生体内顕微鏡所見の翻訳は、組織への深さの浸透が浅いという課題があります。ここでは、生体内顕微鏡と臨床的に適用可能な画像モダリティ(CT、MRIなど)の同時登録を可能にし、直接的な空間相関を実現し、生体内顕微鏡所見の臨床翻訳を効率化する可能性のある背側窓室マウスモデルについて説明します。
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方法論記事
トランスレーショナルがん研究における生体内顕微鏡検査と磁気共鳴画像法の併用のための背側Skinfold Window Chamber腫瘍マウスモデル
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
顕微鏡法や光干渉断層撮影法などの前臨床生体内イメージングは、がん研究において、腫瘍の微小環境とその治療に対する反応を視覚化するための貴重なツールであることが証明されています。これらのイメージングモダリティはミクロンスケールの解像度を持っていますが、組織への浸透深さが浅いため、クリニックでの使用は限られています。CT、MRI、PET などのより臨床的に適用可能な画像モダリティは、浸透深度がはるかに大きくなりますが、空間分解能 (mm スケール) は比較的低くなります。
前臨床の生体内イメージング所見を臨床に変換するには、この ミクロからマクロへの 解像度のギャップを埋める新しい方法を開発する必要があります。ここでは、前臨床の生体内 イメージングと 臨床的に適用可能な(CTおよびMR)イメージングを同じ動物で可能にするように設計された背側スキンフォールドウィンドウチャンバー腫瘍マウスモデルと、これら2つの異なる視覚化方法をリンクする画像解析プラットフォームについて説明します。重要なことに、説明されたウィンドウチャンバーアプローチにより、ウィンドウチャンバー上の基準マーカーを使用して、さまざまなイメージングモダリティを3Dで共登録し、直接的な空間的一致を実現できます。このモデルは、既存の臨床イメージング法の検証だけでなく、「グラウンドトゥルース」高解像度の生体内所見との直接的な相関による新しい画像法の開発にも使用できます。
最後に、さまざまな治療(化学療法、放射線療法、光線力学療法)に対する腫瘍反応は、前臨床および臨床的に適用可能な画像診断法を使用して、この方法論で縦断的に監視できます。したがって、ここで説明する背側スキンフォールドウィンドウチャンバー腫瘍マウスモデルおよびイメージングプラットフォームは、例えば、前臨床の生体内顕微鏡所見をCTやMRIなどのより臨床的に適用可能なイメージングモダリティに変換するなど、さまざまながん研究に使用できます。
概要
腫瘍微小血管系は、腫瘍微小環境の重要な構成要素であり、治療の標的および治療反応の決定要因となる可能性があります。前臨床の場では、微小血管系は通常、同所性または異所性の窓室動物モデル1,2で生体内顕微鏡を用いて研究されます。これは、イメージングが生きた組織で行われ、腫瘍を数週間または数か月にわたって縦断的に監視できるため、組織学的研究に比べていくつかの利点があります2,3。これらの研究では、生体内顕微鏡の高解像度イメージング機能を活用して、腫瘍4,5への治療薬の送達、治療抵抗性の原因6、および抗血管新生治療7,8や放射線療法2,9などの治療に対する微小血管の反応を研究することができます。
生体内顕微鏡検査は、前臨床がん研究において明らかに重要な役割を果....
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プロトコル
すべての動物処置は、カナダ動物管理評議会が定めた実験動物の手引きに従って行われました。実験は、カナダのトロントにあるUniversity Health Network Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコルに従って行われました。
1.腫瘍接種のランドマーク
注:「ランドマーク」とは、DSFCの配置を最適化するために腫瘍細胞を注入する場所を示すために、マウスの皮膚にマーキングするプロセスを指します。この画期的な手続きは、接種と同じ日または1日前に行う必要があります。免疫不全のNOD。この作業には、Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) メスマウスを使用しました。
- 導入には5%イソフルラン、維持には2%イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけます(酸素流量は0.5 L / minに設定)。オートクレーブ滅菌された手術用マットで包まれた加熱パッドにマウスを置いて、体温を維持します。
- 腫瘍細胞の接種のためにマウスを髭剃り、続いて医療用脱毛クリームを塗布して準備します。30〜60秒後に、濡れた滅菌済みペーパータオルを使用して脱毛クリームを完全に取り除きます。乾燥を防ぐために獣医用アイローションを塗布してください。
- アルコール綿棒で皮....
