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方法論記事

間伐頭蓋窓と流体パーカッションを組み込んだ反復性軽度外傷性脳損傷の改良マウスモデル

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DOI:

10.3791/66440

⸱

2024年4月19日

 ,  ,  ,  , 
1College of Physical Education and Health Sciences, Zhejiang Normal University

* These authors contributed equally

この記事について

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サマリー

このプロトコルは、反復性軽度外傷性脳損傷 (rmTBI) の修正マウス モデルを示しています 閉鎖性頭部損傷 (CHI) 法によって誘発されます。このアプローチは、髄膜曝露によって一般的に引き起こされる炎症を軽減するための薄くなった頭蓋骨窓と流体パーカッションを特徴としており、げっ歯類のrmTBIのモデリングにおける再現性と精度が向上しています。

要約

軽度の外傷性脳損傷は、臨床的に非常に不均一な神経障害です。軽度のTBI後の神経病理学のメカニズムを研究し、治療法をテストするためには、明確に定義された病状を持つ再現性の高い外傷性脳損傷(TBI)動物モデルが緊急に必要とされています。TBIの後遺症全体を動物モデルで再現することは、困難であることが証明されています。したがって、TBI患者に見られる多様な側面と重症度を説明するためには、TBIの複数の動物モデルの利用可能性が必要です。CHI は、rmTBI のげっ歯類モデルを作製するための最も一般的な方法の 1 つです。ただし、この方法は、使用される衝撃方法、頭蓋骨の厚さと形状、動物の無呼吸、使用される頭部サポートと固定の種類など、多くの要因の影響を受けやすいです。このプロトコルの目的は、薄くなった頭蓋骨窓と流体打楽器損傷 (FPI) 法の組み合わせを実証して、CHI 関連 rmTBI の正確なマウス モデルを作成することです。このプロトコルの主な目的は、頭蓋骨の厚さ、形状、頭部のサポートなど、CHIおよびFPIモデリングの精度と一貫性に影響を与える可能性のある要因を最小限に抑えることです。頭蓋骨窓間伐法を利用することにより、開頭術とFPIによる潜在的な炎症が最小限に抑えられ、軽度のTBI患者に観察された臨床的特徴を再現する改良されたマウスモデルが得られます。ヘマトキシリンとエオシン(HE)染色を用いた行動および組織学的解析の結果は、rmTBIが脳の行動と肉眼的形態の両方に変化をもたらす累積的な損傷を引き起こす可能性があることを示唆しています。全体として、修飾された CHI 関連 rmTBI は、研究者が rmTBI の限局性およびびまん性病態生理学的変化に寄与する根本的なメカニズムを調査するための有用なツールを提供します。

概要

脳震盪および脳震盪を含む軽度の脳外傷は、すべての脳外傷症例の大部分を占めています (全脳震盪の>80%)1。軽度のTBIは、通常、転倒、交通事故、暴力行為、コンタクトスポーツ(サッカー、ボクシング、ホッケーなど)、および軍事戦闘から生じます2,3。軽度のTBIは、患者の生涯を通じて神経行動機能に影響を及ぼし、神経変性疾患のリスクを高める神経生物学的イベントを引き起こす可能性があります4,5,6。動物モデルは、軽度TBIを研究するための効率的で制御された手段を提供し、軽度TBIの診断と治療をさらに強化することを期待しています。制御皮質衝撃 (CCI)、ウェイト ドロップ (WD)、流体パーカッション損傷 (FPI)、ブラスト TBI モデル 7,8 など、軽度の TBI のさまざまなモデルが開発されています。単一の実験モデルで、TBI誘発性病理学の全複雑性を模倣することはできません9,10。これらのモデルの不均一性は、軽度のTBI患者に関連する多様な特徴に対処し、対応する細胞および分子メカニズムを調査するのに有利です。ただし、TBIの各動物モデルには限界があり3、動物の軽度のTBIとその臨床的関連性に関する現在の知識は限られています。

