方法論記事

多重深部熱傷創の治癒過程を調査するための豚火傷モデル

DOI：

10.3791/66362

⸱

2024年2月23日

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1Vascularized Composite Allotransplantation Laboratory, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children’s Boston, 3Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Rennes University, 4SITI Laboratory, UMR, INSERM, Université de Rennes, 5Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 6Innovative Therapies in Haemostasis, INSERM UMR-S, University of Paris

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ユカタンのミニブタにおける再現可能な多深度熱傷創モデルについて説明しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

火傷の治癒は複雑で長いプロセスです。豊富な経験にもかかわらず、火傷センターの形成外科医と専門チームは依然として大きな課題に直面しています。これらの課題の中で、焼けた軟部組織の程度は初期段階で進化する可能性があり、保存的治療と壊死組織除去との間の微妙なバランスを生み出します。熱傷は最も一般的なタイプであり、火傷の深さは、温度や露光時間などの複数のパラメーターによって異なります。火傷の深さも時間とともに変化し、「シャドウゾーン」の二次的な悪化はよく理解されていない現象です。これらの課題に対応するために、いくつかの革新的な治療法が研究されており、さらに多くの治療法が初期開発段階にあります。現代の創傷被覆材や人工皮膚のナノ粒子は、これらの最新の治療法の例であり、まだ評価中です。これらを総合すると、熱傷の診断と熱傷治療の両方に大幅な進歩が必要であり、研究チームは新しいツールや治療法をテストするための信頼性と関連性のあるモデルを必要としています。動物モデルの中で、ブタは皮膚構造が人間と強く似ているため、最も関連性があります。具体的には、ユカタンのミニブタは、メラニンの色素沈着や成長の遅さなどの興味深い特徴を示し、高いフォトタイプと長期的な治癒を研究することができます。この記事は、ユカタンのミニブタの多深度熱傷を研究するための信頼性と再現性のあるプロトコルについて説明し、長期的なフォローアップを可能にし、診断および治療研究に関連するモデルを提供することを目的としています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

火傷は主要な公衆衛生問題であり、National Burn Repository 1,2によると、米国では毎年480,000人以上の患者が罹患しています。これにより、綿密な治療を必要とする非致命的な複雑な症例で年間50,000人以上が入院しています2。さらに、火傷は軍隊の死亡率と罹患率の根本的な原因であり、軍隊の死傷者の10%から30%の原因となっています3,4。火傷の管理は、身体的から心理的、感情的なものに至るまで、患者に甚大で多様な影響を与えているにもかかわらず、長い間ほとんど変わっていません5。

熱傷の初期診断と評価は、熱傷の種類(第1、第2、および第3)または患部組織の深さ(表在性、部分的厚さ、および深い熱傷)によるベースライン分類につながります6,7,8。部分的な厚さの火傷 (第 1 度および第 2 度) は、表皮と真皮の異なる深さ (表在性または深部真皮、つまり表在性および深部の 2 度熱傷) に関与します9。特に、真皮深部の付属肢の損傷は、付属器上皮10からの再上皮化の可能性を排除します。定義上、全層熱傷は皮下脂肪、筋膜および/またはその下にある筋肉(第3度熱傷)、そして時には骨(第4度熱傷とも呼ばれる)に達する11,12。

入院後、火傷患者は、組織の創面切除と保存の微妙なバランスからなる戦略を含む特別なケアを受けます。損傷したおよび/または二次感染した軟部組織は、健康な組織が露出するまで徐々に除去する必要があり、治癒プロセスを改善するための特定の包帯および皮膚移植片の使用を可能にする13,14,15,16。それでも、手術中は、治癒組織の意図しない除去を避け、合併症を減らして最適な回復のために注意が必要です。生物学的には、火傷は「影」または「うっ血」ゾーンに囲まれた中央の壊死領域を示し、可逆的な虚血の可能性を示しています。この領域は、悪化して壊死ゾーンが拡大するか、またはアポトーシスプロセスを逆転させることによって治癒するかのどちらかである17,18。この火傷の重症度の違いは、外科医が正確に評価することが困難であり、保存的治療と外科的切除とのバランスを複雑にしています19。これまでのところ、バーンコンバージョンに先立つこの「シャドーゾーン」を特徴付けるのに役立つ効率的なツールは利用できません。このようなツールを開発することは、この微妙なバランスを最適化するために重要です。

