトリ皿、100 x 10 mm ガラスフィッシャー08-748B解剖用; オートクレーブ
ペトリ皿、100 x 20 mm ガラスフィッシャー08-748D子宮角を中に入れる。オートクレーブ
Poly-D-lysineSigmaP7886-100MG
ポリプロピレン円錐遠心分離管(15 mL)Fisher14-955-238
ポリプロピレン円錐遠心分離管(50 mL)Fisher14-955-238
塩化カリウムFisherP217-500
酢酸ナトリウムΣS5636
ホウ酸ナトリウム十水和物VWRMK745706
ストレートブレード操作はさみブラント/シャープフィッシャー13-810-2オートクレーブ
シリンジフィルター、0.22 & マイクロ;mVWR514-1263
親指ドレッシング鉗子、鋸歯状、4.5 "RobozRS-8100オートクレーブ
µ-スライド4ウェルガラスボトムIbidi80427

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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