方法論記事

透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法

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DOI：

10.3791/66164

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2024年7月12日

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1Nuclear Dynamics and Cancer Program, Fox Chase Cancer Center

この記事について

サマリー

透明ゼブラフィッシュ胚の卵黄への異種移植のプロトコルについて、シンプルで迅速な病期分類法によって最適化されています。注射後の解析には、生存率と、フローサイトメトリーによる異種移植細胞の疾患負荷の評価が含まれます。

要約

腫瘍の挙動に関するin vivo研究は、がん研究の定番です。しかし、マウスの使用には、コストと時間の面で大きな課題があります。ここでは、ゼブラフィッシュの幼生を移植モデルとして紹介しますが、これはマウスモデルに比べて取り扱いの容易さ、低コスト、実験期間の短縮など、多くの利点があります。さらに、幼虫期には適応免疫系がないため、免疫不全株を作製して使用する必要がなくなります。ゼブラフィッシュの胚における異種移植のための確立されたプロトコルが存在しますが、ここでは、より迅速な移植のための胚の病期分類、生存分析、および疾患負荷を評価するためのフローサイトメトリーの使用を含む改善された方法を紹介します。胚は、幼虫の卵黄への迅速な細胞注入と、注入された細胞ボーラスの一貫性を監視するための細胞マーキングを容易にするためにステージングされます。注射後、胚生存分析は注射後7日まで評価されます(dpi)。最後に、転写された細胞を蛍光タンパク質で標識し、フローサイトメトリーで解析することにより、疾患負荷も評価されます。フローサイトメトリーは、ゼブラフィッシュの胚から細胞懸濁液を調製する標準化された方法によって可能になり、ゼブラフィッシュ細胞の初代培養の確立にも使用できる可能性があります。要約すると、ここで説明する手順により、研究群あたりの動物数が多いin vivoでの腫瘍細胞の挙動をより迅速に、より費用対効果の高い方法で評価できます。

概要

in vivoでの遺伝子改変または薬物治療に応答した腫瘍の挙動の解析は、がん研究の重要な要素である1,2,3,4。このような研究は、ほとんどの場合、免疫不全マウス(Mus musculus)モデルの使用を伴います5。しかし、マウスでの異種移植研究は、限られた容量、長期にわたる期間、多額の費用、および内部腫瘍の進行を監視するための高度な画像装置の必要性など、多くの点で制限されています6,7。対照的に、ゼブラフィッシュモデル(Danio rerio)は、より大きな容量、より短い期間、より低い費用を可能にし、そしてその透明性により、疾患の進行を簡単に監視することができます8,9。

ゼブラフィッシュは、子宮外で発生し、繁殖力が高い、よく発達した脊椎動物モデルシステムであり、個々のメスは100個以上の胚を産生します10。また、ゼブラフィッシュの胚は透明であるため、レポーターなどの蛍光関連技術を用いて発生過程を容易に可視化することができます。最後に、重要な発生過程の保存は、移植された悪性細胞の挙動を含む多くの種類の研究にとって理想的なモデルとなる11,12。野生型のゼブラフィッシュの胚はメラノサイトを発達させ、生後2週間までに光学的に不透明になりますが、これはキャスパーの胚(roya9;MITFAW2)は、生涯を通じて透明なままです13。その光学特性により、キャスパーゼブラフィッシュは移植された腫瘍細胞14,15,16の理想的なレシピエントです。ゼブラフィッシュへの腫瘍細胞の異種移植は、過去20年間で重要性を増しています17,18,19,20,21。ゼブラフィッシュの胚は自然免疫を持っています。しかし、幼虫期には適応免疫がないため、機能的に免疫不全になり、移植された腫瘍異種移植片の効果的な宿主として機能することができます22。