二次熱傷の転換を減らすのに役立ついくつかの治療法がテストされています。しかし、現在、クリニックでは特定の治療法はありません18。火傷治療の進歩の他の例としては、最新の創傷被覆材とナノ材料の開発20,21、組織工学皮膚の開発22,23、および新しい表皮培養アプローチ24,25が含まれます。また、現代の再建手術と筋膜皮膚弁は、長期的な後遺症、特にひだ領域の病理学的治癒後の火傷拘縮の管理を改善しました26,27。これらの進歩は、火傷患者に有望な見通しを与え、彼らの治療戦略と生活の質を改善しますが、最近の結果は、機能的影響が物理的および心理的領域の両方で依然として大きいことを示しています28。これらを総合すると、熱傷診断と熱傷治療の両方における革新的な進歩に対する需要は相当なものです。

全体として、多くのアプローチは複雑な熱傷症例の診断、管理、および治療を改善することを目的としており、研究者はこれらの新しいアプローチをテストするために再現性のある関連モデルを必要としています。その生物学的な複雑さ、いくつかの臓器および全身反応が関与するため、熱傷創の過程を研究するために関連性が証明されたin vitroモデルはなかった29。げっ歯類モデルは、生物学、皮膚構造、弾力性、および基礎となる構造への順守の欠如における大きな違いにより、人間との大きな不一致を示している29。対照的に、ブタモデルは、ブタの皮膚とヒトの皮膚30,31,32の構造的類似性により、関連性があることが証明されている。それは、同様の血管新生、弾性線維組成、および更新タイミングを示します。さらに、毛包とアポクリン付属物は、臨床表在性火傷で観察できるように、島状再上皮化を可能にします33,34。より具体的には、ユカタンのミニブタモデルは興味深い特徴を提供し、色素沈着した皮膚35と最小限の身体的変化による長期的な結果36の研究に関連しています。

この記事の目的は、ユカタン豚の信頼性の高い多度熱傷モデルについて説明し、同じ主題でいくつかの第2度および第3度の熱傷の研究を可能にすることです。これにより、火傷の管理のための診断および治療の革新を研究するための関連性があり再現性のあるモデルが提供されます。さらに、このモデルは、さまざまな火傷の種類と重症度、火傷の拘縮と病理学的治癒の研究を可能にする長期追跡調査、および特定の特性を持つことが知られている色素沈着性皮膚の異なる行動を特徴としています。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物実験は、ARRIVE(Animal Research:Reporting In Vivo Experiments)チェックリスト37 に従って実施され、プロトコル #2021N000271 に基づくマサチューセッツ総合病院施設動物管理および使用委員会(IACUC)に準拠していました。動物には、実験動物の世話と使用に関するガイド38に従って、人道的なケアが提供されました。これらの実験には、30kgの雌のユカタンミニブタ5頭を使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。

1. 術前ケアと麻酔

  1. 全身麻酔の前に動物を12時間絶食します。
  2. 2〜4 mg / kgの塩酸チレタミンとゾラゼパム塩酸塩、および1〜2 mg / kgのキシラジンの筋肉内注射により麻酔を開始し、続いてイソフルラン(酸素中で2〜3%)を吸入します( 材料の表を参照)手順中に麻酔を維持します。.

2.火傷創の設計と無作為化

  1. 同じ動物でネガティブコントロールを使用した部分的および全層熱傷の両方を研究するために(個人間変動なし)、傍脊椎領域の各ブタの背側に8つの傷を作成します。全層創傷を 3 回、部分厚創を 3 回、コントロール創傷を 2 回行います。
  2. 傷に 1 から 8 までの番号を付け、ランダム化を実行して、背中のさまざまな解剖学的位置にさまざまな火傷度 (部分的な厚さ、完全な厚さ、コントロール) を割り当てます。
    注:各創傷(深さと位置)のランダム化は、重要性を改善するために行われます:ブタの真皮は、厚さとコラーゲン組成39の点で異なることが知られています。したがって、各動物のランダム化は、潜在的なバイアスを減らすために使用されます。

3.タトゥーの傷の区切り

注:最初の手順は、ランダム化された傷の位置を特定し、番号を付けるために、豚の背部に円形の入れ墨を作成することで構成されます(図1)。これは、順応性を高めるために最初の火傷手順の2日前に実行されますが、火傷手順の日に実行できます。