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結果
スペックル分散光干渉断層撮影法(svOCT)を実施して、広い視野(FOV)3D微小血管画像(6 x 6 mm、横方向2 x 深さ1 mm)を取得しました。これらの画像を得るために、直交干渉計に基づく前述の掃引源OCTシステムを使用した23。OCT画像は、横方向に隣接する2つの3 x 6 mm2 FOVスキャンをつなぎ合わせて取得しました。各B-スキャンは400回のA-スキャンからなり、前回の研究24で述べたように、正確なスペックル分散処理を可能にするために、位置ごとに24回(25ミリ秒間隔)に実行された。
MRIデータセットを微小血管svOCTデータセットに共登録するために、いくつかのステップを実行しました。最初のステップはステップ 5.12 で実行し、 図 4 に示します。この手順では、深さ方向 ( 図 4 の z 軸) に.......
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ディスカッション
この研究では、同じ動物で生体内顕微鏡検査と臨床的に適用可能な画像検査(CT、MRI、PET)の両方を行うワークフローを開発しました。これは、生体内顕微鏡検査とMRIなどの臨床画像診断法との直接的な相関関係により、前臨床顕微鏡検査所見を臨床に変換することを目的として行われました。従来のDSFCの設計は金属2,3でできていますが、生体適合性プラスチック樹脂で作られた3Dプリントされたウィンドウチャンバーを使用することで、DSFCをMR対応に適合させました。モダリティの登録は、臨床画像モダリティの基準マーカーを使用し、DSFC上の基準マーカーの位置を広視野顕微鏡画像および高解像度の生体内顕微鏡画像で確認できる血管ランドマークと一致させる広視野顕微鏡画像を取得することによって達成されました。モダリティを共登録するためのMATLABコードが開発され、補足ファイル2に含まれています。
DSFCは前臨床研究
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開示事項
著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
Carla Calçada博士(プリンセス・マーガレットがんセンター博士研究員)とティモシー・サミュエル博士(プリンセス・マーガレットがんセンター博士課程学生)に対し、腫瘍細胞の培養と接種プロトコルの開発にご協力いただき、感謝いたします。Kathleen Ma博士、Anna Pietraszek博士、Alyssa Goldstein博士(動物研究センター、プリンセスマーガレットがんセンター)は、手術プロトコルの開発を支援しました。ジェイコブ・ブロスケ氏(プリンセス・マーガレットがんセンターの医療工学技術者)とウェイン・ケラー氏(ジャベリン・テクノロジーズ・トリメック・グループ・カンパニーのハードウェア・クライアント・エグゼクティブ)が窓ガラス室を3Dプリントしました。James Jonkman氏(Advanced Optical Microscopy Facility, University Health Network)は、明視野および蛍光顕微鏡の画像取得に関する貴重なガイダンスを提供してくれました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 細胞培養材料 | |||
| BxPC-3 ヒト膵臓がん細胞 | ATCC (American Type Culture Collection) | CRL-1687 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 07-202-350 | |
| カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まないダルベッコリン緩衝生理食塩水、500 mL | Gibco | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum(カナダ)、500 mL | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin 100x (液体、安定化、滅菌ろ過、細胞培養試験済み) | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| RPMI Medium 1640 (1x)、液体、L-グルタミン配合、500 mL | Gibco | ||
| TrypLE Express Enzyme、500 mL | Gibco | 12605028 | |
| Window Chamber 材料 | |||
| 12 mm ガラス カバースリップ | ハーバード デバイス | CS-12R No. 1.5 | |
