低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

次世代シーケンシング(NGS)は、超並列シーケンシングとも呼ばれ、DNA断片化、アダプターオリゴヌクレオチドのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの増幅、DNAのシーケンシング、およびフラグメント配列のゲノムへの再アセンブルを含むDNAシーケンシング技術です。NGSのシーケンシングRNAへの適応(RNA-seq)は、RNA転写産物とそのバリアント^を同定および定量するための強力なアプローチです1。RNAライブラリー調製ワークフローとバイオインフォマティクス解析パイプラインの革新的な開発は、ラボ装置の進歩と相まって、RNA-seqアプリケーションのレパートリーを拡大し、エクソームシーケンシングを超えて、ノンコーディングRNAプロファイリング²、シングルセル解析³、空間トランスクリプトミクス^4,5、選択的スプライシング^解析6などの高度な機能オミクスへと進歩していますなど。これらの高度なRNA-seq法は、正常細胞および疾患細胞および組織におけるトランスクリプトームの定量解析を通じて、複雑なRNA機能を明らかにします。

RNA-seqのこれらの進歩にもかかわらず、いくつかの重要な技術的特徴が、このメソッドの定量的な検出力を制限しています。ほとんどのRNA-seq法では、実験変数(生体サンプルや生理学的状態)間のRNAレベルの変化を正確かつ正確に定量することができますが、サンプル内のRNA分子レベルを定量的に比較することはできません。例えば、ほとんどのRNA-seq法では、発現したtRNAの細胞プールにおける個々のtRNAアイソアクセプター分子の相対的なコピー数を正確に定量することはできません。コンパニオンの出版物⁷で強調されているように、RNA-seqに対するこの制限は、RNA構造のいくつかの特徴とライブラリ調製の生化学から生じます。例えば、3'末端および5'末端シーケンシングリンカーをRNA分子に結合するために使用されるライゲーション酵素の活性は、RNAの末端ヌクレオチドとシーケンシングリンカーの同一性に強く影響されます。これにより、リンカーライゲーションの効率に大きなばらつきが生じ、シーケンシングリード^8,9,10の大幅な人工的な増加がもたらされます。

2つ目の制限は、RNA分子の固有の構造特性から生じます。具体的には、エピトランスクリプトームの数十の転写後RNA修飾におけるRNA二次構造の形成と動的変化は、逆転写中にポリメラーゼのフォールオフまたは突然変異を引き起こす可能性があります。これらのエラーは、不完全または切断されたcDNA合成またはRNA配列の変更につながります。これらの現象は両方とも二次構造またはいくつかの修飾をマッピングするために利用することができますが、その後のライブラリ調製ステップが切断されたcDNAを捕捉できない場合、またはデータ処理が参照データセット^11,12と一致しない変異配列を捨てる場合、RNA-seqの定量精度を低下させます。さらに、RNA転写産物の化学的、長さ、構造的多様性が膨大であること、および長いRNAを均一に断片化するためのツールが不足しているため、ほとんどのRNA-seq法の全てのRNA種への適用性が低下しています¹³。

AQRNA-seq(Absolute Quantification RNA Sequencing)法は、定量精度を制限するこれらの技術的および生物学的制約のいくつかを取り除くために開発されました⁷。AQRNA-seqは、RNAシーケンシングライブラリー調製時の捕捉、ライゲーション、増幅における配列依存バイアスを最小限に抑えることで、他の方法と比較して優れた直線性を達成し、963のmiRNAのリファレンスライブラリーの75%を2倍の精度で正確に定量します。シーケンシングリード数とRNA存在量のこの線形相関は、RNAオリゴヌクレオチドスタンダードの可変長プールの分析や、ノーザンブロッティングなどの直交法を参照しても観察されます。シーケンシングリードカウントとRNA量との間に直線性を確立することで、AQRNA-seqはサンプル内のすべてのRNA分子種を正確かつ絶対的に定量することができます。

ここでは、AQRNA-seqライブラリ調製ワークフローのプロトコルと、それに付随するダウンストリームデータ解析パイプラインについて説明します。この方法は、結核の Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin(BCG)モデルにおける飢餓誘発性休眠およびその後の蘇生中のtRNA存在量のダイナミクスを解明するために適用されました。シーケンシングデータの探索的可視化の結果と、その後のクラスタリングおよび差次的発現解析の結果が発表され、さまざまな表現型に関連するtRNA存在量の識別可能なパターンが明らかになりました。