  1. 麻酔(ステップ1参照)および仰臥位での口腔気管挿管40の後、ブタを腹臥位に置き、動物の快適性と安定化のために柔らかいくさび(ベッドシーツ)を動物の下(前肢、臍帯、および後肢の下)に置く41。適切な体温を維持するために、動物の頭と首に強制空気加温ブランケットを置きます。
  2. ブタの背中の中央に直線を配置して、図面の対称性を確保します。
  3. 中心線の両側にダーモグラフィックペン( 資料表を参照)を使用して、中心線から横方向に6.5cm配置された2本の垂直線を引きます。2 本の横線を使用して、円の中心を配置します。
  4. 直径4.5 cmの円の各ペアを対称的に描き、2つの異なる円の間に4 cm以上の距離を保ちます(図1A)。
  5. 描画が完了したら、シングルステップの皮膚調製(ポビドンヨード7.5%)を実行して、皮膚細菌叢を減らします。
  6. ニードルタトゥーマシン、滅菌黒インク、滅菌した5点針を使用して、8つの4.5cm円のうち42 のタトゥー手順を実行します( 材料の表を参照)。最終結果を 図 1B に示します。
  7. 火傷の発生が遅れた場合は、タトゥーにトリプル抗生物質軟膏を塗布し、透明な粘着性包帯で覆います。

4.火傷創創の作成と高度な創傷被覆材

注:火傷は、真鍮ブロックを専用スポット(ランダム化)の皮膚に接触させて30秒(不変)配置することにより作成されます。温度によって燃焼深度が決まります。

  1. 火傷処置の日に、動物が麻酔され、ステップ1で説明したように腹臥位に置かれたら、アルミニウムビーズで満たされたステンレス鋼容器に円筒形の真鍮ブロックを置きます( 材料の表を参照)。容器を温度制御されたホットプレートに置きます。1つのホットプレートを65°C(部分的な厚さの燃焼用)に設定し、2番目のホットプレートを93°C(全層の燃焼用、 図2)に設定します。
    注:火傷を避けるために容器を乾いた状態に保つことができます(温度平衡に達するには2〜3時間必要)または水で半分満たされます(温度平衡に達するには30分)。水を使用する場合は、火傷によるその後の火傷を避けるために、ステップ4.5の前に真鍮ブロックを完全に乾燥させる必要があります。
  2. 真鍮製のシリンダーの中央の開口部 から 温度計を挿入してコア温度を監視し、温度ガンで表面温度を確認します。必要に応じて、わずかな熱放散にもかかわらず、シリンダー内のホットプレートの温度を65°Cまたは93°Cに上げます。
    注:アルミホイルを使用して容器を覆い、熱放散をさらに最小限に抑え、希望の温度により早く到達できます。
  3. 並行して、入れ墨の手順(ステップ3.1)と同様に、動物を火傷の手順のために腹臥位に置きます。
  4. 動物が腹臥位の準備ができたら、3つのステップ(ポビドンヨード7.5%、生理食塩水0.9%、乾燥)で皮膚を準備します。
  5. 真鍮のブロックを耐熱手袋でつかみ、ランダム化に応じて専用のタトゥースポットに置きます。真鍮のブロックが肌に触れたらすぐにタイマーを開始します。真鍮ブロックの自重以上の圧力が皮膚に加わらないように注意してください。
  6. 30秒後、真鍮ブロックを皮膚から取り外し、専用の加熱容器に戻します。目標に達するまで温度を監視し、すべての傷に対して手順を繰り返します。
  7. 動物が回復した後のドレッシングの安定性を確保するために、高度な多層ドレッシングを実行します。
    1. コントロールを含む各燃焼場所に石油含浸ガーゼを置き、乾燥した不織布ガーゼと大きな透明な接着剤ドレッシングで覆います。
    2. ベンゾイン溶液のチンキ剤を周囲の皮膚にスプレーして、透明なドレッシングが皮膚に密着します。
    3. 動物を自己接着性の粘着ラップドレッシングで包み、締めすぎないように注意します(肺容量の制限)。
    4. チューブラーストッキネット(動物に適したサイズ)の最終層を追加してドレッシングを完成させます( 材料の表を参照)。あるいは、動物が研究期間中にドレッシングを清潔に保つことができない場合は、カスタムフィットの豚ジャケットを使用することもできます
    5. ブプレノルフィンの単回投与(0.05-0.1 mg / kg、IM)とカルプロフェンの単回投与(2-4 mg / kg、IM)を注射した後、動物の首に経皮オピオイド(フェンタニル)パッチを貼ることにより、正しい鎮痛を確保します。
    6. 各麻酔薬の後、回復後2時間まで動物を注意深く監視します。.必要に応じて温かいパッドを使用し、完全に立った状態になったら自由に食事を提供します。