ゼブラフィッシュの胚だけでなく、多くの異なる変数23,24,25,26,27を考慮した成体における腫瘍生着のためのプロトコルが開発されています。これらは、卵黄、ビテリン周囲腔、心臓、およびさまざまな発生段階におけるゼブラフィッシュの腫瘍沈着の多数の部位を調査してきました16,28。ゼブラフィッシュのゼノグラフトの水産養殖の周囲温度も重要で、ゼブラフィッシュの飼育は通常28°Cで行われ、哺乳類の細胞は37°Cで増殖します。 したがって、魚が許容しながら腫瘍の成長をサポートする妥協的な温度を採用する必要があり、34°Cは両方の目標を達成するように見えます29。異種移植後の腫瘍の挙動と進行の分析は、もう一つの主要な焦点領域であり、これには、生存分析30だけでなく、さまざまな画像診断法の使用が含まれます。ゼブラフィッシュモデルの主な利点の1つは、腫瘍の挙動に関するin vivo研究に計り知れない統計的検出力を提供するために、多数の研究動物を利用できることです。しかし、以前のアプローチでは、注射のための面倒な取り付け手順が必要なため、この可能性は大幅に制限されていました。

ここでは、透明な キャスパー ゼブラフィッシュ系統を使用して、高スループットと注入品質のモニタリングを可能にする、胚をステージングするためのシンプルで迅速な方法を開発することで、この制限に対処します。これは、受精後2日(dpf)に キャスパー ゼブラフィッシュ胚の卵黄嚢に異種移植片を注入することを伴う。異種移植後の胚の生存を腫瘍挙動解析の一環として観察します。さらに、異種移植後の疾患負荷の評価を、シングルセル懸濁液を作製し、フローサイトメトリーで解析する方法を示します(図1)。

プロトコル

ゼブラフィッシュの維持管理、給餌、および飼育は、記載されているように、28.5°Cの標準的な水産養殖条件下で行われました31。ゼブラフィッシュ関連の実験はすべてこの温度で行われました。しかし、異種移植後、動物実験期間中、動物実験時間は、施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認された手順に従って、動物を34°Cで培養しました。

1.飼育(注射の3日前)

  1. 繁殖の1週間前に魚のペアに乾燥飼料(追加の飼料、魚あたり5〜6粒)を提供して、動物の健康を最大化し、繁殖ペアによって生成される胚の数を増やします。
  2. 胚採取の前夜に、雄と雌の魚を分離する仕切りを備えた繁殖水槽に繁殖動物を設置し、各雄に2匹の雌のハーレム交配を使用します。
    注:1アームあたり100匹の動物からなる4アームの実験では、実験ごとに20の繁殖ペアを使用します。必要な繁殖ペアの数を決定するには、 キャスパー 育種ペアあたり50個の胚を見積もるのが適切です。別の選択肢は、より堅牢で色素沈着したゼブラフィッシュ株を採用し、色素沈着を防ぐために1-フェニル2-チオ尿素(PTU)で治療することである31。実際には、実験は、注入後1日(dpi)で必要な数の2倍を注入するのに十分な胚を持つようにスケーリングする必要があります。

2. 胚採取(注入の2日前)

  1. 翌朝、仕切りを外して魚を繁殖させます。
  2. 仕切りを取り外してから20分(分)後にタンク内の胚を視覚化します。
  3. ゼブラフィッシュブック31に記載されているように作られた胚水が入った90mmのペトリ皿にふるいを使用して胚を収集します。
    1. 胚水を作るには、1 Lの蒸留水に1.5 mLのストック塩を加え、メチレンブルーを0.1%最終水に加えます。40 gの海塩(材料表)を1 Lの蒸留水に溶かして、ストックソルト溶液を作ります。胚水のイオン組成は、K+ (0.68 mg/L)、Cl- (31.86 mg/L)、Na+ (17.77 mg/L)、SO4- (4.47 mg/L)、Mg2+ (2.14 mg/L)、Ca2+ (0.68 mg/L)です。
  4. ゼブラフィッシュをさらに1時間繁殖させ、得られた胚を収集します。
  5. 実験のために胚をプールします。
  6. 夕方には、異常な形態で認識できる未受精または死んだ胚をすべて取り除き、新鮮な胚水を提供します。

3. 胚のメンテナンスと注入用ツールの準備(注入の1日前)