注: 図1 は、AQRNA-seqライブラリの調製に関連する手順を図示したものです。この手順で使用した試薬、化学薬品、カラム/キットに関する詳細な情報は、 材料表に記載されています。インプット RNA サンプルの純度、完全性、および量の包括的な評価は、(i)3% アガロースゲル電気泳動、(ii)生体分子のサンプル品質管理のための自動電気泳動ツール( 材料表を参照)、および (iii) 紫外可視分光光度法および/または蛍光定量法を使用して行うことをお勧めします。特に指定がない限り、すべての反応とマスターミックスを氷上に保管することが義務付けられています。試薬(酵素など)をクールボックスに入れて-20°Cで保管したり、-20°Cで保管したりして、保存期間を維持し、ライブラリー中間体の複数回の凍結融解サイクルを回避します。

1. RNAの脱リン酸化

注:5'-リン酸(P;供与体)の除去は、RNAの3'-ヒドロキシル(OH;アクセプター)への自己ライゲーションを防ぎます。リンカーは、3'末端がジデオキシシチジン(リンカー1)またはスペーサー(リンカー2)のいずれかを組み込むように修飾されているため、自己ライゲーションしません。リンカーは、その5'-PをRNAまたはcDNAの3'-OHに結合することによってのみライゲーションできます。

1. 滅菌PCRチューブ(例:200 μLまたは500 μLチューブ)で、最大2 μLのRNAサンプル、0.5 μLの40 U/μL RNase阻害剤、1 μLの0.5 μM内部標準(表1)、0.5 μLの10x T4 RNAリガーゼ反応バッファー、1 μLの1 U/μLエビアルカリホスファターゼ、 また、全容量を5 μLにするのに十分なRNaseフリー水。
   注:一般的なサンプルでは、このプロトコルを使用したsmall RNAの定量には、75 ngのRNA(または80 nt RNAの場合は約2 pmol)で十分であると考えられています。
2. 37°Cで30分間インキュベートしてRNAを脱リン酸化し、次に65°Cで5分間インキュベートして酵素を不活性化し、RNAを変性させます。再成長を防ぐために、サンプルを4°Cに少なくとも10分間保持します。

2. リンカー1とRNAの3'末端へのライゲーション

1. 5 μL の脱リン酸化 RNA(ステップ 1 の産物)、0.5 μL の 40 U/μL RNase 阻害剤、100 μM Linker 1 1 μL (表 1)、3 μL の 10 mM ATP、2.5 μL の 10x T4 RNA リガーゼ反応バッファー、15 μL の PEG8000 15 μL の 10% 溶液 (50% 溶液) を加えて、滅菌 PCR チューブで Linker 1 ライゲーション反応液を調製します。 2 μL の 30 U/μL T4 RNA リガーゼ 1 と 1 μL の RNase フリー水。
   注:試薬をマスターミックスにして、サンプルの処理を容易にすることができます。PEG8000およびT4 RNAリガーゼ1をマスターミックスに含めないでください。
2. 25°Cで2時間インキュベートし、次に16°Cで16時間インキュベートして、リンカー1をRNAにライゲーションします。
3. Linker-1-ligated RNAをカラム精製します。DNA/RNAの回収とクリーンアップにはキットを使用してください( 材料の表を参照)。
   注:このカラム精製プロトコルは、同じキットを使用した後続のすべてのカラム精製に適用されます。ゲルろ過技術を使用してシーケンシング反応から色素ターミネーターを除去するキット( 材料表を参照)は、PEG8000そのようなキットのゲルフィルターと互換性がないため、ここでは使用できません。精製後は、各サンプルのアリコート(1.2 μL)を保存することをお勧めします。必要に応じて、これらのアリコートを使用して、市販の核酸分析装置を実行することにより、ライゲーション効率を確認できます。残りの精製サンプルは、次のステップまで氷上または-20°Cに保ちます。
   1. サンプル容量<が50 μLの場合、RNaseフリーの水を加えて50 μLにし、サンプル1容量に2容量のオリゴ結合バッファー(キットに付属)を加えます。サンプルの1容量に8容量の100%エタノールを加えます。
   2. サンプル(一度に最大750 μL)を2 mLの収集チューブ(キットに付属)内のカラムにロードします。RNAをカラムに結合するには、10,000 x g で30秒間遠心分離し、フロースルー(つまり、収集チューブ内の液体)を廃棄します。カラムを回収チューブに戻します。
   3. カラムから不純物を洗い流すには、750 μLのDNA洗浄バッファー(キットに付属)をカラムに加えます。10,000 x g で30秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。カラムを回収チューブに戻します。
   4. 最大速度(ベンチトップマイクロ遠心分離機の場合は16,000 x g など)でさらに1分間遠心分離し、残留DNA洗浄バッファーを除去します。
   5. RNAを溶出するには、カラムを滅菌済みの1.5 mLチューブに慎重に移動し、RNaseを含まない水をカラムに加えます。RNAを溶出する際には、溶出プロセスでの容量損失の可能性を考慮して、必要以上に大量の量を使用してください。例えば、次のステップで15 μLが必要な場合は、溶出のために17 μLのRNaseフリー水を加えます。10,000 x g で30秒間遠心分離します。