5.全層熱傷痂開術

注: 術後 1 日から 3 日の間に、動物は 3 度の火傷の後、痂皮の全層外科的切除を受けます。

  1. 麻酔、挿管、および動物を仰臥位に置くことを含む動物の同様の調製後、3段階の皮膚調製により皮膚を調製し、動物の背中の滅菌ドレープを行う。
  2. 傷口に4mmパンチ生検( 材料の表を参照)を行い、損傷の種類を確認します。
  3. 痂皮切開術43,44は、滅菌メス刃(n°15)で痂皮を円形に切開し、真皮深部に到達するまで行います。
  4. 痂皮の片側を滅菌済みのAdson組織鉗子(2/1歯付き)( 材料の表を参照)でしっかりとつかみ、上向きにヒッチして痂皮の深い限界を明らかにします。
  5. 深部真皮/下にある筋膜内の同じ平面に留まりながら、メスの刃を使用して痂腔切開術を続けます。真皮の出血は、組織の生存能力の兆候と考えられています。
    1. プロセス中に細動脈を切断する場合は、バイポーラ凝固鉗子を使用して最小限の焼灼を行います( 材料の表を参照)。注意:作成された創傷床の広範な焼灼は、治癒の遅延につながる可能性があるため、厳密に避ける必要があります。
  6. 最初の乾燥グアゼを創傷床に5分間置いて、局所止血を促進してから、決定的なドレッシングを装着します。
  7. 以前と同様に傷口を包帯し(ステップ4.7)、空洞を埋めるためにいくつかの乾燥ガーゼを追加します。チンキ剤ベンゾインスプレー、粘着性透明ドレッシング、粘着性ラップ、管状ストッキネットなど、前述のものと同じ層を適用します。
  8. オピオイド経皮パッチを変更し、カプロフェン(2-4 mg / kg、IM)を注射することにより、鎮痛を提供します。.

6. フォローアップ創傷被覆材

注:その後の包帯は、実験的な治療デザインと動物の耐性に応じて、2〜7日ごとに行われます。創傷被覆材は、乾燥した環境での再上皮化を可能にし、動物の耐性を改善するために、21日後に停止することができます。あるいは、治療群が湿った環境または湿った環境を必要とする場合、ドレッシングは研究が終了するまで延長することができます。追跡期間は、急性治癒過程と長期治癒過程の両方を研究するために、最大10週間延長されました。

  1. 動物に短時間麻酔をかけ、ノーズコーン(イソフルラン2-5 L / min)で仰臥位に置きます。
  2. 以前の包帯を取り外し、滅菌0.9%生理食塩水と滅菌ガーゼを使用して創傷を洗浄します。
  3. 該当する場合は、実験的治療を適用します。
  4. 同様に、研究で必要に応じて、この手順中に後続の生検を行います。その後、動物はカルプロフェン(2-4 mg / kg、IM、24時間効果)などの鎮痛剤を投与する必要があります。
  5. 対照創を含むすべての創傷部位を、石油含浸または同等のガーゼ、乾燥ガーゼ、不織布ガーゼ、および接着剤の透明なドレッシングで覆います。.

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図2A、B は、ユカタンのミニブタの背部に複数回の火傷を負わせた結果を示しています。創傷(I)および(VII)は対照創傷(37°C)である。第2度創傷(II;IIIおよびVIII)は、激しい発赤と水疱を伴います。対照的に、第3度創傷(IV;V;およびVI)は青白く、触診に誘起されます。創傷VIIIは第2度と第3度の中間に見えることに注意してください:進行中の研究の目的のために、接触時間を65度で45秒に増やしました。 図 2C は、術後 3 日目の痂腔切開後の創傷の様相を示しています。第 2 度創傷に対して水疱摘出術を行い、硬化した焼傷組織の「一括」切除を第 3 度創傷に対して行い、二次治癒のための生存可能な創傷床を作成しました。出血が自然に止まらなかった場合、真皮神経叢の最小限の焼灼が行われました。 図2D〜F は、その後の時点(それぞれ第2週、第3週、第7週)における創傷の様相を示している。

組織学的結果を 図3 に示します(H&E、5.5倍および20倍)。対照皮膚(図3A、B)は、皮膚組織の残りの部分に付着した角質層(青い矢印)を含む、無傷の表皮(青いブラケット)を示しています。真皮は均質な淡いピンク色の好酸球増加症(コラーゲンと弾性繊維 - 赤いアスタリスク)を示します。第 2 度の熱傷 (図 3D、E) は、対照群 (水疱に対応する切断面) と比較して角質層の喪失を示しています。表在性真皮は、より強い好酸球増加症と真皮構造内の亀裂/骨折を示しています(青い矢印)。深部血管は保存されています(赤い矢印)。第3度の火傷(図3G、H)は、重度の皮膚骨折(青い矢印)が真皮深部に達する限り、真皮の好酸球増加症の増加を伴う広範な損傷を示しています(脂肪細胞空洞、緑色のアスタリスク)。最後に、トリクローム染色(図3C、F、I)により、結合組織のより良い評価が可能になります。熱変性コラーゲンの染色性の違いを利用して、燃焼の深さを示します。 図 3C は、表皮層が上部にある対照創傷生検の無傷の真皮の青色の特徴をはっきりと示しています。これは、上皮の喪失が真皮上層のコラーゲン変性を伴う第2度熱傷 (図3F) とは対照的です(白いアスタリスク)。最後に、第3度創傷 (図3I) は、真皮層の広範な赤色染色(黄色の矢印)を伴う表皮層の喪失を示しており、皮膚のこの層における完全なコラーゲン変性を示しています。