WDおよびCCIモデルは、脳組織の喪失、急性硬膜下血腫、軸索損傷、脳震盪、血液脳関門機能障害、さらにはTBI 3,11,12後の昏睡などの臨床状態を再現するために使用されます。WDモデルは、硬膜または頭蓋骨のいずれかを自由に落下させる重りで打つことにより、脳の損傷を誘発することを含みます。無傷の頭蓋骨に加重された物体が衝撃を与えると、病巣性/びまん性が混在する損傷が再現される可能性があります。しかしながら、この方法は、損傷部位の精度および再現性の低下、リバウンド損傷、および頭蓋骨骨折による死亡率の上昇と関連している3,11,12。CCIモデルでは、空気駆動の金属を適用して、露出した硬膜に直接衝撃を与えます。WDモデルと比較して、CCIモデルはより正確で再現性がありますが、衝撃チップ11の直径が小さいため、びまん性損傷は発生しません。FPIモデリング中、脳組織はパーカッションによって一時的に変位し、変形します。FPI は、外傷後に混合限局性/びまん性損傷を誘発し、頭蓋内出血、脳の腫れ、進行性の灰白質損傷を再現する可能性があります。ただし、FPI は、脳幹の損傷と長期の無呼吸により死亡率が高くなります 3,12。従来の WD、CCI、FPI モデルに含まれる開頭術は、皮質挫傷、出血性病変、血液脳関門の損傷、免疫細胞の浸潤、グリア細胞の活性化、モデリング時間の延長、および致命的な結果につながる可能性があります 3,12。

軽度のTBIは、GCS(グラスゴー昏睡尺度、GCS)スコアが13〜152の範囲にあることを特徴としています。軽度のTBIは、限局性またはびまん性のいずれかであり、細胞恒常性の破壊、興奮毒性、グルコース枯渇、ミトコンドリア機能障害、血流障害、軸索損傷などの急性損傷と、軸索損傷、神経炎症、神経膠症などの亜急性損傷の両方に関連しています2,3。TBIの複雑な病態生理学の描写における大きな進歩にもかかわらず、軽度のTBI / rmTBIの根底にあるメカニズムは依然としてとらえどころがなく、さらなる調査が必要です9。CHIがTBIの最も一般的なタイプであることを考えると12、このプロトコルは、薄くなった頭蓋骨窓13に衝撃を与えるために修正されたFPIデバイスを使用して、rmTBIのより正確に制御されたマウスモデルを作成するための新しいアプローチを提示する。開頭術による損傷、頭蓋骨の厚さの変動、形状による不正確さ、リバウンド損傷を回避することにより、このアプローチは、WD、CCI、およびFPIモデルに関連する主な欠点を克服することを目的としています。薄くなった頭蓋骨窓にFPIインパクトを適用すると、rmTBI後の脳血管損傷を評価するのに便利であり、一部のモデルで高い死亡率を最小限に抑えるのに役立ち、TBI患者の臨床的特徴により類似しています。

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プロトコル

このプロトコルに関連するすべての手順は、Institutional Animal Care and Use Committee(浙江師範大学、許可番号、dw2019005)の承認の下で、ARRIVEおよびNIHの実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠して実施されました。技術仕様は 、資料表に記載されています。

1.動物の取り扱い手順

  1. 温度22-24°C、湿度40%-60%の範囲、12時間の明暗サイクルで制御された環境でイエネズミを飼育し、水と標準的なマウスチャウへの 自由な アクセスを提供します。この実験では、25匹のICR雄マウス(25-30g、8週齢)を使用しました。
  2. マウスを対照群(n = 12)またはrmTBI群(n = 13)にランダムに割り当てます。偽マウスからrmTBIを受けたマウスへの潜在的な攻撃性を防ぐために、それらを別々のケージに分けます。.
  3. 実験を開始する前に、マウスがケージ環境に順応するまで少なくとも1週間かかります。この順応期間により、マウスは周囲に慣れ親しみ、研究中のストレスや不安が生理学的または行動的反応に及ぼす潜在的な影響を最小限に抑えることができます。