3. AlkBデメチラーゼによる転写後メチル化の除去

注:AlkBは、DNAおよびRNAのすべてではないが一部のメチル化ヌクレオチドからメチル基を除去する細菌酵素です。RNA中の数種類のメチル化リボヌクレオチドを除去することで、逆転写酵素のフォールオフを防ぎ、より完全な長さのリードと修飾部位の同定を可能にします。このステップは、RNAの予期せぬ分解を防ぐために、低pHで制御する必要があります。

1. 1.4611 gの2-ケトグルタル酸(146.11 g /M)を10 mLのRNaseフリー水に溶解して、1 M 2-ケトグルタル酸の原液を調製します。.0.2 μmシリンジフィルターで溶液を滅菌します。ストック溶液を2 mLの滅菌チューブに分注し、-20°Cで保存します。
2. 0.88 gのL-アスコルビン酸(176.12 g /M)を10 mLのRNaseフリー水に溶解して、0.5 M L-アスコルビン酸の原液を調製します。0.2 μmシリンジフィルターで溶液を滅菌します。ストック溶液を2 mLの滅菌チューブに分注し、-20°Cで保存します。
3. 0.9835 gの硫酸第一鉄アンモニウム六水和物(392.14 g / M)を10 mLのRNaseフリー水に溶解して、0.25 M硫酸第一鉄六水和物の原液を調製します。0.2 μmシリンジフィルターで溶液を滅菌します。ストック溶液を2 mLの滅菌チューブに分注し、-20°Cで保存します。
4. 2.383 gのHEPES(238.30 g /M)を10 mLのRNaseフリー水に溶解して、1 M HEPESのストック溶液を調製します。NaOHを用いて溶液のpHを8に調整し、0.2μmシリンジフィルターで溶液をろ過滅菌します。ストック溶液を2 mLの滅菌チューブに分注し、-20°Cで保存します。
5. 2x AlkB反応バッファーを調製します。10 mLの緩衝液を作成するには、1.5 μLの1 M 2-ケトグルタル酸(ステップ3.1で作成)、80 μLの0.5 M L-アスコルビン酸(ステップ3.2で作成)、6 μLの0.25 Mアンモニウム硫酸第一鉄六水和物(ステップ3.3で作成)、100 μLの10 mg / mL BSA、1000 μLの1 M HEPES(ステップ3.4で作成、最後に追加)を組み合わせます。 8812.5μLのRNaseフリー水。フィルターは、0.2μmシリンジフィルターでバッファーを滅菌します。
   注:2x AlkB反応バッファーは、成分の化学的不安定性のため、各実験の直前に新鮮に調製する必要があります。
6. 20 μLのLinker-1-ligated RNA(ステップ2の産物)、50 μLの2x AlkB反応バッファー(ステップ3.5で作製)、2 μLのAlkBデメチラーゼ、1 μLのRNase阻害剤、および27 μLのRNaseフリー水を加えて、滅菌PCRチューブでAlkB消化反応を調製します。
7. 室温で2時間インキュベートして、RNAから転写後メチル化を除去します。
8. 反応からAlkBを除去するには、以下で説明する手順に従ってください。
   1. 清浄な相分離のためには、50 μLのRNaseフリー水をAlkB反応液に加え、次に100 μLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール25:24:1(pH = 5.2)を加えます。
   2. 手で10秒間振とうした後、16,000 x g で10分間遠心分離します。卓上遠心分離機のローターがPCRチューブと互換性があることを確認してください。必要に応じてアダプターを使用してください。
   3. RNA(すなわち、上部の水層、約140μL)を滅菌済みの1.5mLチューブに移します。クロロホルム(すなわち、最下層)が水層に混合されている場合は、同じ設定で再度遠心分離します。
   4. 抽出したRNAに100μLのクロロホルムを添加して、残留フェノールを除去します。手で10秒間振とうした後、16,000 x g で10分間遠心分離します。
   5. RNA(すなわち、上部の水性層、約120μL)を滅菌済みの1.5mLチューブに移します。
9. 抽出したRNAをカラム精製します。DNA/RNAの回収とクリーンアップにはキットを使用してください( 材料の表を参照)。ステップ2.3で詳述したプロトコルに従って、カラム精製を行います。

4. 余分なリンカ1の除去

注:精製後、各サンプルのアリコート(1.2 μL)を保存することをお勧めします。必要に応じて、これらのアリコートを使用して、市販の核酸分析装置を実行することにより、RecJf消化の効率を確認できます。精製したサンプルをすぐに進めて、逆転写に進みます。