  1. 翌朝、追加の死んだ胚を取り出し、新鮮な胚の水を提供します。
  2. 胚水で1.5%アガロースを加熱してアガロースプレートを調製し、加熱した混合物を90mmのペトリプレートに注ぎます。90mmのディッシュ1枚には、30〜35mLの混合物が必要です。
  3. ニードルプラーを使用して、ガラスキャピラリー(ホウケイ酸)から非フィラメント針を引き抜きます。針は(熱圧下で)引っ張られ、閉じた端が生成されます。鉗子でクリップして、最適なオリフィスを生成します。単位時間あたりに変位する流体の量を決定することにより、針オリフィスの適合性を評価します(以下のセクション6.3を参照)。
    注:ガラスキャピラリーは、中央フィラメントの有無にかかわらず購入できます。中央フィラメントを欠く毛細血管は、細胞注入に適しています。
  4. 粘土(子供モデリング粘土)を使用して作られた溝の蓋付きの90mmペトリプレートに針を置きます(図2A)。

4. CM-Dilによる白血病細胞の調製と標識(注射日)

  1. 移植する細胞を、その成長に最適な条件で維持します。ここで用いたマウス白血病細胞は、十分(M82;Rpl22+/+) または欠損 (M109;Rpl22-/-)は、腫瘍抑制因子として機能するリボソームタンパク質Rpl22用である32。
  2. 50mLのコニカルチューブに細胞をペレット化します。カウントし、室温(RT)で300 x g で5分間遠心分離します。上清を捨てます。
    注:必要な細胞の数は実験範囲と条件によって決まりますが、1 x 106 細胞が出発点として適しています。
  3. CM-Dil染色の実施
    注:CM-Dil染色により、注入ボーラスのモニタリングが可能になります。
    1. 50 μg の CM-Dil バイアルを 50 μL のジメチルスルホキシド (DMSO; 1 mg/mL または ~1 mM 最終) に再懸濁して、CM-Dil のストック溶液を調製します。
    2. ストック(4.8 μL の染色剤/mL)を、使用する細胞に必要な支持サプリメントを含む1%ウシ胎児血清(FBS)/ハンクス平衡塩溶液(HBSS)で希釈して、作業溶液を作製します。
  4. 細胞を1 x 106/100 μLで染色液に再懸濁します。
  5. 37°Cで10分間インキュベートします。
    注:染色条件は、使用する細胞(時間など)に対して最適化する必要があります。ここで使用した細胞は、最適な染色を達成するために、異なる温度で2つの異なる10分間のインキュベーションが必要でした。
  6. 1x HBSS10 mLで室温(RT)で洗浄します。
  7. ペレット細胞(300 x g で5分間RTで遠心分離)し、上清をデカントし、10 mLのHBSSで再懸濁し、2回目の洗浄で同じことを繰り返します。
  8. 染色した腫瘍細胞を1% FBS/PBSおよび必要な支持サプリメントに40,000細胞/μLで再懸濁し、注射まで細胞懸濁液を34°Cに維持します。
    注:この研究で使用した細胞株の維持には、支持的なサプリメントが必要でした(例:.、1%FBSおよびサイトカイン)。サプリメントと異種移植は、研究中の特定の細胞株に適合させる必要があるかもしれません。ここでは、卵黄の潜在的な毒性を避けるために、培地の代わりにPBSを選択しました。

5. デコレーション

  1. キャスパーゼブラフィッシュの胚を、光学顕微鏡で2倍の倍率でインスリン注射器を使用して、2dpfで手動でデコレーションします。一方の針で絨毛膜を突き刺し、もう一方の針を使用して絨毛膜を固定します。
    注:デコレーションにプロナーゼを使用することは、胚の健康を低下させることがあるため、推奨されません。2 dpfで胚を脱葉することは、より容易であり、胚が以前の時期(1 dpf)よりも脆弱でないため、好ましい。
  2. デコレーション中は、針で胚に触れないように注意してください。不注意で針に触れて胚の卵黄に触れたり損傷したりすると、死に至る可能性があります。
  3. 胚の水を交換して、剥ぎ取った絨毛膜を取り除きます。

6. マイクロインジェクターとニードルのセットアップ

  1. マイクロインジェクターとポンプの電源を入れ、細胞のマイクロインジェクションに適した条件を設定します。9-11 psiの注入圧力と0.5秒(s)の注入時間は、針をクリップしてオリフィスを設定するための良い出発点です。
  2. 腫瘍細胞株懸濁液(~5 μL)を1回のパスでマイクロニードルに慎重にロードし、針内の細胞の流れを乱す気泡の形成を避けます。
  3. 鉗子(デュモン番号5)で針の端を切断して、0.2〜0.3秒あたり10〜15ナノリットル(nL)の細胞懸濁液の排出をサポートするオリフィスを生成します。
    注:上記のnL体積の計算は、キャリブレーションキャピラリー(1 mm = 30 nL)を使用して行われます。簡単に言うと、時間を0.5秒に設定し、針の各クリップの後に、キャリブレーションキャピラリーにボリュームを注入して収集します。次に、採取した体積の長さを顕微鏡下のスケールを用いて測定し、0.5秒で30nLを注入すると針のクリッピングを停止します。次に、注入時間を0.2〜0.3秒に設定します(細胞の注入~10〜15nL)

