In vitro組織灌流システムを使用して、単離された腸管の機能活性をリアルタイムで検出する

Summary

ラットの腸管を分離し、 in vitroでラットの張力、頻度、振幅に対する薬物の影響を評価する方法を紹介します。この方法は、腸管を調査する研究者にとって貴重なアプローチを提供します。

Abstract

罹患率の高い胃腸疾患は、人間にとって大きな課題となっています。小腸は、食品や薬物の消化吸収に不可欠であり、これらの疾患の治療に重要な役割を果たしています。腸管運動実験は、一般的で不可欠な in vitro 法であり、胃腸のダイナミクスを研究するために利用されています。これには、単離された腸管の調製、ならびに調製された腸管の浴中の懸濁液および信号検出器へのその接続が含まれる。これに続いて、腸の運動機能を評価するために使用できる張力などの一連のパラメーターの記録と分析、 およびin vitroで腸管を活動的に保つための考慮事項が続きます。サンプリングからデータ収集までの標準化されたプログラムにより、実験データの再現性が大幅に向上し、生理学的、病理学的、薬物的介入後の腸の緊張の記録の信頼性が確保されます。ここでは、実験操作における主要な問題と、胃腸の運動性を調節する薬物を研究するための貴重な参照実験プロトコルを紹介します。

Introduction

一般的な状態である胃腸疾患は、人間の生活と健康に深刻な影響を及ぼします¹.胃腸運動障害は、機能性胃腸疾患の重要な部分であり、主に衰弱症状、胃内容排出の遅延、および重度の胃の問題に現れます²。胃腸の協調を乱し、胃内容排出を妨げ、腸の食物不耐症に影響を与え、さらには小腸または大腸の機能閉塞を引き起こす可能性があります³。胃腸手術を受けている患者にとって、この障害は腸の失敗に直接つながる可能性があります。また、腸の病気は胃腸疾患だけでなく、肝炎や中枢神経系疾患など、さまざまな疾患の病原性因子にも関連しています。腸内微生物群集は、運動性を含む腸の生理機能において重要な調節的役割を果たしており、その後、微生物生態系内のコロニー形成に影響を与えます⁴。B型肝炎ウイルスの感染が慢性B型肝炎に進行するにつれて、腸内細菌叢にはさまざまな程度の変化があります。腸内細菌叢の調節は、B型肝炎ウイルスの治療に有益であることが実証されています⁵。さらに、中枢神経系は腸に影響を与え、その微生物組成を変化させる可能性があります。近年のミクロフローラシーケンシング技術の進歩により、腸内細菌叢と中枢神経系機能との間の双方向の相互作用が明らかになり、中枢神経系疾患の発生と進行と密接に関連している^ことが明らかになった^6,7。

高齢化の進展に伴い、腸管神経系の神経機能の低下や喪失、腸の内因性神経支配と関連して、消化器運動障害の発生率が^{増加しています8。}消化器疾患に対する理解が深まるにつれ、数多くの斬新なアイデアやアプローチが生まれ、新たな医薬品開発につながる可能性があります。しかし、これらのアイデアの多くはまだ仮説的なものであり、臨床試験の肯定的な結果が具体化されるのを待っている^9,10。胃腸疾患の克服には、効果的な研究方法が不可欠です。近年、消化器系薬剤や運動制御に関する研究が盛んに行われています。胃腸薬と胃腸動態は不可分であり、他の多くの全身薬は胃腸動態にさまざまな影響を及ぼします。例えば、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)は、痛みや炎症、胃腸の動きの鈍化に使用され、消化性潰瘍のリスクを高めます¹¹。一方、一部の抗うつ薬は胃腸の運動性に影響を与える可能性があります¹²。現在、胃腸運動性に対する胃腸薬や他の全身薬の効果を研究する主要なin vitro薬理学的実験は、in vitro腸運動アッセイ¹³である。生理学的条件をシミュレートすることで、薬物が腸の平滑筋の収縮と弛緩に直接影響を与える様子を観察し、その胃腸への影響を評価している。しかし、胃腸運動障害の正確な原因は不明のままであり、遺伝的、環境的、食事的、および神経内分泌因子の複雑な相互作用である可能性が高い。その結果、胃腸運動障害の治療は依然として大きな課題となっています。