1. 15 μLのLinker-1-ligated RNA(ステップ3の産物)、1 μLの40 U/μL RNase阻害剤、2 μLの10x kit buffer 2( 材料表を参照)、および2 μLの50 U/μL 5'-deadenylaseを添加して、滅菌PCRチューブでデッドニル化反応を調製します。
2. 30°Cで1時間インキュベートし、Linker 1の5'末端のアデニンを除去します。2 μL の 30 U/μL RecJf をデッドデニル化反応液に加えます。
3. 37°Cで30分間インキュベートし、余分なリンカー1を消化します。さらに2 μLの30 U/μL RecJfを反応液に加えます。
4. 37°Cで30分間インキュベートして過剰なLinker 1の消化を続け、次に65°Cで20分間インキュベートして酵素を変性させます。
5. Linker-1-ligated RNAをカラム精製します。ゲルろ過技術を使用したキットを使用して、シーケンシング反応から色素ターミネーターを除去するキット( 材料表を参照)を使用すると、短い残留物(長さが2〜10 bpのオリゴヌクレオチドなど)の除去に効果的です。精製については、以下で説明する手順に従ってください。
   1. ゲルフィルターカラムは、メーカーのプロトコルに従って調製してください。滅菌済みの1.5 mLチューブにカラムを入れ、24 μLのサンプルをカラムにロードします。
   2. RNAを精製するには、800 x g で3分間遠心分離し、カラムを廃棄します。精製されたRNAは溶離液中にあります。

5. 逆転写(RT)反応

注:以下のRT( 材料表を参照)反応のセットアップは、メーカーのプロトコルに従っており、AQRNA-seqとの互換性を確保するために若干の変更が加えられています。

1. 24 μLのテンプレートRNA(ステップ4の製品)、1 μLの2 μM RTプライマー(表1)、および1 μLのdNTP(各タイプのヌクレオチド10 mM)を加えて、滅菌PCRチューブでRTプライマーアニーリング反応を調製します。
2. 80°Cで2分間インキュベートし、RTプライマーをテンプレートRNAにアニーリングした後、すぐに氷上で2分間冷却します。
3. 5x RT反応バッファー6 μL、40 U/μL RNase阻害剤1 μL、逆転写酵素1 μLをアニーリング反応チューブに添加して、RT反応を準備します。
4. 50°Cで2時間インキュベートしてRNAテンプレートを逆転写し、次に70°Cで15分間インキュベートして酵素を不活性化します。RT産物(すなわち、RNA-cDNAハイブリッド)は、4°Cまたは-20°Cで一晩保存できます。

6. RNA加水分解

1. 1 μL の 5 M NaOH を RNA-cDNA ハイブリッド (ステップ 5 の産物) に加えます。93°Cで3分間インキュベートし、RNA-cDNAハイブリッドのRNA鎖を加水分解します。
2. 0.77 μLの5 M HClを加えて、反応を中和します。HClを加えた後、フリックして混ぜ合わせ、チューブを回転させます。中和は瞬時に行われます。
   注:緩衝条件で1 μLのNaOHを中和するために必要な5 M HClの正確な量をテストすることをお勧めします(例:pHストリップを使用)。
3. 一本鎖cDNAをカラム精製します。DNA/RNAの回収とクリーンアップにはキットを使用してください( 材料の表を参照)。ステップ2.3で詳述したプロトコルに従って、カラム精製を行います。
   注:ゲルろ過技術を使用してシーケンシング反応から色素ターミネーターを除去するキット( 材料表を参照)は、前のステップでpHが異なるため、ここでは使用できません。
4. 精製したcDNAを<5 μLまでスピードバキュームし、次にRNaseフリーの水を加えて容量を5 μLに戻します。cDNAを完全に乾燥させるためにスピードバキュームしないように注意してください。
5. 精製したcDNAを滅菌PCRチューブに移します。精製したcDNAは、-20°Cで最大1週間保存できます。

7. リンカー2とcDNAの3'末端へのライゲーション

1. 5 μL の cDNA(ステップ 6 の産物)、1 μL の 50 μM Linker 2 (表 1)、2 μL の 10x T4 DNA リガーゼ反応バッファー、10 mM ATP 1 μL 1 μL、9 μL の PEG8000 (50% 溶液)、および 2 μL の 400 U/μL T4 DNA リガーゼを 2 μL 加えて、滅菌 PCR チューブで Linker 2 ライゲーション反応を調製します。
   注:試薬をマスターミックスにして、サンプルの処理を容易にすることができます。PEG8000およびT4 DNAリガーゼをマスターミックスに含めないでください。
2. 16°Cで16時間インキュベートし、Linker 2をcDNAにライゲーションします。
3. Linker-2-ligated cDNAをカラム精製します。DNA/RNAの回収とクリーンアップにはキットを使用してください( 材料の表を参照)。ステップ2.3で詳述したプロトコルに従って、カラム精製を行います。

