凍結保存された人工多能性幹細胞由来の間質/内皮および血液細胞タイプから高品質の核を抽出するためのプロトコルについて説明し、単一核の次世代シーケンシング解析をサポートします。高品質で無傷の原子核を作製することは、マルチオミクス実験にとって不可欠ですが、研究室によってはこの分野への参入障壁となることがあります。
この記事について
サマリー
要約
人工多能性幹細胞(iPSC)ベースのモデルは、血液の発生を理解するための優れたプラットフォームであり、iPS細胞由来の血液細胞は、臨床検査試薬や輸血可能な細胞治療薬としてトランスレーショナル有用性があります。一核RNAシーケンシング(snRNAseq)やトランスポザーゼアクセス可能クロマチンシーケンシングアッセイ(snATACseq)を含むがこれらに限定されないマルチオミクス解析の出現と拡大は、細胞発生の理解に革命をもたらす可能性を提供します。これには、 in vitro 造血モデルを用いた発生生物学が含まれます。しかし、培養細胞や初代細胞から無傷の核を単離することは技術的に困難な場合があります。細胞の種類が異なれば、細胞の硬直性や含有量に応じて、しばしば調整された核調製が必要になります。このような技術的な困難は、データの品質を制限し、マルチオミクス研究に関心のある研究者にとって障壁となる可能性があります。細胞の収集や処理には制限があるため、試料の凍結保存が必要になることが多く、凍結したサンプルは無傷の核分離にさらなる技術的課題をもたらす可能性があります。この論文では、 in vitro 造血のさまざまな段階でiPS細胞由来細胞から高品質の核を単離し、単一核マルチオミクスワークフローで使用するための詳細な方法を提供します。私たちは、iPS細胞由来の接着性間質/内皮細胞と非接着性造血前駆細胞からの核の単離にメソッド開発の焦点を当ててきました。これらは構造的および細胞同一性に関して非常に異なる細胞タイプを表しています。説明したトラブルシューティング手順により、核の凝集とデブリが最小限に抑えられ、下流の分析に十分な量と質で原子核を回収することができました。同様の方法は、他の凍結保存された細胞タイプから核を単離するために適応され得る。
概要
造血は比較的よく特徴付けられた発生システムですが、in vitroで血球形成を再現できないことは、関連因子の理解が不完全であることを示しています。人工多能性幹細胞(iPSC)ベースの造血モデルは、主要な発生因子と関連する生物学の解明に役立ちます。また、iPSCシステムは血液疾患の研究にも優れたモデルを提供しており、iPS細胞ベースの血液細胞は、翻訳および治療に関連のある試薬1,2,3,4を産生するために開発されています。シングルセル研究は、造血中に産生される細胞タイプを含む、iPS細胞ベースの発生生物学の研究に広く利用されています5。細胞亜集団間の関係を推測できないバルクRNAシーケンシング6と比較して、シングルセルモダリティは細胞の不均一性の評価を可能にし、細胞発生の同定と特性評価を容易にすることができる6,7。
iPS細胞から造血細胞を形成するには、原始線条、中胚葉、内皮状態を経て逐次分化し、造血性内皮細胞を形成する必要があります。造血性内皮細胞は、造血幹細胞および前駆細胞8の直接の前駆体である。これらの細胞型は、形態学的および細胞的特性が著しく異なります。 in vitro由来の造血細胞モデルのエピジェネティックなランドスケープと発生動態についての理解は限られていますが、これはiPS細胞システムの治療の可能性を最大限に引き出すために不可欠な知識です。多くの場合、細胞集団、転写活性、クロマチンランドスケープ、および不均一性細胞調製物間の発生を支配する調節メカニズムの同定を可能にするのは、シングルセル解析モダリティのみです。
シングルセルRNAシーケンシング(scRNAseq)とシングル核RNAシーケンシング(snRNAseq)の2つの方法論により、個々の細胞レベルでの転写に関する洞察を明らかにすることができます9。データの有効性と信頼性を左右する主な要因は、厳しい品質基準を満たすサンプルに対する妥協のないニーズです。これには、細胞/核密度、最適な生存率、および最小限の凝集に対する正確な要件が含まれます。単一原子核の調製は、技術的に困難な場合があります。以前に凍結保存された細胞の使用には、追加の課題が生じる可能性があります。
