方法論記事

慢性肺同種移植拒絶反応のマウスモデルにおけるコラーゲン沈着の半定量的組織病理学的評価のためのピクロシリウス赤色染色

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DOI：

10.3791/66395

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2025年3月21日

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1Department of Thoracic Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Plastic and Hand Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Department of Thoracic Surgery, Kyoto University Hospital, 4Department of Otolaryngology, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

Picrosirius Red染色は、マウスの肺線維化リモデリングにおけるコラーゲン沈着を空間的に分解して客観的に評価するための半定量的な方法です。ピクロシリウスレッド染色では、コラーゲンの総沈着量を評価するだけでなく、さまざまな厚さのコラーゲン繊維を区別することができます。

要約

線維症は、肺移植後の慢性拒絶反応の病態生理学的特徴であり、レシピエントの長期生存に対する最大のハードルです。慢性拒絶反応の研究には、いくつかのマウス肺移植モデルが利用可能です。ただし、移植片の線維性変化に関して不均一な結果を示し、線維化の組織学的範囲は主に定性的に報告されています。したがって、統計解析を可能にする空間的に解決されたアプローチは、これらのモデルにおける線維症の評価に役立ちます。この研究では、マウスの肺同種移植片におけるコラーゲン組織の半定量的評価のためのピクロシリウスレッド染色を提示し、それを標準的なヘマトキシリンおよびエオシン、マッソントリクローム、およびヘロビチ染色と比較します。染色は、マイナーおよびメジャー組織適合遺伝子複合体(MHC)のミスマッチに基づいて、2つの異なるマウス移植モデルの切片で実施されました。この方法は、肺切片全体のコラーゲン組織の半定量的分析のために確立されました。したがって、線維性肺疾患のマウス実験モデルのツールとして役立つことができます。

概要

肺移植は、末期の肺疾患に苦しむ患者にとって明確な治療選択肢です。しかし、長期的な生存は慢性的な拒絶反応によって妨げられ、術後最初の 5 年以内にレシピエントの 50% が影響を受けます1。小さな気道と肺実質の線維化リモデリングは、慢性肺同種移植片拒絶反応における肺機能の進行性の喪失の根底にある組織学的特徴です2。実験的には、慢性肺同種移植拒絶反応は、MHC不整合マウス系統間のマウス同所性肺移植でモデル化できます。慢性拒絶反応の表現型を達成するために、さまざまな菌株の組み合わせが提案されています3。その中でも、ミスマッチなC57BL/10ドナーとC57BL/6レシピエントのマイナーMHCの移植組み合わせが頻繁に使用されています4。あるいは、BALB/cドナー肺をC57BL/6レシピエントに移植し、毎日免疫抑制治療を受けることもできます5。これらのモデルは、組織学的に異なる程度の線維性変化をもたらします6。これらの変化は、多くの場合、標準的なヘマトキシリンとエオシン、およびマッソンのトリクローム染色を使用して定性的に報告されます。

ヘマトキシリンとエオシンによる標準的な組織学的染色では、核が青色に染色され、細胞質とコラーゲン繊維が赤く見えるため、標本の概要を把握できます。マッソントリクローム染色では、核は黒く染色され、コラーゲン繊維は緑から青に染色され、細胞質、フィブリン、筋肉などの背景は赤くなります。マッソンのトリクローム染色は過小評価された値につながる可能性があるため、ピクロシリウスレッド染色を使用することは有益であると考えられています7。Picrosirius Redは、長いカチオン性コラーゲン繊維と結合し、コントラストに富んだ赤色染色を提供する線状アニオン性色素です。さらに、Picrosirius Red染色は、交差偏光8下でのコラーゲン繊維の自然な複屈折性を高める。これにより、コラーゲン繊維の太さや充填量を評価することができます。偏光フィルターを使用すると、背景が暗くなり、堆積したコラーゲンの厚さを区別することが可能になります。太いコラーゲン繊維は赤く見えますが、細いコラーゲン繊維は偏光すると緑色に現れます。複屈折とコラーゲンサブタイプとの直接的な関連は文献で頻繁に説明されており、赤の複屈折はコラーゲンIに、緑の複屈折はコラーゲンIIIに割り当てられています9。