8. 余分なリンカの除去 2

1. 16 μLのLinker-2-ligated cDNA、2 μLの10x kit buffer 2、および2 μLの50 U/μL 5'-deadenylaseを2 μL加えて、滅菌PCRチューブでデッドデニル化反応を調製します。30°Cで1時間インキュベートし、Linker 2の5'末端のアデニンを除去します。
2. 2 μL の 30 U/μL RecJf をデッドデニル化反応液に加えます。37°Cで30分間インキュベートし、余分なリンカー2を消化します。さらに2 μLの30 U/μL RecJfを反応液に加えます。
3. 37°Cで30分間インキュベートして過剰なLinker 2の消化を継続し、次に65°Cで20分間インキュベートして酵素を変性させます。

9. シーケンシングプライマーによるcDNAのPCR増幅

1. PCRプライマーをサンプルに割り当てます。各サンプルは、効果的なマルチプレックス化のために、フォワードプライマーとリバースプライマーの独自の組み合わせが必要です(表1)。
2. RNaseフリーの水を加えてサンプル量を25 μLにし、PCRを繰り返す必要がある場合のバックアップとして、各サンプルを5 μL滅菌PCRチューブに保存します。
3. 20 μL の cDNA(ステップ 8 の製品)、1 μL の 2.5 μM フォワードプライマー、1 μL の 2.5 μM リバースプライマー、25 μL の 2x DNA ポリメラーゼバッファー、2 μL の RNase-フリー水、1 μL の DNA ポリメラーゼを加えて、PCR 反応液 (PCR キットの 材料表 を参照) を調製します。
   注:試薬をマスターミックスにして、サンプルの処理を容易にすることができます。マスターミックスにDNAポリメラーゼを添加しないでください。
4. 最初の変性を94°Cで1分間行い、続いて98°Cで20秒間の変性を18サイクル行い、58°Cで20秒間アニールし、68°Cで1分間伸ばしてPCRを実行します。
   注:線形範囲を超えてPCR増幅しないでください。ほとんどの実験では合計18サイクルが最適ですが、これは状況に依存する場合があります。
5. PCR産物を25 μL未満に急速吸引し、次にRNaseフリー水を加えて容量を25 μLに戻します。PCR産物の5 μLを滅菌済みの0.5 mLチューブに移してサイズ分布を確認します(ステップ9.6を参照)。残りの20 μLのPCR産物は、次のステップまで-20°Cで保存します。
6. 以下に説明するように、PCR産物のサイズ分布を確認してください。
   1. TAEバッファーに3%アガロースゲルを調製します。
      注:このプロトコールでは、エチジウムブロマイド(EtBr)を電気泳動後のゲル染色に使用します(ステップ9.6.5を参照)。このステップで適切なDNA染色液をゲル溶液に添加するか、後でゲル染色に使用することができます。
   2. 1 μL の 6x ローディング色素を 5 μL の PCR 産物 (ステップ 9.5 から) に混合し、混合物をゲルにロードします。
   3. 5 μLのDNAラダーを最初のサンプルの前のウェルと最後のサンプルの後のウェルにロードします。50 bpまたは100 bpのDNAラダーを使用して、150 bpから300 bpまでのPCR産物のサイズ識別を改善します。
   4. ゲル電気泳動を実行して、PCR産物を見つけます。適切な実行条件は、コンテキストに依存する場合があります。ここでは、17.78 cm (幅) x 10.16 cm (高さ) x 1 cm (厚さ) のゲルスラブに対して、120 V、400 mA で 75 分間運転します。
   5. ゲルを箱に入れ、ゲルが完全に浸るまで脱イオン(DI)水で箱を満たします。ゲルを浸した脱イオン水に10 μLのEtBrを加えます。箱をホイルで包み、シェーカーの上に置きます。振とうしながらゲルを30分間染色します。
   6. EtBrを含む廃棄物は、ドラフトに入れた廃棄物ボトルに捨ててください。ゲルを脱イオン水で一度すすぎ、EtBr含有水は廃液ボトルに捨ててください。
   7. ゲルが完全に浸るまで、ボックスにDI水を入れます。箱をホイルで包み、シェーカーの上に置きます。振とうしながらジェルを10分間洗います。
   8. EtBrを含む水は、ドラフト内の廃棄物ボトルに捨ててください。ゲルイメージャーを使用してバンドを視覚化します。ゲルの高解像度画像を取得します。