小腸は、消化、吸収、および薬物代謝の重要な部位であり、胃腸機能において重要な意味を持っています。そのため、単離腸管運動試験は、胃腸疾患の研究に欠かせないツールとなっています。これには、動物の分離された腸管を準備して浴に入れ、エネルギー交換器に接続し、トランスデューサーを使用して機械的な動きを電気信号に変換して増幅し、生理学的レコーダーで記録することが含まれます。周波数、振動の平均振幅、張力、曲線下面積などのさまざまなパラメータを測定して、腸管の運動機能を評価できます。この方法には、シンプルさ、経済性、実験条件の容易な制御、最小限の影響要因、高い再現性、正確で信頼性の高い結果などの利点があります。また、薬物の作用機序の解明にも特に有用です。しかし、単離された腸管実験の運用には、腸活を長期間維持することが難しいなど、顕著な課題があります。これらの問題に対処し、 in vitro 実験の経験から引き出すために、この論文では、実験操作における主要な問題について詳細に紹介し、胃腸の運動性を調節する薬物を研究するための貴重な参照実験プロトコルを提示します。

Protocol

このプロトコルは、以前に発表された文献14,15,16,17から導き出されます。本研究では、雄のSprague Dawley(SD)ラット(260-300 g、8-10週齢)を使用しました。動物実験のプロトコルは、成都中医薬大学の管理委員会によって審査され、承認されました（記録第2023017号)。実験に先立ち、ラットは24時間絶食するように指示されました。実験中、ラットは動物の部屋で飼われ、餌と水に自由にアクセスできました。

1. 溶液の調製

1. 118 mM NaCl、4.7 mM KCl、2.5 mM CaCl₂、1.2 mM KH₂PO₄、1.2 mM MgCl₂・6H₂O、25 mM NaHCO₃、11 mM D-グルコース、および5 mM HEPESを含む生理学的塩溶液(PSS)を調製します( 材料表を参照)。
2. 溶液を飽和させ、95%_O2 と5%CO₂の混合ガスで泡立ちます。その間、溶液のpH値を2 mM NaOHで7.38〜7.42に維持します。
3. PSSの1/3を4°Cに予冷し、残りの部分を37°Cに予温して、その後の実験に備えます。
   注:PSSはもともと、ステップ1.1〜1.2で室温で調製されました

2.ラット腸管解離術

1. 4°C PSSを充填したシャーレ、外科用ピンセット、ハサミを集めます。2%イソフルランを投与して、ラットを約5分間吸入して麻酔します。.ラットが深く麻酔されていることを、つま先のつま先つまみテストを実施して確認します。必要に応じて、追加の麻酔薬を投与します。次に、手術台の腹腔を開いて腸管を露出させます。
2. 95_%O2 および5%_CO2 を飽和させた4°CのPSS(pH 7.40)で満たされたペトリ皿に胃と腸のチューブをすばやく入れます。小腸の始まりである十二指腸を胃の幽門に位置づけます。ピンセットを使用して、隣接する組織を繊細に持ち上げ、はさみで腸の端から慎重に切り取ります。その後、腸を1〜2 cmのセグメントに分割します。このプロセス全体を 図 1 に示します。

3. 腸管の懸濁と固定(図2)

1. in vitro組織灌流システムをオンにし、装置内の浴温度を37°Cに調整します。 PSS(37°C)をバスに入れます。
2. 15cmの外科用縫合糸( 材料表を参照)を準備し、95%O₂ + 5%CO₂で飽和させた4°C PSSに浸します。縫合糸を使用して、腸管の一方の端を固定し、もう一方の端をスチール製のニードルフックを使用して固定します。
3. 腸管を取り付けます。バスの底にスチール製のニードルフックでセグメントを取り付け、手術ラインのもう一方の端をトランスデューサーに取り付けます。ガススイッチをONにして、お風呂に気泡が出るようにします。
4. データ集録ソフトウェア( 材料の表を参照)を開き、[開始]をクリックして、対応するパス信号が記録されていることを確認します。

4. ノーマライゼーション

1. バスのらせん軸を反時計回りに回転させて、腸管を自然な状態にリラックスさせます。 Setup-Zero All Inputs をクリックして、ソフトウェアで腸管の初期張力が 0g に設定されていることを確認します。
2. バスの螺旋軸を反時計回りに回転させて張力値を 1 g に引き下げ、pH = 7.40、95%O₂ + 5%CO₂ 飽和37°C PSSで30分間安定させます。
   注:腸管の正常化は、その予圧を最適な状態に調整することです。キャビティサンプルの場合、in vitroで優れた活性を維持するためには、最適なプリロードが必要でした。ラット腸管の最適予圧は^1g18であった。