2. TBIデバイスの準備

  1. マウスで rmTBI モデルを作製するには、修正された FPI デバイスを使用します ( Table of Materials を参照。 図1A)13. FPIデバイスを使用する前に、シリンダーとチューブの間、および三方コネクタとチューブの間の接合部に特に注意を払いながら、すべての接続に漏れや亀裂の兆候がないか注意深く検査してください。衝撃圧力を正確に決定するために、流体打楽器傷害装置13への衝撃点に圧力変換器が設置された。
  2. FPI装置を入念に点検し、ピストンがシリンダー内でスムーズに動き、衝撃が効果的に行われることを確認します(図1B)。システム内に気泡が存在しないことを確認します。気泡が検出された場合は、50 mLシリンジを使用して蒸留水を慎重にシステムに加え、シリンダーロッドを近くの3方向コネクタまたはシリンジにすばやく押し込んで気泡を排出します。.
    注意: FPIシステムは、シリンダー内の蒸留水と接続されたチューブで構成されています。結果の精度と信頼性を確保するためには、操作前にデバイスを校正することが重要です。

3.薄くなった頭蓋骨の準備

注:動物手術と頭蓋骨の薄化の準備は、他のマウスの視点で行わないでください。.薄くなった頭蓋骨窓は、FPI処置後の脳血管損傷を評価するのに役立ちます。

  1. 動物センターの要件に従い、実験オペレーターにすべての動物取り扱い手順で滅菌ガウンとマスクを着用するように指示します。
  2. 実験を開始する前に、70%エタノールスプレーを使用して、ラボベンチトップ、FPIデバイス、麻酔チューブ、および隣接するカウンタースペースを消毒します。
  3. 手術前に偽グループとrmTBIグループの両方でマウスの体重を量り、実験の1週間前に記録された体重と比較します。粗い毛皮、下痢、体重減少、嗜眠など、健康状態が悪いマウスを研究から除外します。さらに、体重が20 g未満のマウスは除外して、繰り返しの衝撃に耐える能力を確保します。これらの対策は、動物福祉を維持し、信頼性の高い実験結果を確保するために重要です。
  4. マウスを4%〜5%イソフルラン(1L / minの流量で100%酸素中)で3〜4分間、誘導チャンバー内で麻酔します。眼科用潤滑剤( 材料の表を参照)を動物の目に投与して、手術中の潤滑を維持します。痛みを軽減するには、麻酔の20分前にブプレノルフィンを耳の中点に皮下(0.05 mg / kg)投与し、その後6時間ごとに24時間投与します。.さらに、麻酔の終了時に、各動物に5 mg / kgのカルプロフェンを1回皮下投与します。.
  5. マウスが立ち直りとペダル離脱反射を失った後、頭を消毒します。手術用ハサミを使用してマウスの頭の毛皮を切り取り、シェーバーを使用して残りの毛皮を取り除きます。2%クロルヘキシジンを3回連続して塗布し、75%エタノールスクラブを散在させて頭皮を消毒します。.
  6. 動物とその周辺の下に使い捨ての滅菌手術用パッドを置き、適切な衛生状態を確保します。マウスの頭皮の正中線に沿って細い小さな手術用ハサミを使用して1.5cmの切開を行い、手術部位を完全に露出させます(図2A)。
  7. 従来の定位固定装置フレームに非端子イヤーバーを使用してマウスを固定します( 資料の表を参照)。定位固定装置フレーム内のマウスヘッドの位置を、調査対象の特定のターゲット領域に応じて、フラットレベルまたはわずかに傾いた角度で調整します。手術部位の毛皮をきれいにして、後で炎症を防ぎます。
  8. 従来の等温加熱パッドを使用して、マウスの体温を37°Cに維持します( 材料の表を参照)。
  9. 外科的およびインパクトハブ(メス型ルアーロック)の取り付けプロセス中は、キャリブレーションされた気化器によって調整された連続的な2%のイソフルラン濃度を提供するノーズコーンを使用して、マウス麻酔(つま先や尾の挟み込みに反応しない)を維持します。
  10. 薄くなった頭蓋骨の窓の周りの手術領域を、滅菌生理食塩水に浸した綿棒を使用して慎重に清掃します。
  11. 先端が平らなマイクロドリルビット( 材料の表、 図2Bを参照)とマイクロサージカルブレードを使用して、右前頭運動皮質に直径約2.5mm、厚さ20μmの薄くなった頭蓋骨窓を作成します。手術部位をブレグマの前方1.5 mm、正中線の1.3〜2.0 mmの側面に配置します(図2C)。
    1. 薄くなった頭蓋骨の窓の作成中にマイクロドリルが頭蓋骨を貫通するのを防ぐために、マイクロドリルで研削しながら、頭蓋骨を生理食塩水で断続的に湿らせます。
    2. 細い注射針の先端を平らにした頭蓋骨で薄くなった頭蓋骨を優しく探り、その柔らかさを評価して、頭蓋骨の厚さを確認します。露出した皮質微小血管の透明度を視覚的に推定して、頭蓋骨の厚さを決定します。
    3. 頭蓋骨の厚さを確認するには、薄くなった部分に滅菌生理食塩水を塗布し、従来の解剖顕微鏡を使用して目視検査します( 材料の表を参照)。この技術は、頭蓋骨が適切に薄くなっていることを確認するのに役立ちます。
      注:薄くなった頭蓋骨の準備とrmTBIモデリング手順全体を通してマウスの目を滑らかにして、乾燥を防ぎます。頭蓋骨を15μm未満に薄くすると、軽度の皮質外傷のリスクがあり、軽度の皮質炎症を引き起こす可能性があります14。
  12. 調整されたメスのルアーロック( 図2Dに示すように、19Gのニードルハブから作成された内径2.2 mm)を薄くなった頭蓋骨部位に取り付けます。ルアーロックを接着剤と歯科用セメントで固定します(図2E)。
    注:接着剤を使用してメスのルアーロックを薄くなった頭蓋骨の窓の周りの領域に固定する場合は、頭蓋骨の領域を完全に乾燥させ、接着剤が窓自体に入るのを防ぐことが重要です。ウィンドウ内の接着剤は、FPIの衝撃力を大幅に低減できます。