10.ゲル精製

1. TAEバッファーに3%アガロースゲルを調製します。幅の広いコーム(厚さ1 mm、幅5 mm、深さ15 mm)で厚さ1 cmのゲルを作成し、各ウェルに少なくとも25 μLのサンプルローディング染料混合物を格納できます。
2. 4 μL の 6x ローディング色素と 20 μL の PCR 産物 (ステップ 9.5 以降) を混合し、混合物をゲルにロードします。サンプル間には空のレーンを残して、ゲル除去中のクロスコンタミネーションを最小限に抑えます。
3. DNAラダーをロードし、ゲル電気泳動を実行し、ゲルを染色して洗浄し、ステップ9.6で説明されているようにゲル画像を撮影します。
4. PCR産物を目標サイズ範囲内に含むゲルブロックを切除します。プライマーダイマー(インサートなしの175 bpリンカー)によるコンタミネーションを最小限に抑えるには、195 bpを超えるサイズのPCR産物(175 bpリンカー+ 20 bp miRNA)を抽出します。
5. ゲル抽出を使用してPCR産物を精製します。ゲル抽出キットを使用します( 材料の表を参照)。精製プロトコルはメーカーのプロトコルに基づいており、AQRNA-seqの互換性のために若干の変更が加えられています。すべての遠心分離ステップは、特に指定がない限り、ベンチトップ遠心分離機を使用して室温で17,900 x g で1分間実施する必要があります。以下で説明する手順に従います。
   1. チューブ内のゲルブロックの重量を測定します。6容量のBuffer QG(キットに付属)を1容量のゲルブロック(1 mgゲルは約1 μL)に加えます。
   2. 50°Cで10分間、またはゲルブロックが完全に溶解するまでインキュベートします。ゲルの溶解を促進するために、2分ごとにボルテックスチューブを充填します。ゲルを溶解した後、混合物は溶解したゲルを含まないバッファーQGの色に似ているはずです。色がオレンジ色または紫色の場合は、3 M酢酸ナトリウム(pH = 5.0)を10 μL加え、よく混ぜます。
   3. 混合物に1ゲル容量のイソプロパノールを加え、十分に混合します。スピンカラムを2 mLコレクションチューブ(キットに付属)に入れます。
   4. DNAを結合するには、サンプル(毎回最大750 μL)をカラムに適用し、遠心分離します。フロースルーを廃棄し、カラムを同じ収集チューブに戻します。スピンカラムあたりのゲルの最大量は400 mgです。
   5. 500 μLのBuffer QGをカラムに加え、遠心分離します。フロースルーを廃棄し、カラムを同じ収集チューブに戻します。
   6. 不純物を洗浄するには、750 μL のバッファー PE(キットに付属)をカラムに加え、カラムを 5 分間放置して遠心分離します。フロースルーを廃棄し、カラムを同じ収集チューブに戻します。もう一度遠心分離して、残留洗浄バッファーを除去します。
   7. カラムを滅菌済みの1.5 mLチューブに入れます。DNAを溶出するには、30 μLのBuffer EB(キットに付属)をカラムメンブレンの中央に添加し、カラムを4分間放置して遠心分離します。
   8. スピードバキュームし、ゲル精製したPCR産物を12 μLのBuffer EBに再懸濁します。
6. 構築したライブラリの濃度を、紫外可視分光光度法および/または蛍光定量法により測定します。

11. ライブラリーシーケンシング

1. 構築したライブラリを外部のシーケンシングセンターに提出し、品質評価とIlluminaシーケンシングを行います。small RNAランドスケープの定量的マッピングで十分な感度を確保するには、各方向(すなわちPE75)から75 bpのリードによるペアエンドシーケンシングを選択し、各サンプルの各方向で少なくとも1.5 Mの生シーケンスリードを目指します。NextSeqシーケンシングにはカスタムプライマー(表1)を使用しますが、これはMiSeqでのシーケンシングではオプションです。
   注:シーケンシングは、MiSeqまたはNextSeq500プラットフォームを使用して実行できます。プラットフォームの選択は、サンプルの性質と総サンプル数によって異なる場合があります。

12. データ分析パイプライン

注: 図2 は、データ解析パイプラインに関連する簡略化された手順をグラフィカルに示したもので、生の配列読み取り(FASTQ形式)を入力として、目的のsmall RNA種のメンバーを表す行とサンプルを表す列を含む存在量マトリックスを生成します。ペアエンドシーケンシングの場合、各サンプルは 2 つの FASTQ ファイルに対応し、1 つはフォワードリード用、もう 1 つはリバースリード用です。関連するすべてのスクリプトと、各ステップの広範な注釈が記載されたマニュアルを含む完全なデータ分析パイプラインは、GitHub(https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git)で入手できます。