5. 反応性の検出

1. ソフトウェアでリズミカルな自発収縮波を観察し、十分な反応を示すため、次の実験に進みます。

6. 実験的観察

1. 試験薬(アセチルコリンなど)をお風呂に加えて、腸管機能に対する薬の効果を研究します。
   注:薬物の効果は、腸の狭窄曲線の投与前と投与後の変化を比較することによって評価されました。.薬剤を添加する場合は、薬剤を混合するために気泡を増やし、混合後に気泡を正常に戻すのが適切です。

7. データ分析

注: in vitro 組織灌流システムには、4つの腸管に対する4つの同一または異なる薬物の影響について同時に試験を実施できる4つのチャネルがあります。実験パラメータと解析方法はすべてのチャンネルで同じであるため、データ解析の例として1つのチャンネルを選択します。

1. データ集録ソフトウェアを停止し、このデータ集録ソフトウェアでデータ解析を実行します。データボードを編集し、次のように解析パラメータを選択します:Window-Data Padをクリックし、チャネルの平均張力を選択します。
2. 管理前に収縮曲線を選択し、[ データ パッドに追加] をクリックします。管理後に収縮曲線を選択し、[ データ パッドに追加] をクリックします。投与前後の平均張力値が順番にデータパッドに表示されます。
3. Window-Data Padをクリックして、統計分析のためにデータを他の統計分析ソフトウェア(資料表を参照)にコピーします。
4. 平均振幅、平均周波数、積分(曲線下面積)などの他のパラメータを分析し、平均張力をそれぞれのパラメータに置き換えるだけで、操作は手順6.1〜6.3と同じです。
5. 収縮曲線の保存:収縮曲線を選択し、[ 編集]-[Labchartデータのコピー ]をクリックして、データを描画ソフトウェア( 資料の表を参照)にコピーし、収縮曲線を描画します。

8. 術後治療

1. 手術後、施設で承認されたプロトコルに従って動物を安楽死させます。
   注:本研究では、動物は過剰なイソフルランを吸入することによって安楽死させられました。

Results

研究の最初の部分は、分離された腸管を体から分離し、 それらをin vitroで2cmの管に変換するプロセスに焦点を当てています。このプロセスを 図 1 に詳しく説明します。2番目の部分には、単離された腸管リングの懸濁と標準化が含まれます。このプロセスの成功は、通常のチューブの自動的なリズミカルな収縮を示す 図2で示されています。最後に、この研究では、代表的な収縮剤と弛緩剤が単離された腸管リングに及ぼす影響を調べます。 図3に示すように、アセチルコリン(0.3 μmol/L)と塩化バリウム(1.2 mmol/L)がこれらのチューブの張力を増強し、アトロピン(300 μmol/L)、エピネフリン(1 μmol/L)、ニフェジピン(10 μmol/L)がこれらのチューブの張力を阻害することがわかりました。

この方法は、主に単離された腸管の運動機能の決定を導入します。腸の動きは多くの要因の影響を受け、その影響のほとんどは腸内の受容体を通じて発揮されます。消化管には、コリン作動性M受容体、アドレナリン作動性α・β受容体、5-HT受容体、ヒスタミン受容体、消化管ホルモン受容体など、様々な受容体が存在する¹⁹。単離された腸のけいれんは、M受容体に対するアセチルコリンの作用によって引き起こされる可能性があります。この効果は、M受容体の遮断薬として作用するアトロピンによってブロックできます(図3A)。しかし、塩化バリウムへのバリウムイオンの侵入とカルモジュリンとの結合によって引き起こされる腸セグメントの平滑筋のけいれんは、アトロピンによってブロックすることはできません(図3B)。エピネフリンは、α受容体とβ受容体の両方のアゴニストとして機能します(図3C)。小腸のα受容体とβ₂ 受容体を興奮させ、平滑筋の弛緩と小腸の収縮を弱めます。その結果、蠕動運動が遅くなり、吸収率が低下します。対照的に、ニフェジピンは^Ca2+ の内部の流れを防ぎ、腸の弛緩を促進します(図3D)。これは、腸のけいれんを和らげ、腸の圧力を下げ、腸内の水分の吸収を促進するのに役立ちます。