標準的なscRNAseqアプローチには、4つの重要な潜在的な制限があることに注目します。まず、細胞懸濁液を生成するための標準的なプロトコルは、凍結保存後に回収されたものではなく、新鮮な細胞または組織からの調製物を参照することがよくあります10。これにより、潜在的に価値のあるリソースの有用性が減少する可能性があります。第二に、多様な細胞タイプの解離効率は変動します。例えば、多くの免疫細胞は比較的容易に解離します。対照的に、間質細胞、線維芽細胞、および内皮細胞は、通常は細胞外マトリックスおよび基底膜に埋め込まれており、核の単離を複雑にする可能性のある独特の細胞特性を持っています11,12。これらの特性は、積極的な解離プロトコルを必要とする可能性があり、より繊細な細胞集団の構造的完全性を危険にさらす可能性があります。第三に、一部の細胞(例えば、巨核球)は直径が100μmを超えることがあり、いくつかの既存の商用シングルセルプラットフォーム13にとって困難をもたらす。さらに、不適切な取り扱いは、細胞単離の初期段階で細胞の損傷やストレス応答を引き起こす可能性があり、これには酵素による加水分解や機械的解離が含まれ、遺伝子発現プロファイルに影響を与える可能性があります11,14。
これらの理由および他の理由から、単一核アプローチは、単一細胞法の好ましい代替手段となり得る15。細胞膜と比較して核膜の優れた安定性を考慮すると、組織凍結保存16後も核膜は無傷のままであり得る。これにより、核抽出が容易になり、次世代のシーケンシングモダリティに適したサンプルタイプの多様性を高めることができます。第二に、核は機械的な摂動に対する抵抗性が高く、解離中の転写シフトが少なく現れる傾向がある14。したがって、核はRNAの安定性を高め、転写プロファイルの再現性を高めることができます。単一核法の3つ目の注目すべき利点は、細胞サイズの制約がないことと、心筋細胞や巨核球などのより大きな細胞に適用できることである12。第四に、核はマルチオミクス解析に適した基質として機能し、遺伝子発現、アクセス可能なクロマチン領域、およびその他のパラメータ17の統合解析からより広範な洞察を提供し、細胞の不均一性、発生、および機能状態18のより深い理解を可能にする。
造血器の発達過程でiPS細胞をプロファイリングすることにより、マルチオミクスのアプローチは、正常または病理疾患モデルにおける発生プロセスを定義するのに役立ちます。また、iPS細胞由来細胞を初代細胞や組織と比較することで、 iPS細胞モデルのin vivo 生物学に対する忠実度を評価することができ、iPS細胞モデルの改善や、血液形成を促進する新規細胞集団や因子の発見を促進することができます。
多くのグループが核の単離とその結果としての次世代シーケンシング解析に成功していますが、単一核ベースの解析に関心のある一部の研究室では、高品質の核の単離が依然として障壁となっています。この原稿では、以前に凍結保存されたiPS細胞由来細胞から高品質の核を単離するためのプロトコルについて詳しく説明しています。私たちは、接着性間質/内皮細胞と非接着性造血前駆細胞に焦点を当ててきましたが、これらは構造と内容に関して非常に異なる細胞タイプを表しており、次世代シーケンシングやその他の実験に適した高品質の核の回収率を高めるためのカスタマイズされた修正とトラブルシューティングが必要です。
プロトコル
1. 細胞の凍結保存
- 1 mLあたり>1 x 106 個の単離されたiPS細胞を、90%FBSおよび10%DMSOの1 mLで凍結します。クライオバイアルを-80°Cの凍結容器に入れて、凍結速度を下げ、生細胞の回収を最適化します(材料表)。かなりの細胞損失が予想されますが、これは培養条件や細胞の同一性によって異なります。
- -80°Cから24時間以内に液体窒素貯蔵に移動します。
2. 細胞の解凍
- 液体窒素貯蔵庫からクライオバイアルを取り出し、37°Cのウォーターバスで2分間解凍します。小さな氷の結晶がまだ見えるうちに水浴から取り出します。
- 細胞をクライオバイアルから空の15 mLチューブに移し、予熱した培地10 mL(RPMI 1640 + 10% FBS)を慎重に混合しながらゆっくりと加えます。400 x g で25°Cで3分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、2% FBS と 1 mM CaCl2 を添加した 1 mL の DPBS に再構成します (材料表)。1000 μLのマイクロピペットで3回ピペッティングして慎重に混合します。5mLのポリスチレン丸底チューブに移します。
3. 死んだ細胞の除去
- 細胞懸濁液1 mLに50 μLの死細胞除去カクテル(材料表)を加えます。50 μLのビオチン選択カクテルを細胞混合物に加えます。室温で3分間インキュベートします。これらのステップでは、細胞懸濁液に含まれるアネキシンV+ 死細胞をビオチンで標識します。
