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方法論記事

ラットにおけるCalvarial Suture-Bony Composite T欠損症の確立:縫合再生治療研究のための標準化モデル

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DOI:

10.3791/66417

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2024年5月10日

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1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

この記事について

サマリー

ラットの頭蓋骨縫合骨複合欠損症の詳細な外科的手順と、モデルの短期および長期の予後に関する調査について説明します。縫合再生医療を開発するための標準化されたモデルの構築を目指します。

要約

大規模な頭蓋骨欠損は、頭蓋縫合糸の混乱と一致することが多く、頭蓋骨欠損の修復と頭蓋骨の発達の障害につながります(後者は発達中の頭蓋骨で発生します)。しかし、標準化されたモデルがないため、縫合糸再生療法の研究が進まず、異なる研究間での比較分析が困難となっています。この問題に対処するために、現在のプロトコルでは、ラットの頭蓋骨縫合糸-骨複合欠損の詳細なモデリングプロセスを説明しています。

このモデルは、冠状縫合糸全体に 4.5 mm × 2 mm の全層の長方形の穴を開けることによって作成されました。ラットは安楽死させ、頭蓋サンプルは術後0日目、2週目、6週目、および12週目に採取されました。術後すぐに採取したサンプルの μCT 結果により、冠状縫合糸と隣接する骨組織の除去を含む、縫合糸と骨の複合欠損の確立が成功したことが確認されました。

術後6週目と 12週 目のデータは、欠損が閉じるための自然治癒傾向を示しました。組織学的染色は、欠損中心に石灰化繊維の増加と新しい骨を示すことにより、この傾向をさらに検証しました。これらの知見は、頭蓋骨欠損後の経時的な縫合糸の融合が進行することを示しており、縫合糸の再生に対する治療的介入の重要性を強調している。このプロトコルは、縫合糸再生療法の開発を促進し、頭蓋骨欠損の機能回復に関する新たな洞察を提供し、縫合糸の喪失に関連する有害な結果を減らすことを期待しています。

概要

頭蓋縫合糸は、頭蓋骨間の緻密な線維性接続であり、わずかな頭蓋骨の動きを容易にする関節として機能し、圧力下での脳の保護クッションを提供します1。近年、頭蓋骨の発達、頭蓋顔面の恒常性、および固有の骨修復能力における頭蓋縫合の重要な役割が注目される研究が増えています 2,3,4,5,6,7,8。成長と発達の期間中、頭蓋縫合糸は頭蓋骨4の主要な成長中枢として機能します。縫合糸の両側の骨形成前部で新しい骨形成が起こる一方で、縫合糸内の細胞は未分化の間葉系状態を維持し、脳の成長と並行してバランスの取れた頭蓋骨の拡張を確保します1。このとき頭蓋縫合糸が失われると、頭蓋骨と脳の成長に食い違いが生じ、脳損傷、水頭症、頭蓋内圧の上昇、認知機能障害などの深刻な問題を引き起こします3,9。

さらに、頭蓋縫合糸は、頭蓋欠損症の予後を決定する上で重要な役割を果たします5,7,10。頭蓋縫合糸は、頭蓋骨表面全体の再生能が不均一に分布しており、非縫合領域10,11と比較して著しく優れた能力を示している。ある研究では、頭蓋欠損の治癒速度は、頭蓋縫合糸と損傷部位との間の距離と逆相関することが示されています10。具体的には、冠状縫合糸と矢状縫合糸の除去は、頭頂骨欠損7の非治癒につながり、頭蓋欠損における縫合糸再生の必要性を強調しています。しかし、現在の研究の焦点は主に頭蓋骨構造の修復にあり、縫合間葉の再生は無視されています。

縫合糸再生の進展については、縫合糸を含む骨皮弁、間葉系幹細胞(MSC)、人工生体材料の移植により有望な結果が観察されています。縫合糸を縫合した骨弁を頭蓋欠損に移植したとき、縫合糸のない骨弁は非癒合を示し、骨膜、硬膜、または骨細胞を形成することができないのとは対照的に、うまく統合および治癒しました5。同様に、骨髄由来のMSCを矢状縫合-骨複合欠損に移植すると、縫合糸様の隙間12の形成が促進された。注目すべきは、最近の研究では、Gli1+ MSCによる縫合糸再生の実現が強調されており、頭蓋内圧制御、頭蓋骨変形矯正、および神経認知機能の強化が可能になった13。再生医療と生物医学工学が発展するにつれて、研究者は、その適応性とカスタマイズ性を備えた生体材料14にますます注目しています。特に、ポリテトラフルオロエチレン膜は、頭蓋骨と縫合間葉を同時に再建するのに効果的であることが証明されています15,16。