1. 外部シーケンシングセンターから生のシーケンスリードを取得し、FastQC¹⁴ や fastp¹⁵ などのオープンソースプログラムを使用してシーケンシングの品質を評価します。
2. リファレンスシーケンスライブラリをFASTA形式で作成します。
   注:パイプラインが多様なsmall RNAクラスに適応するための鍵は、適切なリファレンス配列ライブラリです。特定の対象 RNA クラス(miRNA など)のメンバーの存在量を正確に推定するために、ユーザーはパイプラインで使用する参照配列ライブラリを細心の注意を払ってキュレーションすることが期待されます。パイプライン実行に関する他のすべての命令は、異なるsmall RNAクラス間で一貫性を保ちます。
3. データ解析パイプラインを実装するための AQRNA-seq という名前のディレクトリを作成し、すべてのスクリプト、品質フィルタリングされたシーケンスリード、および参照シーケンスライブラリをこのディレクトリに配置します。GitHub(https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git)の詳細な手順に従って、サブディレクトリを準備し、さまざまな生物やsmall RNA種を対象とするファイルに必要な変更を加え、オペレーティングシステムやジョブスケジューラの互換性も考慮します。
4. GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) のマニュアルに記載されている手順に従って、データ分析パイプラインを実装します。このマニュアルには、各手順の説明、入力ファイルと出力ファイル、およびコマンド ラインが含まれています。要約すると、パイプラインには、(i)リードからのリンカー配列とランダムなヌクレオチドのトリミング、(ii)リードの長さに基づくリードのフィルタリング、(iii)リードの参照配列へのマッピング、(iv)あいまいなマッピングの解決、および(v)存在量マトリックスの生成が含まれます。

マイコバクテリウム・ボビス 指数関数的に成長しているBCG(Bacilli de Calmette et Guérin)株1173P2は、時系列(0、4、10、および20日)の栄養飢餓にさらされ、その後、以前にHu et al.7で提示されたように、栄養豊富な培地で6日間の蘇生が行われました。細菌培養からsmall RNAを単離し、指定された5つの時点のそれぞれで3つの生物学的複製を行いました。Illuminaライブラリは、上記のAQRNA-seqライブラリ調製ワークフロー(図1)を使用して構築され、続いてマサチューセッツ工科大学のBioMicroセンターでシーケンサーでシーケンシングされました。次に、tRNA存在量の定量化のためにカスタマイズされたAQRNA-seqデータ解析パイプライン(図2)を使用して、シーケンシングデータを処理しました。

シーケンシングプライマーによるcDNAライブラリーのPCR増幅後、すべてのサンプルで175塩基対(bp)のサイズのPCR産物の存在が観察され(図3A)、プライマー二量体の形成が示唆されました。プライマーダイマーのキャリーオーバーを軽減するために、サイズが195 bpを超えるPCR産物をゲルから取り出して精製しました(図3B)。

品質フィルタリングおよびトリミングされた配列リードは、45 tRNA アイソアクセプター、内部標準、およびコントロール配列 (23S rRNA、16S rRNA、5S rRNA、rnpB、ssr) を含むカスタムリファレンス配列ライブラリにマッピングされました。tRNAアイソアクセプターは、特定のサンプルのマッピングされた全リードの10.5〜40.2%を占め、コントロール配列よりもはるかに高い存在量を示しました(図4)。重要なことに、tRNAアイソアクセプターのリード比が比較的低いのは、内部標準の相対存在量が高いことに起因している可能性があります。したがって、内部標準物質(図4、ピンク色と緑色のブロック)に対するtRNAアイソアクセラーの読み取られた比率は、反応にスパイクされる内部標準の量を微調整することで、オペレーターが制御できます。

生tRNA存在量データは、R Statistical Programming Environment(以下、R)v4.2.117において、DESeq2パッケージ版(以下、v)1.36.016で実装したmedian of ratios法を用いて正規化した。標準化後、Mycobacterium bovis BCGのtRNAアイソアクセプターの定量的な状況が、栄養飢餓と蘇生の時間経過中に達成されます(図5)。

tRNAアイソアクセプター存在量のパターンに基づいて、表現型が異なるサンプルの明確なクラスターを明らかにするために、Rのstatsパッケージv 4.2.117 を使用して、正規化されたtRNA存在量データに対して主成分分析(PCA)を実行しました(図6)。この解析では、飢餓0日目と蘇生6日目のサンプルを、飢餓4日目、10日目、20日目のサンプルと区別し、栄養不足培地と栄養豊富な培地で増殖した Mycobacterium bovis BCGのtRNAランドスケープにかなりの差があることを示唆しています。