7. 注射用胚調製

  1. 顕微鏡下で健康な胚を選択し、心臓浮腫や短いまたは湾曲した体幹などの発生異常のある胚を選別します。
  2. トリカインメタンスルホン酸(MS-222;0.16 g / Lの胚水)を使用して、90 mmのペトリプレートで1分間胚を麻酔します。
  3. ガラス製のパスツールピペットを使用して胚をピックアップします。1.5%アガロースプレート上の横位置に10〜15個の胚を配置します(図2B-D)。
  4. パスツールピペットを使用して余分な水分を取り除き、胚を生き続けるために必要な最小限の胚水を残します。

8.注入手順

  1. 光学顕微鏡でチェックして、針の先端に細胞が蓄積していることを確認します。
  2. 較正された針を使用して、胚の卵黄に0.2〜0.3秒(10〜15nLは400〜600個の細胞に相当)胚を注入します。
  3. すべての胚に対して注射を繰り返し、新鮮な胚水に集めます。
    注:細胞は針先に蓄積する傾向があるため、15〜20回の注射ごとに針先をわずかにクリップする必要があります。これには、再クリッピングのたびに圧力と時間をリセットして、同様のボリュームが注入されるようにする必要もあります。
  4. 転送された細胞の 2 つの異なるセットの挙動の比較が有効であることを確認するには、移植された細胞のボーラスを監視します。これを行うには、注入後1時間(hpi)にCM-Dil染色(RFPチャネル内)に基づいて胚を選別し、最適な染色(「良好なボーラス」)と劣った染色のもの(「劣ったボーラス」)を分離します。 図3、黄色の矢印)。
  5. 劣ったボーラスで胚を廃棄するか、それらを使用して、異なる細胞用量が疾患の進行に与える影響を評価します。
  6. 死んだ胚は、腫瘍の成長ではなく注射による外傷に関連しているため、その日の終わりまでに取り除いてください。細胞が注入部位から漏れた可能性が高いため、細胞を保持しない胚を解析から除外します。
  7. 注入した胚を実験期間中、プレートあたり~60個の胚を含む90mmの皿で34°Cに維持します。
    注:5dpf後、卵黄は成長中の胚によって消費されるため、実験期間中、胚にはゾウリムシの食物を提供する必要があります。適切な栄養を確保するために、ゾウリムシは毎日6 dpf(4 dpi)から9 dpf(7 dpi)の胚に与えられるべきです。パラメシアは、記載されているように、最適な栄養および温度条件下でフラスコで培養することにより増殖する(31)。

9. 生存時間解析

  1. 次の7 dpiの胚を監視し、胚の水を毎日交換します。水の交換は、研究に薬物治療が含まれる場合、便宜上、隔日に短縮される場合があります。
  2. 胚の健康状態を確認し、分析期間中の死亡をスコアリングします。
    注:この実験の実験期間は7日間でしたが、異種移植腫瘍の攻撃性に応じて、より短くなったり長くなったりする可能性があります。
  3. CM-Dil蛍光を使用して疾患負荷を評価し(図4A)、Kaplan Meier分析を使用して遺伝的変化または薬物治療が生存に及ぼす影響を判断し、グラフィカルに描写します(例:GraphPad Prism; 図4B)33.