火傷モデル実験図。熱損傷誘発を制御するための加熱真鍮ブロック。
図1:手術室のポジショニング、燃焼装置のセットアップ、および研究デザイン。 動物は麻酔をかけられ、挿管され、換気され、仰臥位で配置されます。真鍮ブロックは、アルミビーズ+/-水で満たされた予熱容器に入れられます。温度計は真鍮ブロックの中央に配置されており、コア温度の監視が可能です。目標温度は、研究デザインに従って目標燃焼深度によって異なります。部分的な厚さの火傷を引き起こすには、圧力を加えずに65°Cで30秒の接触をお勧めします。3度の火傷の場合、圧力を追加せずに93°Cで30秒の接触が推奨されます。2度と3度の火傷は、皮膚の厚さの違いによるバイアスを避けるためにランダム化する必要があります。事前に入れ墨された傷の位置により、フォローアップ中にランダム化された各創傷を簡単に監視できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

創傷治癒進行チャート、経時的なさまざまな肌の色に対する円形皮膚生検の図。
図2:ユカタンのミニブタにおける無作為化された多深度熱傷後の創傷の側面の代表的な結果 (A)入れ墨の手順は、8つの創傷スポットすべての位置に配置することによって行われます。各場所には、監視を容易にするために番号が付けられています。(B)火傷発生後の傷の様相。創傷IおよびVIIは対照であり、創傷II、III、およびVIIIは部分的な厚さの創傷である。創傷IV、V、VIは第3度の創傷です。(C)POD3の第3度創傷の縦断術後の創傷の様相。また、部分的な厚さの創傷に対して水疱摘出術も行われた。(D)第3度創傷(IIおよびV)のきれいな創傷床を示すPOD14の創傷治癒の側面、および部分的な厚さの創傷(III、IV、VI、VII、VIII)の皮膚付属器からの再上皮化島。(E)第3度創傷床の拘縮と第2度創傷のさらなる再上皮化を示すPOD21の創傷治癒過程の側面。(F) POD49 の創傷の様相は、第 3 度創傷の進行した創傷拘縮を示し、重要な炎症後色素沈着を伴う部分的厚さ創傷の亜全上皮化を示しています。表示された傷は生検部位の傷跡を示す可能性があることに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

熱傷創傷治癒の組織学:対照、2度、3度の熱傷。染色された組織サンプル、分析。
図3:組織学的結果。創傷の組織学的側面の代表的な結果[光学顕微鏡検査10倍(A、C、D、F、G、I)および20倍(B、E、H);ヘマトキシリンおよびエオシン(A,B,D,E,G,H);マッソンのトリクローム(C,F,I)]。対照皮膚(A、B)は、皮膚組織の他の部分に付着した角質層(黒矢印)を含む無傷の表皮(黒色ブラケット)を示しています。真皮は均質な淡いピンク色の好酸球増加症(コラーゲンと弾性繊維 - 赤いアスタリスク)を示します。トリクローム染色(C)は、表皮層、結合組織、真皮コラーゲン繊維の正常な様相を明らかにします。第 2 度熱傷 (D、E) は、対照群 (開裂面、水疱摘出術中に除去) と比較して角質層の喪失を明らかにします。表在性真皮は、より強い好酸球増加症と真皮構造内の亀裂/骨折を示しています(青い矢印)。深部血管は保存されています(赤い矢印)。トリクローム(F)は、上皮の喪失を示し、真皮上層のコラーゲン変性を伴います(黄色の矢印)。第3度熱傷(E、F)は、重度の皮膚骨折(青矢印)が真皮深部から皮下組織まで到達し(脂肪細胞空洞、緑色のアスタリスク)、およびトリクロームによる真皮層の広範な赤色染色(I、黄色の矢印)が、真皮の好酸球増加の増加を伴う広範な損傷を示し、完全なコラーゲン変性を示しています。スケールバー:A、D、G、500μm;B、E、H、100 μm;C,F,I, 200 μm. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