このプロトコルでは、マウス肺同種移植片の線維症を評価するためのPicrosirius Red染色の使用について説明します。従来の組織学的染色に加えて、慢性拒絶反応のマウスモデルにおける線維性変化の半定量的評価を可能にし、1回の染色で厚いコラーゲン繊維と細いコラーゲン繊維を区別する手段を提供し、費用対効果が高く、実施が容易です。この方法は、肺実質の線維化リモデリングを特徴とする他のマウス実験モデルにも同様に適用できます。

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プロトコル

すべての動物プロトコルは、人道的な動物研究のための3Rの倫理原則に準拠しており、地元の獣医倫理委員会(Veterinäramt Kanton Zürich, Switzerland, Study number 45/2014)によって承認されました。同様に、読者は実験動物で手順を実行する前に、関連機関から許可を得る必要があります。

1. サンプル取得

  1. 個々のニーズとそれぞれの倫理的承認に従って動物実験を実施します。1人の顕微外科医が、虚血の長期化時間を追加することなく、すべての手術を行います。
    注:代表的な結果の再現については、Charles River Laboratoriesから特定の病原体を含まない成体雄C57BL/6J、C57BL/10J、および体重27-30 gのBALB/cマウスを入手してください。アイソグラフトには、C57BL/6J動物をドナーとレシピエントの両方として使用します。マイナーミスマッチモデルでは、C57BL/10Jドナー肺をC57BL/6Jレシピエントに移植します。主要なミスマッチ モデルでは、BALB/c ドナー肺を C57BL/6J レシピエントに移植し、術後にシクロスポリン (10 mg/kg/日) とメチルプレドニゾロン (1.6 mg/kg/日) を毎日皮下注射します5.灌流には生理食塩水を使用し、8週間(56日)後に肺を回収します。
  2. 安楽死のためには、20Gカテーテルで動物を挿管し、2%〜3%イソフルランを補充したO2 で換気します。足の挟み込みに対する反応がないことにより、麻酔の十分な深さを確認します。
  3. 腹腔内軟骨切開術は、手術用ハサミで腹壁を切開し、胸骨の長さを切開して心臓を露出させることにより行います。下大静脈と左心房付属器を解剖学的位置で特定します。
  4. 素早く続けて、下大静脈と左心房付属器を手術用ハサミで切断し、注射器で肺動脈の根元から3〜5mLの0.9%NaClを動物に灌流して、肺循環からすべての血液を取り除きます。
    注:安楽死は、それぞれの倫理的承認に従って実施する必要があります。他の方法も同様に適用できます。肺循環からの血液を完全に除去することが推奨されますが、これは循環停止後の灌流によっても行うことができます。
  5. はさみを使用して灌流された肺を取り除きます。
  6. 保存のために、サンプルを4%ホルマリンでインキュベートします。ホルマリン溶液を気管支と肺血管系に直接注入します。サンプルをホルマリンに浸し、少なくとも6時間インキュベートします。
    注:ホルマリンによる肺の膨張については、同等の結果を得るために標準化された手順を適用する必要があります。.このような手順のプロトコルの例は、他の場所で公開されています10,11。
  7. 実験的なニーズに応じて臓器をトリミングします。横方向に肺を半分に切り、気管支樹のすべての部分をセクションに捕らえます。
  8. アルコール配列で脱水するためにサンプルを自動組織処理装置に移し、次のようにキシロールおよびパラフィンコーティングで透明化します:70%エタノール、70%エタノール、80%エタノール、96%エタノール、100%エタノール(各1時間)、100%エタノール、100%エタノール、キシロール(各2時間)、キシロール(1時間)、およびパラフィン3xで2時間。
  9. パラフィンを溶解し、サンプルを正しい向きでポリオキシメチレン包埋カセットに埋め込みます。切断面を下に向けてサンプルを埋め込むように注意してください。ロータリーミクロトームを使用して、5μmの切片を連続して切断します。スライドを37°Cで24時間乾燥させてから、さらに処理します。