| Connex 500 3Dプリンター | Stratasys | N/A | |
| 生体適合性クリア MED610樹脂 | Stratasys | RGD810 | |
| ロックタイト AA 3105 UV 硬化型接着剤 | ロックタイト | LCT1214249 | |
| ウィンドウ チャンバー バック フレーム | Trimech Inc | N/A | |
| ウィンドウ チャンバー フィデューシャル マーカー | Trimech Inc | N/A | |
| ウィンドウ チャンバー フロント フレーム | Trimech Inc | N/A | |
| ウィンドウ チャンバー サポート クリップ | Trimech Inc | N/A | |
| 接種および手術材料 | |||
| BD SafetyGlideインスリンシリンジ、永久に取り付けられた針付き、0.5 mL、29 G x 1/2 " | BD | CABD305932 | |
| Betadine溶液 | Betadine | AP-B002C2R98U | |
| Cidex OPA 14 Day Solution 3.8 L | ASP | JOH20394 | |
| Disposable Surgical Underpads 23 inch x 24 inch | ケンドール | 7134 | |
| アイ潤滑剤 | Optixcare | 50-218-8442 | |
| 脱毛クリームNair | | ||
| ハルステッド止血鉗子 | アルメディック | 7742-A12-150 | |
| 加熱パッド | サンビーム | ||
| アイリス はさみ | アルメディック | 7601-A8-690 | |
| イソフルラン | シグマ | 792632 | |
| メタカム | ベーリンガーインゲルハイムアニマルヘルスUSAインク | NDC 0010-6015-03 | |
| NOD。CG-RAG1TM1ママ Il2rgtm1Wjl/SzJマウス | ジャクソン研究所 | 7799 | |
| ピーナッツクリッパー&トリマー | ウォール | 8655-200 | |
| SOFSILK 非吸収性外科用縫合糸 #5-0 3/8" テーパー ポイント針 (17 mm) (ワックスコーティング、編組ブラック シルク、滅菌) | シンチュール | VS880 | |
| スプリンター鉗子 | アルメディック | 7725-A10-634 | |
| MR Imaging | |||
| 3Dプリントされたウィンドウチャンバー固定装置。 | カスタム3Dプリント、詳細については図3を参照してください。 | ||
| 対流加熱装置 | 3M ベアハガー | 70200791401 | |
| 薬剤注入システム | ハーバード大学製装置 | PY2 70-2131 | PHD 22/2200 MRI対応シリンジポンプ |
| Gadovist 1.0 | Bayer | 2241089 | |
| 呼吸モニタリングシステム | SAII | Model 1030 | MR対応の小動物用モニタリング&ゲーティングシステム。 |
| 尾静脈カテーテル(27G 0.5インチ) | テルモメディカルコーポレーション | 15253 | |
| Optical Imaging | |||
| 3Dプリントイメージングステージ | カスタム3Dプリント、詳細については補足図3を参照してください。 | ||
| 12 V 7 W フレキシブル ポリイミド ヒーター プレート 薄い接着剤 PI 加熱フィルム 25 mm x 50 mm | BANRIA | B09X16XCVS | マウスの体温調節に使用される発熱体。 |
| DC電源 | BK Precission | 1761 | 発熱体に電力を供給するために使用されます。 |
| ライカ MZ FLIII | ライカマイクロシステム | 15209 | |
| svOCT イメージングシステム | 自社製のイメージングシステムです。詳細は参考文献23に記載されています。 | ||
| Software | |||
| MATLAB Software | MathWorks | R2020A |
参考文献
- Fukumura, D., Duda, D. G., Munn, L. L., Jain, R. K. Tumor microvasculature and microenvironment: Novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17 (3), 206-225 (2010).
- Demidov, V., et al.
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再版と許可