図1:腸管の単離(A)ラットの腸管;(B)腸管を体から取り出し、4°Cの生理学的塩溶液を含むシャーレに入れました。(c)周囲の組織を除去した後の腸管。(D)実験で使用した長さ2cmの腸管。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:単離された腸管リングの懸濁と標準化のプロセス(A)In vitro組織灌流システム(材料の表を参照)。(b)腸管の両端を鉄製のフックと外科用ラインで4°Cの生理学的塩溶液を含むシャーレに固定し、(c)腸管を37°Cの生理食塩溶液を含有する浴槽の1つに固定し、(D)予圧を与え、通常の波形を記録します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:単離された腸管に対する薬物の影響。 (A)アセチルコリン(0.3 μmol/L)およびアトロピン(300 μmol/L)、(B)塩化バリウム(1.2 mmol/L)、(C)エピネフリン(1 μmol/L)、および(D)ニフェジピン(10 μmol/L)の単離された腸管への影響。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

胃腸の運動性は、正確に調整された一連の平滑筋の収縮と弛緩によって達成されます。このプロセスには、筋肉群の1つのグループのリズミカルな収縮、複数のグループの協調的な収縮、および特別な推進収縮が含まれます^20,21。胃腸運動障害の発生は、中枢神経系、自律神経系、腸管神経系、胃腸平滑筋など、さまざまなレベルでの機能障害に関連している可能性があります。これらの組織構造は、さまざまな神経伝達物質と体液性因子の放出を通じて一緒に機能し、それらは対応する受容体に結合してさまざまな生理学的機能を実行します²²。そのため、薬物の作用の局所的なメカニズムを研究することは不可欠であり、in vitro小腸実験を行うことで、異物からの干渉や中枢神経系の制御を排除することで、より正確な洞察を得ることができます。

モルモット回腸、ウサギ空腸、十二指腸の単離された腸管標本は、実験動物で一般的に使用されています。また、ラットやネコの回腸、十二指腸、空腸も in vitro 実験に利用することができます。この方法は、単離された組織に適しています。腸管平滑筋は、自動的にリズミカルに収縮する特徴があり、腸壁の神経叢の影響を受けます。多くの動物の単離された腸管は、適切な生存環境で自発的な運動機能を維持することができます。体外腸管実験には、操作が簡単で、実験条件の制御が容易で、影響因子が少なく、再現性が高く、正確で信頼性の高い結果が得られるという利点があります。さらに、この方法は経済的で実現可能と考えられています。

また、in vitro腸管実験には、不純物や無機イオン、サポニン、タンニンを含む未精製の粗漢方薬製剤を使用するなど、実験の信頼性に影響を与える可能性のある制限があります。したがって、液体のpHやさまざまな電解粒子や不純物粒子など、不純物や物理化学的要因が実験結果に与える影響を完全に評価する必要があります。さらに、in vitro実験器具の安定性の向上とin vitro腸管の保存技術の向上が必要です。in vitro実験を設計する際には、使用する薬剤や調製物がこれらの実験の要件(不純物のレベルなど)を満たしているかどうかを考慮することが不可欠です。

この方法では、守る必要のあるいくつかの注意事項があります。まず、実験の前に腸管をラットの腹腔から取り出し、冷たいPSSに浸す必要があります。さらに、チューブ全体を複数の部分にカットして冷蔵庫に保管し、腸への刺激を最小限に抑えることが重要です。投与プロセス中は、投与チューブが腸管が吊り下げられているラインに接触しないようにすることが重要です。さらに、浴槽に添加する薬物の量は正確であるべきであり、結果に影響を与えないように、薬物を浴槽の壁や腸管に直接添加しないでください。腸管をすすぐときは、穏やかなアプローチを使用し、組織の拘縮を防ぐために高圧のすすぎは避けるべきです。腸管はピンセットで取り扱い、長時間空気にさらさないようにして、活動の損失を防ぐことをお勧めします。

この論文では、腸管単離実験の実験的方法論のデモンストレーションを提示し、腸管受容体に作用するさまざまな従来の薬物の影響を使用して、腸管の動きへの影響を説明し、胃腸管の運動性を制御する薬物の作用機序を調査するための効果的なアプローチを提供します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アセチルコリン	シグマ、米国	A6625
アトロピン	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	IA06501
バリウム 塩化バリウム	Macklin Biochemical Co.,Ltd., Shanghai, China	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
描画ソフトウェア	GraphPad Software、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国	—
エピネフリン	シグマ、米国	E4642
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd.、山東省、中国	S3872
体外組織灌流システム	PowerLab、ADInstruments、オーストラリア	ML0146
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd.、上海、中国	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments、オーストラリア	—
MgCl<サブ>2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
nifedipine	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	N5087
統計分析ソフトウェア	GraphPad Software、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国	—
外科用縫合糸ジョンソン	、米国	—