指定された5つの時点における各tRNAアイソアクセプターの存在量のダイナミクスをプロファイリングするために、RのDESeq2パッケージv 1.36.0を使用して、正規化されたtRNA存在量のデータに対して差次的発現分析を行いました(図7)。解析の結果、20のイソアクセプターファミリーのうち17のイソアクセプターファミリーには、少なくとも1つの時点で差次的に発現する(つまり、大幅にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされる)イソアクセプターが含まれていることが明らかになり、結核中の Mycobacterium bovis BCGの持続性状態におけるtRNAプールの制御が潜在的な役割を果たしていることが示唆されました。

図1:AQRNA-seqライブラリ調製ワークフローの概略図。 ワークフローで概説されている主要な手順は、回路図の中央にリストされ、点線でそれぞれのグラフィカル イラストに接続されています。各ステップの詳細な説明は、プロトコルのセクションにあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:AQRNA-seqデータ分析パイプラインの概略図。 パイプラインで概説されている主要な手順は、回路図の中央にリストされ、点線でそれぞれのグラフィカル イラストに接続されています。各ステップの詳細な説明は、GitHub(https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git)で入手できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:シーケンシングプライマーによるPCR増幅後のcDNA断片のアガロースゲル電気泳動(A)ゲル抽出および精製前のゲルの画像。左から7番と14番のレーンには50 bpのDNAラダーが5 μL入っており、他のレーンには15個のサンプルがそれぞれ20 μL入っています。PCR産物のサイズ局在は、175 bp(プライマーダイマー)から300 bp(2つのプライマー+ 120 bp 5S rRNA)の範囲内で最高濃度であることを示しています。(B)ゲル抽出および精製後のゲルのイメージ。各サンプルについて、シーケンシングライブラリのプライマーダイマーの汚染を最小限に抑えるために、200 bp から 400 bp のゲルブロックを切除しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:参照シーケンスライブラリに正常にマッピングされたシーケンスリードの数。 x軸は、時点(例:飢餓0)ごとにグループ化されたサンプルの名前(例:D18-69XX)を示しています。各サンプルについて、さまざまなターゲット・サブジェクト・カテゴリーに関連付けられた読み取りカウントは、互いに積み重なったカラー・ブロックを使用して表されます。カラーブロックの中央にある数字は、特定のサンプル内のそれぞれのターゲット被験者に対応するリードの割合を表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:飢餓と蘇生の時間経過に沿ったさまざまな時点における Mycobacterium bovis BCGのtRNAアイソアクセプターの定量的な状況。 生のtRNA存在量のデータは、ratiosの中央値法を使用して正規化しました。ここで、各行は、正規化されたtRNAの存在量(y軸)を、各時点における3つの生物学的複製の平均±標準誤差として示しています。x軸では、同じファミリーのアイソアクセプターをグループ化し、対応するアミノ酸で標識しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:主成分分析(PCA)から得られたサンプルのコサイン二乗プロット。 PCAは、正規化されたtRNA存在量に基づいて実行されました。コサインの二乗は、サンプルに対する主成分の重要性を示し、サンプルは最初の 2 つの主成分のコサインの二乗コサインに対してプロットされました。サンプルはサンプル ID を使用してラベル付けし、時点ごとに色分けしました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:異なる時点におけるtRNAアイソアクセプターの差次的発現。 正規化されたtRNAの存在量は、3つの生物学的レプリケートにわたる平均(ラインノット)±標準誤差(エラーバー)として要約されました。スペースの制限により、条件は次のように省略されました:S0-S20 =飢餓日0-20;R6 = 蘇生 6 日目。各tRNAアイソアクセプターについて差次的発現解析を行い、尤度比検定とWald検定を用いて、さまざまな時点をペアワイズで比較しました。統計的有意性を表すためにコンパクト文字が用いられ、少なくとも1つの共通文字を共有する時点での特定のtRNAイソアクセプターの存在量は互いに有意差がありませんでした。例えば、tRNA-Lys-CTT-1-1の存在量(Lysineパネル内)は、S0からS4へ、S4からS10へ有意にダウンレギュレーションされましたが、S10からS20へは減少しませんでした。その後、S20からR6に大幅に規制が引き上げられました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:AQRNA-seqライブラリー調製ワークフローに関与するオリゴヌクレオチド。 内部標準はRNAですが、他のすべてのオリゴヌクレオチドはDNAです。記載されているPCRプライマーおよびカスタムシーケンシングプライマーは、シーケンシングプラットフォームに特異的です。追加のPCRプライマーは、新しいインデックス配列を使用して設計できます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

P.C.D.は、公開された作品に関連する2つの特許(PCT/US2019/013714、US 2019/0284624 A1)の発明者です。