静的平衡;温度計の浸透;図、セットアップ、結果。熱膨張実験
図4:火傷創の作成に使用された真鍮ブロックのエンジニアリング図面。 (A)ブロックの構築に使用された真鍮ブロックの寸法を示す図。直径40mmは、20-30kgのユカタンミニブタに8つの傷を設計することを可能にしながら、最適なサイズの傷を可能にします。(B)真鍮ブロックの最終的な側面を示す図で、中央のトンネルがあり、温度計がブロックのコア温度を測定できます。(C)水銀温度計によって表示されるように、65°Cに加熱された真鍮ブロックを強調した画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

火傷後の創傷治癒は、最大で数か月かかる可能性のある長いプロセスであり、さまざまな治療オプションと患者のケアに関する考慮事項があります2,13。それを研究するためには、信頼性と再現性のあるモデルが必要です。主にげっ歯類29,45,46とブタ29,47を含むいくつかの動物モデルが記載されています。ブタモデルは、ヒトの皮膚構造34,48に類似しているため、より関連性が高い。成体ブタのサイズは、同じ動物に対して複数の創傷を行うことができることを意味し、統計的有意性を増大させ、実験的治療とその対照との間の個人間変動を排除します7。必ずしも年齢ではなく、体重で被験者を選択することをお勧めします。現行モデルでは、全身表面の10%未満に抑えながら、最大8箇所の傷を施術することができます。これにより、血行動態の影響や管理可能な痛みから遠ざかることができます。

重要なポイントは品種に関連しています。既存の豚のプロトコルのほとんどはヨークシャー豚29,31,47,48を使用していますが、いくつかの理由からユカタンミニピッグモデルを開発しました。まず、このミニブタの品種は、追跡期間36,49にわたってほとんど成長を示していません。これにより、成長に関連する創傷サイズのばらつきを最小限に抑えることができ、したがって、個人内比較が向上します。また、ヨークシャー豚に比べて体重変動が少ないため、麻酔薬の最適化と投与も容易になります。第二に、メラニンの量が多いことは、火傷や治癒に対する色素沈着性皮膚反応の研究に関連し、ヒトのフォトタイプ3〜6 35,50,51へのより良い適用性を示唆しています。ライスらは、化学火傷の治療薬として皮膚剥離後のユカタン豚と家畜の白豚との間に大きな治癒差があることを発見した52。さらに、臨床的に高いフォトタイプは、肥厚性瘢痕およびケロイド53,54,55などの病理学的瘢痕化の割合が高いことを示しましたが、レッドデュロック種は肥大型性瘢痕評価34,56に対して最も正確であるようです。さらに、色素沈着治癒表皮は、外部縁および付属器からの再上皮化プロセスを測定することも容易にします。最後に、このモデルは炎症後色素沈着の明確な兆候を示しており(図2D-F)、これも今後の研究で取り組むべき興味深いものです。他の著者は、このミニブタモデルを使用して薬理学的皮膚毒性と光毒性を研究し、ヒトの転帰に対する安全性と有効性についてそれぞれ89%と100%の印象的な予測値を発見しました57。これらの特徴がユカタンのミニブタモデルと創傷治癒の研究との関連性を強調している場合、火傷の特定の分野の文献は貧弱なままです。したがって、熱傷の治癒とさまざまな診断および治療介入の研究を可能にするために、再現可能なモデルを記述する必要があると思われました。