- 30秒間激しく渦巻くデキストランビーズは、ビオチンで標識された不要な細胞タイプの枯渇のために設計された(材料表)。100 μLのデキストランビーズを細胞懸濁液に加え、1000 μLのマイクロピペットで2回ピペッティングして混合します(材料表)。
- 2% FBSと1 mM CaCl2 を含む1.3 mLのDPBSを細胞懸濁液に加え、1000 μLマイクロピペットで2回ピペッティングして混合します。チューブを磁石(Table of Materials)に入れ、室温で3分間インキュベートします。
- 磁石とチューブを反転させて、濃縮された生細胞懸濁液を新しい15 mLコニカルチューブに注ぎます。400 x g で4°Cで3分間遠心分離します。 ほとんどの上清を取り除き、1 mLのDPBS + 0.04% BSAに再懸濁します。1000 μLマイクロピペットで3回ピペッティングして穏やかに混合します。
4. 原子核の分離
- 生細胞懸濁液を460 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引して、細胞ペレットが乱れないようにします。
- 氷上で冷やした調製したばかりの0.5倍溶解バッファー100 μLを加え(表1)、100 μLマイクロピペットで10倍ピペッティングして穏やかに混合します。氷上で3分間インキュベートします。
- 500 μLのチルドウォッシュバッファー(表2)を混合せずにチューブに加えます。600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
5. 原子核の洗浄と評価
- 上清を吸引し、500 μLの冷却洗浄バッファーを加えて、残りの無傷のペレットを混合せずに溶解します。600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 核ペレットを乱さずにすべての上清を取り除きます。
- 120 μL のチルド希釈核バッファーに再懸濁します (表 3)。40 μmの細胞ストレーナーを使用して細胞懸濁液をろ過します(材料の表)。
- 0.4%トリパンブルーで染色し、10倍顕微鏡で単離された核の品質を視覚的に評価します(材料表)。
6. 単離された核の処理
- 原子核を氷の上に保ちます。時間の経過とともに核の凝集が発生し、追加のろ過ステップが必要になる可能性があるため、すぐに次の処理に進みます。
結果
前述のプロトコルを使用して、凍結保存されたiPS細胞由来の接着性間質/内皮細胞および非接着性(浮遊性)造血前駆細胞から核を抽出しました。核分離手順の詳細な概略図を 図1に示します。
形態学的検査のために、単離された核をトリパンブルーで染色し、顕微鏡で可視化した。精密なマイクロ流体機器の詰まりにより、破片や凝集した核が高品質のデータを減少または生成するのを防ぐ可能性があるため、処理の直前に核形態学的検査を行うことが重要です。従来のキットプロトコルを使用して調製したサンプルから単離された核の顕微鏡検査では、可視化されたフィールドごとに破片と≥1核凝集体の存在が示されました(図2A-B)。これらのサンプルは、品質が劣ったため廃棄されました。
高品質の原子核は丸く無傷で、分析法の最適化後に観察されたような凝集は最小限またはまったくありません(図2C-D)。これらのサンプルには凝集体や凝集は観察されませんでした。これらの核は、下流の処理と分析をサポートするのに十分な品質と量を持っていました。同様のトラブルシューティングとプロトコールの最適化は、他の凍結保存された細胞タイプにも適用できる可能性があります。
図1:凍結保存された細胞からの核抽出を示す図。 凍結保存された細胞からの核単離に関与するステップを詳細に説明する視覚的描写。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:凍結保存されたヒトiPS細胞由来細胞から単離された核。 トリパンブルーで染色した接着性間質/内皮細胞から単離された核は、(A)小さな粒子と(B)核凝集体(大きな粒子)に大きな破片を示し、下流の分析を妨げています。ここで紹介した技術的な修正を行った後、(C)凍結保存されたヒトiPS細胞由来造血前駆細胞または(D)間質/内皮細胞集団から、下流の解析をサポートするのに十分な量で高品質の核を単離しました。参考までに、これらの非接着性造血前駆細胞は、4に記載されたように造血分化の9+8日目に採取され、付着性間質/内皮細胞は9+7日目に採取された。核の形態は細胞の種類によって異なる可能性があることに注意してください。スケールバー:100μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| バッファー調製 | |||