4. CHI関連のrmTBIモデリング手順

  1. 前述したように、13,15を改良したFPIデバイスを用いて、横方向の流体パーカッション法を用いてrmTBIを導入します。
  2. 薄くなった頭蓋骨窓とインパクトハブの手順が完了したら、マウスを定位固定装置からインパクタープラットフォームに移します。
  3. パーカッション9,16後の動物の矯正反射時間と傷害の重症度に対する麻酔の潜在的な影響を考慮して、眼瞼と足の離脱反射を評価することにより、麻酔の深さを監視します(図2F)。
  4. 薄くなった頭蓋骨の窓に接着されたメス型ルアーロックを、FPIデバイスチューブの端にあるオス型ルアーロックに接続します(図2G)。
    注:rmTBIモデリングでは、マウスのイソフルラン誘発麻酔は、無呼吸の誘発とパーカッションによる意識喪失により延長されました。
  5. 修正されたデバイスで2つの軽度のTBI(48時間間隔)を導入します。薄くなった頭蓋骨の窓の手術を完了し、ルアーロックを取り付けた直後に、最初のFPIインパクトを適用します。FPIインパクトは、マウスが引きこもり反射を足のピンチに戻したことを示した場合にのみ行ってください(図2H)。深く麻酔をかけたマウスにFPIインパクトを適用すると、長期の無呼吸と死を引き起こす可能性があります。
    1. FPI衝撃を適用するには、振り子をデバイスの分度器に沿って指定された程度まで上げ、ソフトウェア制御13,15を使用して振り子を解放します。衝撃は、げっ歯類の研究10,17,18で使用される確立されたプロトコルに従って、2.0±0.1気圧のパーカッション強度を達成する必要があります。衝撃が1.9〜2.1気圧の間に記録されなかった場合、またはFPI中に頭蓋骨骨折が発生した場合は、動物をさらなるテストから除外します。
    2. 偽マウスの場合は、装置に固定しますが、衝撃を与えないでください。
  6. 衝撃後は、すぐにルアーロック接続を取り外し、マウスを等温加熱パッドに移して回復させます。マウスが覚醒と意識を取り戻した後、メスのルアーロックを外さずにホームケージに戻します。2 回目の FPI インパクトを同じ方法で 48 時間後に配置します。
  7. rmTBIの後、メスのルアーロックと歯科用セメントを慎重に取り外します。ティッシュ接着剤を使用して頭皮を縫合し、平らな鉗子を使用して頭皮をつまんで接着プロセスを容易にします( 材料の表を参照。 図2I)。
  8. 炎症、感染を防ぎ、術後の痛みや不快感を軽減するには、エリスロマイシンとジクロフェナクナトリウム軟膏の混合物を1:1の比率で傷に塗布します( 材料の表を参照)。.マウスを等温加熱パッドに移して回復させます。
  9. マウスを脳定位固定装置から取り外し、FPIのインパクタープラットフォームに横方向に置いたときに開始し、マウスが独立して直立できるようになるまで続く立ち直り反射の持続時間を記録します。
  10. マウスが覚醒と意識を取り戻した後、マウスをホームケージに戻します。マウスは通常、完全に意識があり、損傷後1.5時間以内に歩くことができます。
  11. TBIモデリングの数日後に、マウスを観察して、呼吸パターン、鼻と口の周りの粘液の存在、発赤、腫れ、滲出液、創傷領域の再開など、さまざまな兆候を確認します。上記の異常な症状の1つ以上を持つ動物を研究から除外します。
    注:AAV-GCaMP6のプレマイクロインジェクションは、2光子レーザー走査型顕微鏡15を使用して、薄くなった頭蓋骨窓を通じて、損傷した皮質の根底にあるニューロンCa2+恒常性と興奮性の観察を可能にします。