しかし、頭蓋顔面研究は、骨、皮膚、軟骨、筋肉などの他の組織を修復する比較的成熟したモデルとは異なり、縫合間葉系再生療法を探求するための確立されたモデルが不足している17。標準化されたモデルがないため、縫合再生療法の研究が制約され、異なる研究間での比較分析を行うことが困難になります。したがって、私たちの研究では、実行可能で再現性のあるラットの頭蓋骨縫合糸-骨複合欠損が確立されました。この方法を通じて、頭蓋縫合再建のための適切な臨床的介入を開発することを目指しています。これにより、頭蓋骨欠損の機能修復と縫合糸の喪失による好ましくない結果を減らすための新しい視点を提供します。

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プロトコル

この研究のすべての動物手順は、四川大学西中国口腔病学学校の倫理委員会(WCHSIRB-D-2021-597)によってレビューされ、承認されました。合計12匹(4つの時点のそれぞれで3匹のラット)のSprague-Dawley(SD)ラット(雄、300g、8週齢)を市販の供給源から入手しました( 資料の表を参照)。

1. 術前準備

  1. 手術用品
    1. 図1Aに示す手術器具を準備します(湾曲した鉗子、使い捨て滅菌メス、骨膜エレベーター、灌漑針、綿球、低速ハンドピース、手術用モーター、歯科用低速丸バー(図1B、それぞれ直径1.2mmと0.8mm)、ニードルホルダー、3-0モノフィラメント縫合糸、ストレートハサミ。
  2. 滅菌と消毒
    1. 事前に蒸気滅菌(125-135°C、20-25分)で器具を滅菌してください。
    2. エタノールを使用して、電気シェーバーなどの熱に弱い医療機器を滅菌します。
    3. 滅菌済みの医療用不織布を使用して手術プラットフォームを覆い、75%エタノールで周囲の環境を消毒します。
  3. 麻酔
    1. 1週間の順応期間で手術のために動物を準備します。
    2. 麻酔のために手術の20分前にキシラジン(10 mg / kg)とケタミン(100 mg / kg)をラット腹腔内に注射するか、全身麻酔を達成するために適切な麻酔プロトコルを利用します。
      注:ラットに腹腔内に投与されたケタミン-キシラジン麻酔カクテルは、通常、10〜15分以内に効果を発揮し、注射後約35〜40分で麻酔のピークに達します。麻酔中の低体温症を防ぐために、ラットは加熱パッドの上に置くのが最適です。
    3. 術前にカルプロフェンを5 mg / kgで皮下注射して鎮痛剤を投与します。.
    4. 「つま先つまみ法」を使用して、ラットが意識があり、反応があるかどうかを判断します。