10. フローサイトメトリー解析のための胚の単一細胞懸濁液

注:疾患負担は、異種移植後のフローサイトメトリー分析によって評価できます。ただし、そのためには、腫瘍細胞の消えないマーキングが必要です。レトロウイルスまたはレンチビアで送達された赤色蛍光タンパク質(RFP)またはmCherryは、ゼブラフィッシュ細胞の自家蛍光よりも良好なシグナルを提供し、緑色蛍光タンパク質からのシグナルを不明瞭にするため、効果的です。

  1. 選択したdpi段階で胚を分離します。ここには 5 dpi が表示されています (図 5)。
  2. 開始点として条件ごとに30〜40個の胚を収集しますが、移植した細胞のステージや攻撃性によって胚の数が異なる場合があります。上記のように胚に麻酔をかけます。
    注:ここに示すように、胚は、統計的有意性を提供するために反復として細分化される場合があります(図5B)。
  3. 胚を1.5mLの遠心チューブに移します。
  4. カルシウムが少ないと胚組織を柔らかくし、より効果的な組織解離が可能になるため、サンプルあたり100 μLのカルシウムフリーリンゲル液(レシピ31)を使用して卵黄を溶解します。
  5. 5分間断続的にピペットを上下させ、200μLのピペットチップを使用して卵黄を取り出します。
  6. 0.05%トリプシン/PBS(フェノールレッドインジケーターなし)を29°Cに予熱し、トリプシン溶液1mLあたり27μLのコラゲナーゼIV(100 mg/mL)を補充します。胚の各サンプルには、1mLの溶液の容量が必要になります。
  7. 1 mLのトリプシン/コラゲナーゼ溶液を脱ヨールク胚の各サンプルに加え、29°Cで30〜35分間インキュベートします。
  8. 1 mLのピペットチップを使用して、胚(背骨)の構造が見えなくなるまで、この溶液で胚を上下にピペットします。
  9. 200μLのFBSを使用して反応を停止します。
  10. よく混合し、29°Cでさらに5分間インキュベートして、トリプシンが完全に不活性化されるようにします。
    注:37°Cで発生するゼブラフィッシュ細胞の熱ショック誘発死を防ぐための組織解離プロトコルには、29°Cの温度が採用されています。ただし、ゼブラフィッシュ細胞の保存が必要ない場合は、37°Cで消化を行うことができます。
  11. 細胞懸濁液を300 x g で5分間、4°Cでペレット化し、上清を捨てます。
  12. 細胞ペレットを4°CのPBSに再懸濁し、上記のようにペレット化します。
  13. 洗浄を繰り返し、70 μmのセルストレーナーで細胞を濾します。
  14. ペレット状にして、フローサイトメトリー解析のための染色を進めます。
    注:初代ゼブラフィッシュ細胞の培養が必要な場合は、4°CのPBSでさらに2回洗浄し、L15培地(抗生物質と10%FBSを含む)に再懸濁します。

11. 蛍光活性化細胞ソーティング(FACS):異種移植細胞の染色とソーティング

  1. 細胞懸濁液を染色培地(HBSSと1% FBS)に再懸濁し、ペレットを300 x g で5分間放置します。
  2. 移植細胞と反応性のある抗体を用いて細胞ペレットを染色培地に再懸濁し、移植細胞とゼブラフィッシュ細胞を区別するための第2のマーカー(RFPまたはmCherryに加えて)を提供します。ここでは、サンプルあたり50 μLの抗マウスCD45(APC-CD45)を1:50の希釈で使用しました(図5)。
  3. 4°Cで20分間インキュベートした後、上記のように1 mLの染色培地で洗浄し、未結合の抗体を除去します。
  4. 上清を捨てた後、バイタル色素Helix NP Blue(1 μM)を含む染色培地200 μLに細胞ペレットを再懸濁すると、生死の識別が可能になります。
  5. 細胞ミックスを5 mLの丸底ポリカーボネートチューブに移し、フローサイトメトリー分析を行います。
    注:腫瘍細胞コントロールを並行して染色すると、フローサイトメトリー分析中にゲートを描画するための明確さが得られます。

