現在のプロトコルはin vitroの上皮細胞ラインを使用して赤痢菌の付着、侵入および細胞内複製を調査する伝染の試金を記述する。
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この記事について
サマリー
要約
ヒトに適応した腸内細菌性病原体である赤痢菌は、毎年何百万人もの感染症を引き起こし、小児患者に長期的な増殖効果をもたらし、世界中で下痢による死亡の主な原因となっています。感染は、病原体が消化管を通過し、結腸を覆う上皮細胞に感染する結果として、水様または血性の下痢を誘発します。抗生物質耐性菌の驚異的な増加と承認されたワクチンの不足により、この手ごわい病原体を研究するには、標準化された研究プロトコルが不可欠です。ここでは、結腸上皮細胞における細菌の付着、浸潤、および細胞内複製のin vitro分析を使用して、赤痢菌の分子病因を調べるための方法論を紹介します。感染分析に先立ち、赤痢菌コロニーの病原性表現型は、寒天プレート上のコンゴ赤色色素の取り込みによって検証されました。また、バクテリア培養中にin vivo条件を模倣するために、サプリメントを添加した実験用培地を検討することもできます。次に、細菌細胞を標準化されたプロトコルで使用し、感染の各段階を分析するための適応を伴う感染の確立された多様性で、組織培養プレート内の結腸上皮細胞に感染します。アドヒアランスアッセイでは、赤痢菌細胞を培地レベルを下げてインキュベートし、細菌と上皮細胞との接触を促進します。浸潤アッセイと細胞内複製アッセイの両方で、ゲンタマイシンをさまざまな時間間隔で適用して細胞外細菌を排除し、浸潤の評価および/または細胞内複製速度の定量化を可能にします。すべての感染プロトコルは、感染した上皮細胞溶解物を段階的に希釈し、コンゴ赤寒天プレート上の感染力価と比較して細菌コロニー形成単位をめっきすることにより、付着細菌、侵入細菌、および/または細胞内細菌を列挙します。これらのプロトコルを組み合わせることで、上皮細胞の赤痢菌感染の各段階について、独立した特性評価と比較が可能になり、この病原体の研究に成功します。
概要
腸内細菌性病原体によって引き起こされる下痢性疾患は、世界的な健康上の重大な負担です。2016年、下痢性疾患は世界で130万人の死亡の原因となり、5歳未満の子供の死因の第4位でした1,2。グラム陰性腸内細菌性病原体である赤痢菌は、世界中で下痢による死亡の主な原因である赤痢症の原因物質です3。赤痢症は、低・中所得国の子どもに毎年重大な罹患率と死亡率を引き起こし4,5、高所得国での感染は、保育所、食品媒介、水媒介の発生に関連しています6,7,8,9。効果のないワクチン開発10と薬剤耐性(AMR)11,12の上昇により、大規模な赤痢菌の集団発生の管理が複雑になっています。米国疾病管理予防センター(CDC)の最....
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プロトコル
1. 試薬・材料の調製
注:すべての容量は、2 枚の 6 ウェルプレートを使用したアッセイと一致しています。
- TSB培地:0.5 Lの脱イオン(DI)水を15 gのトリプシン大豆ブロス(TSB、 材料表を参照)培地とオートクレーブに加えます。室温で保存してください。
- 胆汁塩培地(TSB + BS):0.4%(w/v)胆汁塩を含むTSBを調製するには、0.06 gの胆汁塩(BS、 材料表を参照)を15 mLのオートクレーブ滅菌したTSBに再懸濁します。0.22μmのPESフィルターを使用してフィルター滅菌します。
注:胆汁塩は、コール酸ナトリウムとデオキシコール酸ナトリウムの1:1混合物で構成されています。使用直前に新しいメディアを準備してください。 - DMEM + 10% (v/v) FBS: 5 mL のウシ胎児血清 (FBS) を 45 mL の Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) に加えます。4°Cで保存してください。
- DMEM + ゲンタマイシン:50 mL チューブに 50 mL の DMEM と 50 μL の 50 mg/mL ゲンタマイシンを加えます( 材料表を参照)。
注:各実験の前に、新鮮なアリ....