2.外科的プロセス

  1. サイトの準備
    1. ラットを腹臥位に置き、頭を自然に垂直に伸ばし、この姿勢を維持するための特別な装置や拘束を必要とせずに(図2A)。
    2. 角膜の乾燥を防ぐために、獣医用軟膏、すなわちワセリンをラットの目に塗布します。
    3. 電気シェーバーを使用して、鼻梁と頸椎関節の間の頭皮から髪を取り除きます(図2B)。2%ヨードフォア溶液と75%エタノールで、中心から放射状に円を描くように手術領域を消毒します。動物の背部と切開部を囲む毛皮を覆うために外科用ドレープを使用します。
  2. 手術部位の開設
    1. 鼻骨の中点から始めて、頭蓋骨の正中線に沿って使い捨てメスで2cmの縦方向の皮膚切開を行います(図2C)。
    2. メスを使用して、皮膚層の初期点と範囲を反映した正中線骨膜切開を行います(図2D)。次に、骨膜エレベーター(図2E1)を使用して切開部の両側の骨膜を静かに持ち上げ、頭頂骨、前頭骨、および冠状縫合糸(図2E2)を露出させます。
      注:骨膜を切開するときは、切断時の過度の出血を防ぐために、頭蓋縫合糸を傷つけないように注意してください。冠状縫合糸の適切な露出は、次の手順にとって最も重要です。
    3. 傷口を生理食塩水ですすぎ、手術部位をコットンボールで乾かします。
  3. 縫合骨複合欠損モデルの構築
    1. ノブを回して外科用モーターを35,000rpmに設定し(図1A、黄色の矢印)、スイッチをオンにします(図1A、白い矢印)。
    2. 冠状縫合糸の任意の点から始めて、直径1.2mmの丸いバーを使用して、突破口の感覚が感じられるまで垂直方向の力を加えます。
      注:穿通の開始点として、冠状縫合糸の中点( 図2E2の黄色の矢印で示されています)を推奨します。研削するときは、歯科用ドリルを頭蓋面に対して垂直に保つ必要があります。脳の損傷や脳出血など、ラットへのさらなる害を防ぐために、頭蓋骨の全厚を貫通した後も穴を開け続けないように注意してください。
    3. 貫通点から、バーを冠状縫合糸に沿って横方向に動かし、約4 mmの長さの位置決め溝を作成します(図2F1)。位置決め溝の両側にあるバーで骨組織を切除し、最初に長方形の全層欠損を形成します(図2F2)。
    4. 直径0.8mmの丸型バーを使用して細部を微調整し(図2G1)、直角の研削と欠陥マージンの平滑化を行い、最終的に幅2mm、長さ4.5mmの標準的な長方形の欠陥を実現します(図2G2)。
      注:300gのSDラットで矢状縫合糸と前頭縫合糸を維持しながら冠状縫合糸を完全に除去するには、実現可能な最大欠損長は約4.5mmです。冠状縫合糸の前後方向の幅(補足図S1)を考慮し、欠損幅を2mmとした。
    5. 自己比較のために、冠状縫合糸の左半分と右半分に2つの欠損を作成します。
    6. 頭蓋骨と脳への熱損傷から保護するために、穴あけ手順中に生理食塩水の継続的な灌漑を維持します。その間、コットンボールを使用して操作エリアを乾燥させます。
  4. サンプル寸法検証
    1. ノギス(図2H1、H2)を使用して欠陥の長さと幅を定期的に検証し、すべてのサンプルで一貫性を確保します。
  5. 手術部位の閉鎖
    1. 3-0モノフィラメント縫合糸で皮膚を閉じます(図2I)。
  6. 術後直後の in vivo マイクロ コンピューター断層撮影法 (μCT)
    1. 可能であれば、手術直後にすべてのラットで in vivo μCTスキャンを実施して、外科的処置の成功を確認し、各個体の欠損回復傾向を監視します。

3. 術後ケア

  1. アニマルケアプロトコルに従って、手術後に必要に応じて、カルプロフェン(5 mg / kg、皮下使用)などの確立された鎮痛薬を投与します。
  2. ラットを一定の加熱パッド(37°C)に移して、術後の回復を図ります。
  3. 完全に意識が溜まったら、ラットを清潔な寝具が入ったケージに移します。
    注:手術後のラットを継続的に監視します。彼らが胸骨の横臥を維持できるようになるまで、彼らを放置しないでください。完全に回復するまで、操作されたラットを他の人から隔離してください。.
  4. 鎮痛管理と術後モニタリングを 24 時間実施し、その後、手術後最初の 1 週間は毎日評価します。その後、少なくとも週に1〜2回ラットを監視します。

4. サンプル採取とデータ解析

  1. サンプル調製
    1. 術後0日目、2週目、6週目、12週目に頭蓋骨標本を採取します。CO2吸入を使用してラットを安楽死させます。
    2. サンプルを4%パラホルムアルデヒドに4°Cで24時間固定してから、さらに分析します。
  2. μCT評価
    1. 術後 0 日目、6 週目、12 週目の頭蓋骨に対して、次のスキャン パラメーターを使用して μCT スキャンを実行します: X 線管電位、70 kVp;X線強度、0.2mA;フィルター、AL 0.5 mm;積分時間、1 x 300 ms;ボクセルサイズ、10μm。
    2. 画像処理ソフトウェアで3D再構成画像と断面画像を取得します( 材料表を参照)。
    3. 残留欠陥量を測定し、対応するソフトウェアで統計分析を実行します( 資料の表を参照)。
  3. 組織学的染色
    1. 頭蓋骨を12%(w / v)エチレンジアミン四酢酸溶液(pH = 7.2)で4°Cで6週間脱灰します。.
      注:3日ごとに溶液を交換してサンプルを脱灰します。シェーカーを利用してプロセスを迅速化します。25 Gの針がサンプルを容易に貫通すると完了が示されます。
    2. 脱水、パラフィン包埋、および標準プロトコル18を使用して6μm切片の調製を進めます。
    3. ヘマトキシリンとエオシン(H&E)およびMassonのトリクローム染色を使用して、キットプロトコル18に従って組織学的分析を実施します。