以前のプロトコルは、豚モデルの火傷を研究するために説明されています。Branskiら58 は、2008年に、200°Cに加熱されたアルミニウム棒を使用した全層熱接触燃焼のモデルを発表しました。 彼らの技術は、以前のいくつかの出版物に触発され、アルミニウムバーに取り付けられた50mLの注射器を使用して制御された圧力を実装しました。圧力は火傷の程度に影響を与えるため、この機能は関連性があるように見えますが、デバイスの精度には精度が欠ける可能性があります(オペレーターによるシリンジ自体の圧力は考慮されず、圧力レベルはピストン位置の変化に基づく)。最近では、Kim et al.59 と Seswandhana et al.60 が、電気加熱装置と温度制御を備えたカスタム装置を使用して、再現可能な火傷を実証しました。彼らの両方のデバイスには、下向きの力を測定する圧力監視が含まれていました。キム氏が説明したように、フィードバックループにより、接触中にコア温度と表面温度の両方を維持することができます。どちらの著者も、燃焼深度と圧力との間に良好な相関関係を示し、圧力制御の重要性を強調しました。真鍮ブロックには、その重量以外の補助的な圧力を加えないことを選択し、オペレーターの動作は単に安定しています。その目的は、モデルを単純化し、変数の数を最小限に抑えることでした。Fanら61 は、グリセリンを充填した改質はんだごてを使用した同様のモデルについて説明しましたが、これには補助的な界面熱抵抗が生じるという欠点があります。ブロックは真鍮製で、比熱容量(c)は395 W / m * K、熱伝導率(k)は134 J / kg * K1です。鉄(c = 490 W / m * K、k = 66 J / kg * K)やアルミニウム(c = 949 W / m * K、k = 240 J / kg * K)などの他の一般的な金属と比較して、これらの特性により、目的の温度により早く到達でき、最大熱を皮膚にすばやく伝達して火傷を引き起こす可能性があります。再現性を高めるために、焼成に使用した真鍮ブロックの特徴を 図4 に示します。 図4A は、真鍮ブロックのエンジニアリング図面を、すべての寸法(mm)で示しています。図のように、ブロックの外径は40mm×高さ151mmです。点線は、温度計を挿入するためのブロックを通る同軸穴を示しており、穴の直径は9mm、深さは128mmです。 図4B、C は、コア温度測定のために真鍮ブロックに挿入された温度計を示しています。

現在のモデルの限界の1つは、リブレリーフによる非燃焼ゾーンの持続性であり、これは主に部分的な厚さの燃焼で問題となります(図2)。これは、ケラチノサイト遊走の中心的な供給源を提供することにより、再上皮化プロセスに影響を与える可能性があります。ただし、硬い材料を使用して火傷を負わせながら、この問題を回避するのは難しいようです。さらに、未焼け領域の総表面はわずかであり、真鍮ブロックの直径4cmは、パンチ生検が繰り返されているにもかかわらず、長時間のフォローアップで研究を行うのに十分な創傷表面を提供します。

もう 1 つの主要な変数は、全層熱傷でのエスカロトミーのタイミングであり、このプロトコルでは POD3 で計画されています。この遅延した時点は、遅延した組織損傷を特徴とするシャドーゾーンを対象とするために選択されました。これは、臨床診療では火傷の転換とも呼ばれます62,63。目的は、損傷した組織をすべて除去することでしたが、これはこの時点での痂皮の凝集性によって促進されました。このタイミングは、抗炎症剤64、65、66、幹細胞療法18、67、68、寒冷療法69、または抗凝固療法65、70、71などの「シャドーゾーン」の遅延損傷を最大3日間減少させることを目的とした早期介入を研究することも可能にします。さらに、ほとんどの著者が2〜4週間の短い追跡期間を記述している29,47が、ここでは8〜10週間の延長追跡期間が採用され、急性期だけでなく二次治癒ステップも研究することを可能にした。

この長期にわたるフォローアップでは、術後ケアと創傷被覆材が重要であり、動物に適切なケアを提供できるようにチームを訓練する必要があります。ユカタン種は乾燥肌を呈することが多く、不快感の兆候であり、その後の傷の自傷行為につながる可能性のある掻痒を減らすために、週に数回湿潤ローションを投与する必要があります。この原稿で提示されている多層ドレッシングは、私たちのセンター7,72内の同様のモデルでの数年の経験の結果です。動物たちは不快感や痛みの兆候を示さない。この研究では感染は見つかりませんでしたが、これらの潜在的な合併症を早期に検出するためには、最初の2週間は毎日モニタリングする必要があります。これは、現代の研究において最も重要な安全性と動物福祉のコンプライアンスを強調しています。我々は、空気への曝露と乾燥性の再上皮化を可能にするために、3週間後にドレッシングを中止することを選択しました73,74。しかし、熱傷創傷治癒を増強するためのナノ粒子ベースの20および架橋ゲル35の現代では、継続的な閉塞性包帯をこのプロトコルに実装することができる。

最後に、このモデルの大きな特徴の 1 つは、同じ被験者でさまざまな創傷の深さを研究できることです。組織学の結果は、この点でのプロトコルの関連性を裏付けています。この機能は、熱傷の深さ、初期段階での悪化、治癒過程の改善を測定するのに役立つ新技術などの診断目的だけでなく、新しい治療法や、第1度、第2度、第3度の熱傷におけるそれらの異なる作用を評価するためにも興味深いものです。治癒過程は初期の火傷の深さによって大きく異なるため、このモデルでは、個人間のばらつきを避けながら、潜在的な治療法の異なる効果を測定することができる。しかし、1つの制限は、同じ動物にいくつかの熱傷タイプを混合すると、メタロプロテイナーゼ、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインなどの全身バイオマーカーを評価することが不可能になることである。これらは、創傷の深さおよび総熱傷表面積によって異なることが知られている75。