12. フローサイトメトリー

  1. 低流量(500イベント/秒以下)で利用可能なフローサイトメーターの電源を入れて、パラメータを設定します。
  2. 腫瘍細胞制御(異種移植に使用したのと同じ細胞)を使用して、FSC(前方散乱)、SSC(側方散乱)、BV421/CasB(生存率)、CE-594(mCherry)、およびAPC(CD45.2)チャネルの電圧を設定します。
    注:単品染色されたサンプルは、異なる染色間の蛍光色素の重複を排除する補正設定を確立するために必要になります。
  3. 注入していない胚サンプルを使用して、移植細胞とゼブラフィッシュ細胞の両方に対応する設定を確立します。
  4. 流量を毎秒8000イベントに増やし、サンプルごとに100万イベントを記録します。
  5. 適切な解析ソフトウェアを使用して、まずFSC-H v/s FSC-A(高さ v/s 面積)をプロットしてシングレットを選択し、次に生存細胞を選択するためのプロットを行い、得られたデータを解析します。FlowJoソフトウェアは、このような分析に広く使用されています。
  6. 腫瘍細胞コントロールを使用して、FSC-A vs SSC-Aによって移植細胞の周囲にゲートを描き、次にインジケーター染色(この場合はCD45およびmCherry)を使用します(図5B)。
    注:腫瘍に対して選択されたサイズゲートには、ゼブラフィッシュ細胞も含まれ、疾患負荷の正常化と決定の基礎を提供します。
  7. 上記と同じゲート設定を使用して胚サンプルを解析します。腫瘍染色と蛍光タンパク質インジケーターの最終的なプロットは、疾患負担の尺度を提供します(図5C)。
    注:ここでは、注入された細胞の良好なボーラスを投与された胚と劣ったボーラスを投与された胚の疾患負担の差がプロットされました。
  8. 必要に応じて、胚の腫瘍細胞をフローサイトメトリーで選別し、下流の分子解析を行います。

結果

異種移植
図1には、胚産生から生存率による疾患進行の評価、フローサイトメトリーによる疾患負荷解析まで、実験と解析の全体像が示されています。このアプローチにより、異種移植の再現性とスケーラビリティを向上させるいくつかの改善がもたらされるだけでなく、疾患の負担を評価する新しい方法が追加されます。これらの実験の成功は、移植された細胞の健康に大きく依存しており、健康でなく、対数期にある細胞は移植時に増殖できません。インジェクションセッションの期間も重要なパラメータです。腫瘍細胞を調製した後、3〜4時間以内にゼブラフィッシュへの注射を完了することが重要です。この研究で使用されたアプローチでは、アガロースプレート上で直接胚を横向きにステージングし、卵黄に注入するという単純な変更により、この時間枠内により多くの胚を注入することができます(図2C、D)。さらに、十分な細胞(400〜600細胞)が注入され、オリフィスが胚が損傷するほど大きくならないように、最適な針オリフィスを選択することが不可欠です。もう一つの考慮事項は射出圧力です。12〜13 psiを超える圧力が胚の卵黄を破壊し、死を引き起こすことがわかりました。最後に、この手順に固有の別の変動性は、注射の一貫性です。注入する細胞は注射針の端に落ち着くため、注射ボーラスの正確な制御が困難になります。細胞を異種移植すると、すべての胚が同じ注入ボーラスを受ける可能性がありますが、実際にはそうではありません(図3)。移植される細胞の数は、腫瘍細胞の挙動(凝集など)とオペレーターのスキルレベルによって大きく異なります。私たちは、CM-Dil染色/mCherry標識を通じてこの不確実性に対処し、これにより、適切で一貫性のある細胞ボーラスを投与された動物と劣ったボーラスを投与された動物を注射後に分類することができます。CM-Dil染色は、蛍光タンパク質によるより効果的なマーキングですが、顕微鏡またはフローサイトメトリーによる疾患進行のモニタリングを容易にするという追加の利点があります(図4および図5)。

腫瘍挙動解析
腫瘍の進行は、RFPに焦点を当てた単純な蛍光顕微鏡を使用して簡単に監視できます(図4A)。同様に、従来の生存モニタリングは、Kaplan-Meier分析(Log-rankおよびWilcoxon検定)によって実行できます(図4B)。印象的なことに、マウスベースの異種移植研究では、通常、研究群あたり8〜10匹の動物がいますが、ここで説明したゼブラフィッシュ法を使用すると、それぞれ60匹を超える研究群を達成することは難しくありません(図4B)。これにより、 in vivo 研究の分解能が著しく向上します。最後に、フローサイトメトリーを使用した疾患負荷解析のための別のアプローチを実装しました。これには、同数の胚を破壊し、得られた単一細胞懸濁液の腫瘍細胞含有量をフローサイトメトリーによって分析することが含まれます。腫瘍特異的な細胞表面マーカーと蛍光タンパク質インジケーターを組み合わせることで、異種移植されたマウス/ヒト細胞を、疾患負荷を評価するアプローチとしてフローサイトメトリーで自信を持って同定できます(図5)。この目的のためには、緑色蛍光タンパク質は宿主ゼブラフィッシュ細胞の自家蛍光よりもシグナルを提供できなかったため、赤色蛍光タンパク質が優れています。ここでは、mCherryは、CD45とともにFACS分析のための異種移植の過程を通じて、細胞の標識とモニタリングに使用されました。二重標識により、良好なボーラス接種と劣ったボーラス接種との間の腫瘍負荷の違いを測定することができました(図5B、C)。