| 0.5X 溶解バッファー | 株式 | 最終的な | 2ミリリットル |
| 1X Lysis Buffer | 1倍 | 0.5倍 | 1 mLの |
| Lysis Dilution Buffer | 1 mLの | ||
| 溶解バッファー | 株式 | 最終的な | 2ミリリットル |
| BSAの | 10% | 1% | 200μL |
| ジジトニン | 5% | 0.01% | 4 μL |
| DTTの | 1000 mM | 1 mM | 2 μL |
| MgCl2 | 1メートル | 3メートル | 6 μl |
| NaClの | 5メートル | 10 mM | 4 μL |
| ノニデットP40代替品 | 10% | 0.10% | 20μL |
| ヌクレアーゼフリー水 | 1.67ミリリットル | ||
| RNase阻害剤 | 40 U/μl | 1 U/μl | 50μl |
| トリスHCl(pH7.4) | 1メートル | 10 mM | 20μL |
| Tween-20 (トゥイーン 20) | 10% | 0.10% | 20μL |
| Lysis Dilution Buffer | 株式 | 最終的な | 2ミリリットル |
| BSAの | 10% | 1% | 200μl |
| DTTの | 1000 mM | 1 mM | 2 μL |
| MgCl2 | 1メートル | 3メートル | 6 μL |
| NaClの | 5メートル | 10 mM | 4 μL |
| ヌクレアーゼフリー水 | 1.72ミリリットル | ||
| RNase阻害剤 | 40 U/μl | 1 U/μl | 50μl |
| トリスHCl(pH7.4) | 1メートル | 10 mM | 20μl |
表1:0.5x Lysisバッファーの調製。 この溶液は、ステップ4.2の核単離手順に指定されています。Lysis BufferとLysis Dilution Bufferを混合して、0.5x Lysis Bufferを調製します。各実験の直前に新しいバッファーを準備し、氷上に保管することが不可欠です。一部の細胞タイプのトラブルシューティングには、インタクトな核の単離を容易にするために、1倍、0.5倍、またはそれ以下の希釈倍の溶解バッファーが含まれる場合があることに注意してください。
| バッファー調製 | |||
| ウォッシュバッファー | 株式 | 最終的な | 4ミリリットル |
| BSAの | 10% | 1% | 400μL |
| DTTの | 1000 mM | 1 mM | 4 μL |
| MgCl2 | 1メートル | 3メートル | 12 μL |
| NaClの | 5メートル | 10 mM | 8 μL |
| ヌクレアーゼフリー水 | 3.40ミリリットル | ||
| RNase阻害剤 | 40 U/μl | 1 U/μl | 100μL |
| トリスHCl(pH7.4) | 1メートル | 10 mM | 40 μL |
| Tween-20 (トゥイーン 20) | 10% | 0.10% | 40 μL |
表2:洗浄緩衝液の調製。 この溶液は、核の単離に利用されます。これは、各実験の前に新鮮に準備し、氷の上に置いておく必要があります。
| バッファー調製 | |||
| 希釈核バッファー | 株式 | 最終的な | 1 mLの |
| DTTの | 1000 mM | 1 mM | 1 μL |
| ヌクレアーゼフリー水 | 924μL | ||
| 核バッファー | 20倍 | 1倍 | 50 μL |
| RNase阻害剤 | 40 U/μL | 1 U/μL | 25μL |
表3:希釈した核緩衝液の調製。 このソリューションは、手順 5.2 で使用します。各実験の前に新鮮な状態で準備し、氷の上に置いておく必要があります。
ディスカッション
プロトコル内の重要なステップ
急速に進化している現在の単一核ベースの次世代シーケンシングモダリティを成功裏に実装するためには、高品質の核を単離することが不可欠です。これらのアプローチ、特に凍結保存された標本に関心のある研究室には既存の障壁があることを認識し、私たちは以前に凍結した細胞に合わせた核分離技術を作成するつもりでした。凍結保存された検体からの核の単離は、臨床サンプルや希少なiPS細胞由来の細胞集団にしばしば必要となります。