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結果

この研究では、冠状縫合糸を横切る 4.5 mm x 2 mm の長方形の穴を開けることにより、ラットの頭蓋骨縫合糸-骨複合欠損が確立されました。手術の概略図と研究フローチャートを図3に示します。術後0日間のサンプル、すなわち手術直後に採取されたサンプルの3D画像と断面図により、冠状縫合糸と両端の隣接する骨構造を完全に除去する全層の頭蓋骨欠損が成功したことが確認されました(図4A)。μCT画像と術後6週間の対応する統計解析結果から、欠損部内に形成される不規則な石灰化結節を伴う欠損閉鎖への自然な傾向が明らかになりました(図4)。この傾向は手術後12週間でより顕著になり(図4)、時間が経つにつれて縫合糸が癒合される可能性を示しています。さらなる組織学的解析は、H&EおよびMassonのトリクローム染色を用いて行った。術後2週間で、骨膜と硬膜の顕著な伸展と連続性が観察され、緻密で厚い線維組織が形成され...

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ディスカッション

従来の頭蓋骨欠損モデルは、頭蓋縫合糸を含むかどうかにかかわらず、主に硬組織の修復に集中し、縫合間葉の重要な再生を無視することがよくあります19,20。縫合糸再生研究では、Mardasらによるもの15,16のような以前のモデルでは、トレフィンバーを利用してラットの矢状縫合糸全体に5mmの円形欠損を作成し、その結果、硬組織が大幅に失われ、縫合糸再生の主要な目標から逸脱しました。同様に、Wilk et al.7 による方法論は、矢状縫合糸と右冠状縫合糸の両方の除去を包含し、右頭頂骨に重大な骨欠損を作成することを含み、有益ではありましたが、複数の欠損部位が存在するため、複雑さと潜在的な交絡変数をもたらしました。対照的に、私たちのプロトコルは、冠状縫合糸に沿って両側の長方形の欠陥を作成し、より合理化さ...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会 82100982 (F.L.)、82101000 (H.W.)、82001019 (B.Y.)、四川省科学技術局 2022NSFSC0598 (B.Y.)、2023NSFSC1499 (H.W.)、および四川大学 West China School/Hospital of Stomatology Sichuan University (RCDWJS2021-5) からの研究資金の支援を受けました。図 3 は Biorender.com を使用して作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4% パラホルムアルデヒドバイオシャープBL539A
2% ヨードフォア溶液成都金山化学試薬株式会社なし
75% エタノールChengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.なし
コットンボールHaishi Hainuo Group Co., Ltd. なし
綿棒Lakong Medical Devices Co., なし
湾曲鉗子Chengdu Shifeng Co., Ltd.なし
Dataviewer と Ctan ソフトウェアによる残留欠陥量評価BrukerNone
Dental 低速ラウンドバーDreybird Medical Equipment Co., Ltd.RA3-012
RA1-008
使い捨て滅菌メス杭州ファーウェイ メディカル サプライ Co., Ltd.なし
使い捨てシリンジ (22 g)Chengdu Shifeng Co., Ltd.SB1-089(IX)
電気シェーバーJASEBM320210
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)BioFroxx1340GR500
ヘマトキシリンとエオシンステインキットバイオシャープBL700B
灌漑針(23 g)Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.なし
低速ハンドピースGuangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.None
Masson's トリクロームステインキットSolarbioG1340
医療用不織布河南亜都工業株式会社 なし
マイクロコンピュータ断層撮影法 (µCT) Scanco Medical AGµCT45
Mimics 20.0 for cross-sectional imagesMaterialiseNone
ニードルホルダーChengdu Shifeng Co., Ltd.なし
骨膜エレベーターChengdu Shifeng Co., Ltd.なし
生理食塩水Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.なし
Scanco 3D画像再構成用医療ビジュアライザーソフトウェアScanco Medical AGなし
統計分析用SPSS Statistics 20.0IBMなし
Sprague-Dawley rats Byrness Weil Biotech Ltdなし
ストレートハサミChengdu Shifeng Co., Ltd.なし
外科用モーターマラソンN3-140232
外科用縫合糸 (3-0 モノフィラメント)Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.何一つ

参考文献

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