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図1:異種移植および注射後の分析手順全体の概略図(A)繁殖セットアップ、胚収集、および受精後2日(dpf)の形態が図式化されています。(B)ゼブラフィッシュ胚の卵黄における異種移植のための白血病細胞の調製、染色、および注射。(C)生存およびフローサイトメトリーを含む異種移植後の分析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:注射に使用した器具の代表的な画像 (A)ペトリプレートで針を引っ張った状態。(B)胚の病期分類用のアガロースプレート。(C,D)胚ローディングプレートに注入するための胚のステージアップを示すプレート(パネルCの代表図とパネルDの実際の胚(赤丸部分))。パネルDの右下隅にある挿入図は、ステージングされた胚の高倍率のビューを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:異種移植された胚の代表的な画像。 1 dpiでの casper 胚の卵黄中のCM-Dil染色(赤)陽性細胞の明視野および免疫蛍光画像を示しています(クラッチ画像)。下ボーラスの胚は黄色の矢印で示され、形態が乱れた胚はアスタリスクで示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:蛍光イメージングと生存解析による疾患進行の評価。 (A)4dpiおよび7dpiでの異種移植胚の代表画像。(B)遺伝的に異なる2つの白血病系統を持つ胚の生存分析を示すKaplan Meierプロット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:異種移植ゼブラフィッシュにおける疾患負荷のフローサイトメトリー解析(A)細胞懸濁液およびフローサイトメトリー解析の調製の概略図。簡単に説明すると、4 dpiの胚は、トリプシンとコラゲナーゼを使用してシングルセル懸濁液に分解され、続いてフローサイトメトリーが行われます。(B)フローサイトメトリー解析の代表的なプロットで、各パネルの左の画像がFSC-A v/s SSC-Aプロット、右の画像がCD45 v/s mCherryシグナルです。(C)CD45 v/s mCherryプロットから得られた異種移植細胞の細胞統計を示す棒グラフ(各反復(n = 3)ごとにn=45、40、および40;p値*≤0.05、GraphPad Prism 9のウェルチ補正による対応なしt検定を使用して計算)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ゼブラフィッシュの異種移植は、マウス研究に代わる迅速で堅牢で費用対効果の高い方法として浮上しています12。ゼブラフィッシュの異種移植にはいくつかのアプローチが報告されていますが、私たちの適応は大幅な改善をもたらしました。これらの改善は、手技に関するパラメータを標準化することに加えて、腫瘍注射の実施速度を加速することに特に焦点を当てているため、研究群あたりの動物数の増加が可能になり、腫瘍標識を使用して注射の質と注射後の行動をモニタリングすることができます。

ここで説明するこの方法の改善は大きな可能性を秘めていますが、この戦略を成功裏に実行するには、熟練した実務家と特定のアプリケーションの最適化が必要です。白血病細胞を用いた。その結果、固形がんの使用はさらなる課題をもたらす可能性があります。このような腫瘍は凝集しやすい場合があり、これにより細胞ボーラスの送達にばらつきが生じる可能性があります。ただし、そのような状況でも、RFPラベリングにより、ボーラスの適切な注射後品質管理が可能になるはずです。これは、自家蛍光によって不明瞭になるGFP標識や緑色染料よりも優れています。最後に、成功に影響を与えるほとんどのパラメータ(胚の健康、水産養殖温度、針の開口部、注入圧力など)をここで標準化することで、このプロセスの変動性を最小限に抑えることができます。