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結果
S. flexneri 2457T野生型(WT)と、赤痢菌の病原性を負に制御すると仮定された変異体であるS. flexneri ΔVF(ΔVF)を比較して、アドヒアランス、浸潤、および細胞内複製アッセイを実施しました。赤痢菌は胆汁塩を病原性調節のシグナルとして使用するため17,18,47、実験は、TSB培地での細菌継代培養後、および0.4%(w / v)胆汁塩を添加したTSBの後に行われました18。継代培養段階での胆汁塩曝露は、結腸感染前の小腸通過を複製するための前処理として機能します17,18,47。
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ディスカッション
このプロトコルは一組の腸の上皮セルの赤痢菌の付着、侵入および細胞内の複製を調査する3つの標準化された試金を記述する。これらの方法は、宿主細胞内のさまざまな細菌性病原体の侵入および細胞内複製を研究するために使用される古典的なゲンタマイシンアッセイの単なる修正版ですが49,50,51、赤痢菌を研究する際には特別な考慮事項を適用する必要があります。
赤痢菌は通性嫌気性菌であり、曝気43の豊富な培地中で37°Cで最適に成長します。赤痢菌感染症に対するさまざまな環境シグナルまたは代謝物の影響を調べるためにこれらのアッセイを実施する場合は、赤痢菌をリッチ培地で一晩培養し、感染前の中間期まで定義培地またはサプリメント培地に継代培養することをお勧めします。最大病原性遺伝子発現は.......
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開示事項
著者は利益相反がないことを宣言します。
謝辞
著者への支援には、マサチューセッツ総合病院の小児科、研究暫定支援資金(ISF)に関する執行委員会賞2022A009041、国立アレルギー感染症研究所の助成金R21AI146405、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所の助成金ハーバード大学栄養肥満研究センター(NORCH)2P30DK040561-26が含まれる。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.22 以上 μ;m PESフィルター | ミリポアシグマ | SCGP00525 | 最大50mLの培地を滅菌するための滅菌済みポリエーテルスルホンフィルター |
| 14mL培養チューブ | コーニング | 352059 | 17 mm x 100 mmポリプロピレン製試験管(キャップ付き |
| 50 mLコニカルチューブ | コーニング | 430829 | 50 mL透明ポリプロピレン円錐底遠心分離チューブ(漏れ防止キャップ付き |
| 6ウェル組織培養プレート | コーニング | 3516 | プレートは最適な細胞付着のために処理されます |
| 胆汁塩 | Sigma-Aldrich | B8756 | 1:1の比率 コレートとデオキシコール酸 |
| コンゴレッド染料 | Sigma-Aldrich | C6277 | ベンジジンベースのアニオン性ジアゾ色素、>85% |
| 純度 Countess細胞計数チャンバースライド | Invitrogen | C10283 | Countess Automated Cell Counter |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | と併用しますSigma-Aldrich | D8418 | A 高極性有機試薬 |
| Dulbecco'Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10569-010 | DMEMには、高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、GlutaMAX、フェノールレッド |
| シ胎児血清(FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | 熱不活性化、滅菌ゲン |
| タマイシン | Sigma-Aldrich | G3632 | ストック濃度は50 mg/mL |
| HT-29細胞株 | ATCC | HTB-38 | 腺癌細胞株;起源 |
| パラフィンフィルム | Bemis | PM999 | ラボ用シーリングフィルム |
| シャーレ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | FB0875713 | 100 mm x 15 mm 固形媒体用シャーレ |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10010049 | 1x 濃度; pH 7.4 |
| 寒天を選択 | Invitrogen | 30391023 | 赤海藻の細胞壁から抽出された多糖類の混合物で細菌のめっき培地を作る |
| T75フラスコ | コーニング | 430641U | 組織培養フラスコ |
| トリトンX-100 | シグマ・アルドリッチ | T8787 | 一般的な非イオン性界面活性剤と乳化剤 |
| トリパンブルーステイン | Invitrogen | T10282 | 死んだ組織培養細胞を検出する色素; 生細胞のみが色素を除外できます |
| トリプシン-EDTA | Gibco | 25200-056 | 細胞株の維持管理と継代のための細胞解離用試薬 |
| トリプシン大豆ブロス (TSB) | Sigma-Aldrich | T8907 | 細菌増殖培地 |
参考文献
- Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077(2021).
- WHO.
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再版と許可