2. パラフィンスライドの脱パラフィンと水和

  1. サンプルを100%キシロールに2回、それぞれ5分間インキュベートして、パラフィンを除去します。
    注意: キシロールは可燃性で健康に害を及ぼします。ヒュームフードの下でのみ使用してください。
  2. サンプルを100%エタノール、100%エタノール、95%エタノール、70%エタノール、および50%エタノールでそれぞれ2分間水和します。その後、蒸留水で2分間洗浄します。

3. Picrosirius Redによる染色

  1. スライドをMeyerのヘマラム溶液で8分間染色します。水道水でスライドを10分間洗います。
  2. スライドをPicrosirius Red溶液で1時間インキュベートします。Picrosirius Red溶液には、プレミックス染色溶液を使用するか、飽和ピクリン酸で希釈したDirect Red 80またはSirius Red F 3B(CI 35780)の0.1%を使用してください。
    注意: ピクリン酸は可燃性で爆発性が高いため、慎重に取り扱う必要があります。
    注:Picrosirius Red染色キットには、 材料表に記載されているように、さまざまなサプライヤーが入手可能です。価格や染色方法の違いに注意し、常にサプライヤーの指示に従ってください。Sirius Red F 3B(CI 35780)の特定のカラーインデックスを持つ染色キットのみを使用することをお勧めします。
  3. スライドを酢酸溶液(0.5%)に5x〜10x浸します。スライドを静かに振って、溶液を物理的に取り出します。
  4. スライドを95%エタノール、100%エタノール、100%エタノール、100%キシロール、および100%キシロールでそれぞれ5分間脱水します。
  5. 各サンプルに封入剤を1滴加えて埋め込み、カバースリップで覆います。スライドをドラフトの下で乾かします。

4. デジタル化と画像処理

  1. 適切なイメージングソフトウェアを搭載した光学顕微鏡で、画像が鮮明で鮮明になるまでサンプルの焦点を合わせます。偏光フィルターを追加し、背景が完全に暗くなるか黒くなるまで偏光の度合いを調整します。背景ができるだけ暗い場合、正しい偏光が達成されます。
    注:偏光フィルターを使用せずに、従来の透過光でピクロシリウスレッド染色を視覚化することも可能です。この目的のために、シリウスレッドを単独で使用するよりも感度が高いことが示されているため、ファストグリーンと一緒にシリウスレッドを使用することをお勧めします12,13。しかし、太いコラーゲン繊維と細いコラーゲン繊維を区別するためには、偏光顕微鏡が必要です。
  2. すべてのサンプルを20倍の倍率で完全にスキャンし、.tiffとしてエクスポートします。フィジーソフトウェアへの転送14.スライドは事前に適切にクリーニングし、露光時間と光源強度に関する標準化された設定を使用してください。
  3. サンプルを手動で囲み、ソフトウェアで Edit > Clear Outsideを使用して切り取ります。[ 解析] > [計測] をクリックして、総表面積を計測します。
    注:測定するコンパートメントの選択は、信頼性が高く比較可能な結果を作成するための重要なステップです。サンプル全体をデジタル化して選択することで、良好な断面が表示され、不均一な組織を全体として考慮します。ただし、胸膜や個々の気管支など、サンプル内の特定の領域に自分自身を閉じ込めることも可能です。比較するコンパートメントは常に標準化された方法で選択することに注意してください。サンプルが換気に大きなばらつきを示す場合、分析されたコンパートメント15から空域領域を除外することをお勧めします。
  4. 「 Image (画像)」>「Adjust > Color Threshold 」をクリックし、設定を調整するには「 Analyze (分析)」>「Analyze Particles」をクリックして、サンプルあたりの総コラーゲン含有量を測定しColor Threshold(カラーしきい値)をクリックします。サイズ = 1 - 無限大、クリア、集計を設定します。明るさ = 35 - 255。色相 = 2 - 130
    注:色のしきい値を合理的に設定することは、信頼性の高い結果を得るために重要です。
  5. 色相を赤 figure-protocol-1 太いコラーゲン繊維(色相2-30)、黄緑 figure-protocol-2 細いコラーゲン繊維(色相31-130)に調整して、太いコラーゲン繊維と細いコラーゲン繊維について繰り返します。結果は、染色されたピクセルの領域になります。
  6. マクロを自動処理用に構成するには 、「Plugins > Macros」>「Record and repeat」をクリックし、すべてのサンプルで繰り返します。
  7. 断面の表面積に標準化された最終値を受け取るには、すべてのパラメーターの染色されたピクセルの面積を、各サンプルのステップ4.3と4.5でそれぞれ測定した総表面積で割ります。