溶解バッファーの希釈、溶解時間、ろ過頻度を特定の細胞集団に合わせて調整することが重要です。凍結保存されたヒトiPS細胞由来造血前駆細胞など、特に感度の高い細胞タイプは、1x溶解バッファーで1分以内に過剰溶解されることが観察されています。このような過剰溶解は、単に技術的または運用上の誤動作ではありません。むしろ、過剰溶解と凝集は、接着性核物質の漏れを示している可能性があります。堅牢な細胞骨格構造を持つ接着性の間質細胞および内皮細胞と、強力な細胞間接着を形成する傾向がある膜の場合、凝集した核を除去するために二重ろ過が必要でした。核骨材はマイクロ流体チャネルを妨害し、実験の完全性に具体的なリスクをもたらし、データ出力を妨げる可能性があります。
また、死細胞の除去ステップを組み込むことで、凝集や破片を制限しながら、無傷の核の回収率が劇的に向上することもわかりました。実験開始時にトリパンブルー染色に基づいて>70%の生細胞を含むサンプルを処理する必要がありました。すべてのバッファーを氷上に保管することも、生存率の維持に役立ちます。
手法の制限事項
記載されている方法は、iPS細胞由来の培養細胞タイプ4からの核回収を最適化するために設計されました。同様のトラブルシューティング手順が、iPS細胞誘導細胞だけでなく、他の凍結保存された細胞タイプにも及ぶ可能性がありますが、個々のサンプルや細胞タイプの特定のニーズを試験なしで予測することはやや困難です。サンプルや細胞の種類に関係なく、生存可能な全細胞が<5%残存する核調製を目指し、凝集を最小限に抑え、過剰に溶解した核を減らすことは、実験の成功と直接相関するはずです。
既存の方法に対する意義
翻訳関連のあるiPS細胞ベースの分化システムは、多数の細胞タイプと前駆細胞を作製することができます。このプロトコルは、核分離を最適化するための異なる方法論的要件を持つ模範的な細胞タイプとして、iPSC由来の付着性間質/内皮細胞および非接着性造血前駆細胞に焦点を当てています。このプロトコールは、タンパク質含有量、膜構造、細胞の硬直性に応じて単離法を微調整する必要があることを認識し、重要な発生段階を調べるために、他のiPS細胞由来の細胞タイプに適合させ、適用できると期待しています。しかし、ここで説明する方法論により、広範囲の凍結保存された細胞タイプから高品質の核を回収できる可能性があります。
開示事項
著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
著者らは、Jason Hatakeyama氏(10x Genomics)とDiana Slater氏(Children's Hospital of Philadelphia Center for Applied Genomics)の指導と提案に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(HL156052 CST)の支援を受けました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 細胞培養試薬 | |||
| ジメチルスルホキシド溶液 (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Cells | |||
| Induced pluripotent Stem | cells N/A | N/A | 本研究で使用したiPS細胞は、CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
| Cell Staining Reagents | |||
| Trypan Blue Solution | Corning | 25900CI | |
| strong>Dead Cell Removal Reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit | StemCell Technologies | 17899 | このキットは、ビオチンで標識された不要な細胞タイプを枯渇させるように設計されています。このキットには、デッドセルリムーバル(アネキシンV)カクテル、ビオチンセレクションカクテル、デキストランビーズが含まれています。このキットは、アネキシンVを使用してアポトーシス細胞の細胞膜の外皮にあるホスファチジルセリンを標的とし、不要な細胞をアネキシンV、ビオチン化抗体、および磁性粒子で標識し、EasySep磁石を使用してカラムなしで分離します。目的の細胞を新しいチューブに注ぐだけです。 |