結論として、現在のユカタンミニピッグの火傷モデルは、火傷後の創傷治癒を研究するための信頼性の高いプラットフォームを提供する能力で際立っています。このブタモデルは、ブタとヒトの皮膚との間の生理学的近接性を活用して、制御された個体内比較や、1匹の動物に複数の種類の創傷に対応する能力など、明確な利点を提供します。再現性のある火傷誘発技術、介入のタイミング、および追跡期間の延長は、このモデルの臨床的関連性と信頼性を高める重要なポイントです。ユカタンの皮膚は、肥厚性瘢痕化や炎症後色素沈着など、色素沈着した皮膚に特有の現象を研究することができます。臨床医を「シャドーゾーン」熱傷変換に向けることを目的とした新しい診断ツールや、ナノ粒子や3Dプリントされた皮膚移植片などの最新の治療法は、急性、遅延、および長期の熱傷相を研究するための貴重な前臨床モデルの必要性を示す例です。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、Shriners Children's Research GrantからS.N.T. Y.B.への寛大な資金提供によって支援されました。また、米国国立衛生研究所(K99/R00 HL1431149;R01HL157803;R01DK134590、R24OD034189)、アメリカ心臓協会(18CDA34110049)、ハーバード大学医学部エレノアおよびマイルズショアフェローシップ、ポルスキー家族財団、およびMGH外科および/またはMGH研究執行委員会を代表してクラフリン特別奨学生賞。さらに、マサチューセッツ総合病院研究実行委員会がR.J.にFund for Medical Discovery(FMD)賞を授与するために提供した支援に感謝します。最後に、Fondation des Gueules Cassées(フランス)、レンヌ大学(フランス)、CHU de Rennes(フランス)、フランス形成外科学会からのY.B.への支援が高く評価されています。著者らは、Knight Surgery Research Laboratoryの貢献と動物の麻酔の支援に感謝しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Adson 組織鉗子Jarit130-234
アルミニウムビーズラボアーマー42370-002ラボアーマービーズ 
ブプレノルフィン塩酸塩Ranbaxy PharmaceuticalsNDC:12469-0757-01ブプレネックス 注射用
カルプロフェンファイザーNADA 141-199リマジル 50mg/ml 注射用 
円筒形真鍮ブロック手作りN/A原稿に含まれるエンジニアリング図面
ダーモグラフィックペンマッケソン外科用皮膚マーカー 滅菌
使い捨て #15 外科用メスメドラインMDS15315メスの刃
フェンタニルパッチマイランNDC:60505-7082フェンタニル経皮吸収系
イソフルラン PiramalNDC:66794-013-25イソフルラン、USP
McPherson バイポーラ凝固鉗子BovieA842再利用可能、オートクレーブ可能な
Miltexアソート生検パンチ(3,4および5 mm)Integra33-38生検パンチ-研究に適応するサイズ
不織布ガーゼStarryshineGZNW222 x 2インチ 不織布4層医療用ガーゼパッド
ポビドン-ヨウ素ベタジンNDC:0034-9200-88外科用スクラブ 7.5% 
滅菌等張性塩化ナトリウム溶液0.9%AqualiteシステムRL-2095滅菌生理食塩水
タトゥーインクスポールディング&;ロジャースブラック - 2オンス - #9053
タトゥーマーカースポールディング&ロジャーススペシャルエレクトリックタトゥーマーカー
タトゥーニードルスポールディング&ロジャース1310251タトゥー5点針
テガダーム透明フィルムドレッシング3M1.628大きな透明接着剤ドレッシング
温度制御ホットプレートコールパーマー03407-11StableTempホットプレートスターラー
温度計アメリカンサイエンティフィックU14295チューブ水銀温度計
チレタミンとゾラゼパム塩酸塩ZoetisNDC:54771-9050
ベンゾインスプレースミス&のテラゾールチンキ剤甥407000接着剤層スプレー
トリプル抗生物質軟膏FougeraNDC 0168-0012-31抗生物質軟膏
管状ストッキネットメドラインNONNET02キュラドメドラインラテックスフリー弾性ネット
保温ブランケット3Mベアハガー750保温ユニット
Xeroform閉塞性ガーゼストリップCovidien8884433301Xeroformワセリン創傷被覆材
XylazineVetoneNDC:13985-704-10AnaSed LA
Yucatàn ミニブタ (雌、30 kg)Sinclair Bio ResourcesN/AFull pigmentation 
トリプル

参考文献

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