5.モリス水迷路(MWM)テスト

注:MWM( 資料表を参照)は、TBI後のマウスの空間学習と記憶障害を評価するための広く認識されている方法です。

  1. MWMテストは、損傷後7日(DPI)から開始して実施します。MWMの円形プールは直径120cm、高さ50cmで、水温は25°Cに保たれていました。 円形のプールを4つの象限に分け、直径6 cm、高さ30 cmの丸いプラットフォームであるエスケーププラットフォームを北東の象限の水面下1cmに沈めます。
  2. 円形プールの真上にカメラを配置して、マウスの動きの軌跡を記録します。マウスの背中に黒いテープを貼ってマークし、画像取得ソフトウェアによる認識を容易にし、遅延、遊泳距離、移動軌跡などのデータ記録を容易にします。
  3. マウスを水中に置き、4つの象限のそれぞれの内壁に面して、各象限に1回ずつ入れます。マウスがプラットフォームを見つけたら、そこで10秒間休ませます。マウスが60秒以内にプラットフォームを見つけられなかった場合は、オペレーターにマウスをプラットフォームに誘導してもらい、プラットフォームに10秒間置いてから、マウスをホームケージに戻して休ませてください。
  4. 各マウスについて、取得試行を毎日4回繰り返します。取得試験に続いて、12 DPIで60秒の空間プローブ実験を実施し、マウスが元のプラットフォーム領域を横切った回数と、プラットフォームが配置された象限にマウスが滞在した時間を記録します。
  5. 各試験後、マウスをタオルで素早く乾かすか、温めランプの下に置いて体温を維持し、DPI 7からDPI 11までの60秒獲得試験中に低体温症を予防します。
  6. 上記の実験手順の完了後、マウスにペントバルビタール(45 mg / kg、i.p.)を13 DPIで麻酔します。.等張性生理食塩水を経心的に灌流し、続いてリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.2)に4%パラホルムアルデヒドを灌流します。従来のHE染色のために脳を回収し、肉眼的な皮質および海馬の形態変化を評価します。HE染色プロトコルの詳細な説明は、以前の出版物13,15に記載されています。
  7. すべての実験が完了した後、マウスサンプルが不要な場合は、過剰摂取のペントバルビタール(≥100 mg / kg、i.p.)を注射してマウスを安楽死させます。.ティッシュを採取したり、死体を廃棄したりする前に、少なくとも60秒間心拍がなくなるまでマウスを監視してください。

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結果

この研究で説明されているプロトコルは、細くなった頭蓋骨窓を介して rmTBI を誘導する方法を概説しており、従来のパーカッション TBI モデリング中の開頭術の準備によって引き起こされる脳損傷に対する解決策を提供します。この変更された流体パーカッション手順を変更されたデバイスで利用することにより、FPI衝撃の精度と再現性が向上しました13。変更されたインパクターは、頭蓋骨開頭術の有無にかかわらず、CHIとFPIの両方のモデリングに使用できる汎用性を備えています。さらに、損傷の重症度は、衝撃振り子の落下角度などの損傷パラメータを調整するか、ピストンポールのエンドプレートにさまざまな硬度の独立気泡エチレン-酢酸ビニルフォームパッドを追加することによって調整されます。

修正された rmTBI モデルは、皮質硬膜を露出させることなく限局性およびびまん性の病状を生成するなど、大きな利点を提供します。これにより、髄膜曝露による炎症や実質への直接 FPI が最小限に抑えられます。さらに、このモデルは頭蓋骨の厚さと形状のばらつきを減らし、信頼性の高い...