ゼブラフィッシュの異種移植実験で考慮すべき主要な事項は、注射部位です。ここでは、卵黄への注射が、ペリビテリン腔34、キュビエ管35、および心内注射(心室)36のような他のより技術的に困難な部位と比較して非常に容易であることを示した。卵黄注射の欠点は、成長中の胚にとって重要な器官であるため、注射の外傷によって胚が死なないように、針の直径と圧力が慎重に制御されるように注意する必要があることです。ここで説明するアプローチは、怪我を最小限に抑え、明らかな怪我や死亡を1 dpiで破棄することで、これらの問題は腫瘍の成長に関連しないため、この懸念を軽減します。注射部位に関する最終的な考慮事項は、異なる微小環境が異種移植腫瘍の増殖をサポートする能力が多かれ少なかれある可能性があるということです。したがって、おそらく、より困難な同所性注射に進む前に、まず卵黄注射を行うことができるでしょう。卵黄注射の主な利点は、正確な胚の病期分類を必要としないため、より多くの胚をより迅速に注入できるため、胚の健康をよりよく維持し、移植された腫瘍細胞の挙動の違いを解決するための統計的検出力が向上することです。

注射後の疾患進行のモニタリングは、通常、Kaplan-Meier分析37を使用して生存への影響を通じて評価されます。しかし、疾病負荷検査も非常に有益です。注射部位に残存する移植細胞については、腫瘍細胞の標識方法が自家蛍光29によって不明瞭にならない場合、腫瘍負荷は種々の顕微鏡法を用いて定量化することができる。CM-Dil染色は容易に分解され、自家蛍光の影響を受けないため、限局細胞の腫瘍負荷を定量化するのに適しています。この課題は、腫瘍細胞が注射部位に残らず、播種しない場合に発生します。このような場合、フローサイトメトリーは、赤色蛍光タンパク質を用いた消えない遺伝子マーキングと相まって、ゼブラフィッシュ細胞とは異なる種特異的な染色物を用いて標識腫瘍を解析できるため、標準化された胚の疾患負荷をモニタリングする非常に効果的な方法です。CM-Dilの欠点の一つは、細胞分裂によって希釈されることである38。したがって、RFPまたはmCherryを使用した腫瘍の遺伝的マーキングを使用した適応には、大きな利点があります。mCherryの発現は、腫瘍特異的抗体と組み合わせることで、宿主のゼブラフィッシュ細胞が提供する複雑なバックグラウンドシグナルのパターンの中で、移植された細胞を確実に同定することができます。

これらを総合すると、本研究で用いた最適化されたゼブラフィッシュ異種移植アプローチと解析法は、すでに強力な実験プラットフォームに大幅な改善をもたらします。

開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

この作業は、NIHの助成金R37AI110985とP30CA006927、ペンシルベニア州、白血病リンパ腫協会、およびビショップ基金からの予算によって支援されました。この研究は、Fox Chaseの中核施設であるCell Culture、Flow Cytometry、Laboratory Animal施設からも支援を受けました。FCCCのゼブラフィッシュとマイクロインジェクション施設を維持してくださったJennifer Rhodes博士に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1-フェニル 2-チオ尿素 (PTU)SigmaP7629
70ミクロンセルストレーナーコーニング CLS431751-50EA
90 mm シャーレサーモフィッシャーサイエンティフィックS43565
アガロースApex バイオリサーチ20-102GP
APC APC 抗マウス CD45.2 抗体バイオレジェンド109814
BD FACSymphony A5 Cell AnalyzerBD BiosciencesBD FACSymphony A5
キャリブレーション キャピラリーシグマ P1424-1PAK
セルトラッカー CM-dil 色素InvitrogenC7001
Collageanse IVGibco17104019
Dumont 鉗子番号 55ファインサイエンスツール11255-20
FBSコーニング 35-015-CV
蛍光顕微鏡ニコンモデルSMZ1500
ガラス毛細血管(ホウケイ酸)世界の精密機器1B100-4
HBSSコーニング 21-023-CV
ヘリックス NPブルー バイオレジェンド425305
インスタントオーシャン シーソルトインスタントオーシャンSS15-10
光学顕微鏡ニコンモデルSMZ1000
メチレンブルーシグマM9140-100G
マイクロローダー (細胞を敷設するための長い先端)エッペンドルフ930001007
P1000マイクロピペットプーラーSutter instrumentsmodel P-97
PM 1000 cell microinjectorMicroData Instruments, Inc. (MDI)PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)SigmaE10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol redGibco15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)ゼイグラー388763

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