| 素材 | |||
| 10 & micro;l マイクロピペット | ワード サイエンス | 470231606 | |
| 100 & マイクロ;l マイクロピペット | ワード サイエンス | 470231598 | |
| 1000 & マイクロ;l 拡張ユニバーサルチップ | オックスフォードラボ製品 | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 & マイクロ;l マイクロピペット | ワード サイエンス | 470231602 | |
| 2.0 ml 極低温バイアル | コーニング | 431386 | |
| 20 & マイクロ;l マイクロピペット | ワード サイエンス | 470231608 | |
| 200 & マイクロ;l マイクロピペット | ワード サイエンス | 470231600 | |
| 5ml ポリスチレン丸底チューブ | ファルコン | 352063 | |
| コーニング デッキワーク 0.1-10 & マイクロ;l ピペットチップステーション | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 & マイクロ;l ピペットチップステーション | Corning | 4144 | |
| カウンティングチャンバー | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 & micro;m | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1°C 凍結容器 | Nalgene | 51000001 | |
| 核単離試薬 | 核単離試薬には、Lysis Buffer, 洗浄バッファー、希釈核バッファー、および溶解希釈バッファー。これらのバッファーの構成は、表 1、2、および 3 にあります。当社の核単離法は、標準的なキットプロトコル(例:10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338])からの単離を改善しました。このプロトコールは、Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle、16 rxns(PN-1000283)など、いくつかの市販キットで使用できます。 | ||
| 死細胞除去キット | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 & micro;m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS ウシ血清アルブミン (BSA) ストック溶液 | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| 塩化マグネシウム (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| 塩化マグネシウム溶液、1 m | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385 | |
| Nuclease-Free水 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM9937 | |
| 核緩衝液 (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| プロテクター RNase 阻害剤 | Sigma | 3335399001 | |
| 塩化ナトリウム (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| 塩化ナトリウム溶液、5 M | Sigma | 59222C | |
| Trizma 塩酸塩 Soultion、pH 7.4 | シグマ | T2194 | |
| Trizma 塩酸塩 (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| その他の装置 | |||
| 自動セルカウンター | CytoSMART | 699910591 | |
| 顕微鏡 | Zeiss | Primostar 3 |
参考文献
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