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ディスカッション

TBIは、閉鎖型と貫通型の2つの主要なタイプを指し、後者は頭蓋骨と硬膜の破壊を特徴としています。臨床データは、CHIが穿通性損傷よりも一般的であることを示唆しています1,2。軽度のTBIが1回あると、ほとんどの患者はPCSの症状を経験しますが、通常は短期間で解消し、PCSが長期後遺症に発展する患者の割合については論争があります23,24。その結果、研究者は、転倒、交通事故、およびコンタクトスポーツで一般的に発生する複数の脳震盪25の累積影響をよりよく理解するために、反復CHIモデルに焦点を移しました。これらの繰り返しの影響は、より深刻で長期的な影響につながる可能性があります26,27。反復的なCHIモデルを使用することで、研究者は複数の脳震盪...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この作業は、金華市の主要な社会開発基金会(No.2020-3-071)、浙江大学生イノベーションおよび起業家精神トレーニングプログラム(No:S202310345087、S202310345088)、および浙江省大学学生の科学技術イノベーション活動計画プロジェクト(2023R404044)の支援を受けました。著者は、記事の言語編集に協力してくれたEmma Ouyang氏(ジョンズ・ホプキンス大学1年生、米国ボルチモアの理学士)に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
75%エタノール 山東省謝康医療技術有限公司 
ブプレノルフィン塩酸塩津製薬研究所製薬株式会社H12020272液、鎮痛剤
カルプロフェン上海古陳バイオテクノロジー株式会社53716-49-7粉末、鎮痛剤
クロルヘキシジンジグルコン酸上海マックリン生化学株式会社18472-51-019%-21%水溶液、抗菌
歯科用セメントおよび溶剤キット上海新世紀歯科材料有限公司20220405、3#Powder reconsituted in matching solvent
Dissecting microscopeShenzhen RWD Life Science Inc.77019
エリスロマイシン軟膏 武漢Mayinglong製薬グループCo.、Ltd.220412抗生物質
光ファイバー冷光源Shenzhen RWD Life Science Inc.F-150C
フラットチップマイクロドリルビット 深センRWDライフサイエンス株式会社HM310082 mm、スチール
FPIデバイスソフトウェアJiaxing Bocom Biotech Inc.Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICRマウスJinhua Laboratory Animal Center  在庫#202309125匹のオスマウス、25-30g、8週齢
イソフルラン山東アンテ動物飼育技術有限公司 
等温加熱パッド 温州レプショップペットプロダクツ株式会社 
Luer Loc hup19Gニードルハブを使用したカスタムメイド
マイクロハンドヘルドスカルドリルShenzhen RWD Life Science Inc.78001Max: 38,000rpm
修正FPI装置Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morrisウォーター迷路深センRWDライフサイエンス株式会社63031マウスの空間学習能力と記憶能力の評価
オープンフィールドShenzhen RWD Life Science Inc.63008マウスの運動と不安の評価
眼科用潤滑剤 蘇州天龍製薬有限公司 
ジクロフェナクナトリウム軟膏 武漢Mayinglong製薬グループCo.、Ltd.221207非ステロイド性抗炎症薬
小動物麻酔システム-強化 深センRWDライフサイエンス株式会社R530IP
スマートビデオトラッキングシステムPanlab Harvard Apparatus Inc., MA, USAV3.0動物追跡・分析
定位フレーム 深センRWDライフサイエンス株式会社68043
Vetbond Tissue Adhesive3M, St Paul, MN, USA202402AXSuture the animal wound
Y mazeShenzhen RWD Life Science Inc.63005マウスの空間ワーキングメモリの評価
220502天の2023090501SC230724B

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Formal Correction: Erratum: Modified Mouse Model of Repetitive Mild Traumatic Brain Injury Incorporating Thinned-Skull Window and Fluid Percussion
Posted by JoVE Editors on 6/04/2025. Citeable Link.

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