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結果

上記のプロトコルは、マウス肺組織中のコラーゲン沈着の客観的な半定量的評価を可能にします。線維性リモデリングは、肺移植後の慢性拒絶反応の病態生理学的特徴です。したがって、Picrosirius Red染色は、左側マウス同所性肺移植を用いた慢性肺同種移植拒絶反応モデルに適用されました。軽度の免疫抑制下でのBALB/cドナーからC57BL/6レシピエントへの主要なMHCミスマッチ肺移植は、ヒトの慢性肺同種移植片機能障害に匹敵する線維性変化をもたらします5。対照的に、C57BL/10ドナーからC57BL/6レシピエントへの軽度のMHCミスマッチ移植は、主にリンパ球性細気管支炎を引き起こします6。 図1 は、実験のセットアップを詳細に示しています。

図2は、2つのモデルの移植された左肺からの代表的な画像とC57BL/6Jアイソグラフトの概要を示しています。MassonのTrich...

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ディスカッション

ヘマトキシリンやエオシンなどの標準的な組織学的方法、およびマッソンのトリクローム染色は、空間的に分解された方法でマウス肺の線維性変化を検出するために広く使用されています16,19。しかし、これらの変化を定量化し、組織のコラーゲン組成を評価するためには、追加の方法が必要になることがよくあります。

Picrosirius Red染色は、コラーゲンを特定するために1964年に最初に記載されました:透過光顕微鏡下では、コラーゲンは赤く見え、筋肉と細胞質は黄色に現れます18。偏光フィルターを前方にスロットし、複屈折を利用することで、コラーゲン繊維の太さを区別することができました。繊維状色相とコラーゲン繊維の厚さとの相関関係は、それ以来繰り返し実証されており、線維性リモデリングにおける総コラーゲン含有量の評価およびコ...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

Birte Ohmは、フライブルク大学医学部のBerta-Ottenstein-Program for Clinician Scientistsの支援を受けています。シュテフェン・U・アイゼンハルトは、ドイツ研究財団(DFG)のハイゼンベルク教授であり、この研究を個人的な助成金で支援しました。さらに、技術支援を提供してくださったSheena Kreuzaler氏にも感謝します。図 1 は、Biorender.com の助けを借りて作成されました。イメージングは、フライブルク大学医学部(プロジェクト番号2023/A2-Fol、2021/B3-Fol)、DKTK、DFG(プロジェクト番号450392965)が一部資金提供しているLighthouse Core Facilityで行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
酢酸Honeywell, Charlotte, USA33209
Axio ObserverZeiss, Oberkochen, Germany4633000956 (serial number)
Coverslip 1.5Roth, Karlsruhe, GermanyKCY5.1
ホルムアルデヒド 37%Fisher Scientific, Leicestershire, UKF/1501/PB15
Meyer's hemalum solutionMerck,ダルムシュタット、ドイツ109249
Picrosirius Red SolutionMorphisto、オッフェンバッハ・アム・マイン、ドイツ13422使用できる代替品:ab150681、abcam、ケンブリッジ、英国;SRS250 ScyTek Laboratories, Logan City US
Polarizing filterZeiss, Oberkochen, Germany000000-1121-813
Rotary microtome, HistoCore AUTOCUTLeica, Wetzlar, Germany149AUTO00C1, 14051956472
ROTI Histokitt mounting mediumRoth, Karlsruhe, Germany6638.1
ROTI Plast ParaffinRoth, Karlsruhe, Germany6642.5
Rotilabo埋め込みカセット、POMRoth、カールスルーエ、ドイツK113.1
Superfrost Plus Adhesion Microscope slideepredia、ポーツマス、英国J1800AMNZ
Tissue Processor ライカ、ウェッツラー、ドイツTP 1020
Software
フィジー ソフトウェア バージョン 2.14.0/1.54fオープン ソース
イメージング ソフトウェア ZEN 3.4.91ツァイス、オーバーコッヘン、ドイツ

参考文献

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