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方法論記事

妊娠期から授乳期までのマウスの心電図と行動の解析

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DOI:

10.3791/66498

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2024年4月5日

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science and Biotechnology, Azabu University

この記事について

サマリー

妊娠から授乳までの母マウスの自律神経活動と詳細な母体行動の同時記録をテレメトリーシステムを用いて達成した。この方法は、妊娠から離乳までの母親の生理学的および行動的特性のダイナミクスを理解するのに役立ちます。

要約

母子関係の変化は、おそらく自律神経系のダイナミックな変化を伴っていると考えられる。自律神経活動の時間的測定は、ヒトの母親や乳児で行われてきましたが、長期的な変化の解析は未だに解明されていません。マウスの母親は、子犬と社会的な絆を築き、妊娠期間や授乳期間が短いため、妊娠から子育てまでの生理的変化の検討に有用です。そこで、テレメトリーシステムを用いて、自律神経系の変化とマウスの母親の行動を測定しました。今回の結果から、母親の動きや分娩に関係なく、心電図(ECG)を安定して記録できることが示されました。心電図解析では、妊娠から授乳期にかけて心拍数が徐々に減少し、子犬が成長するにつれて交感神経活動が急激に増加したことが示されました。さらに、ホームケージ内での行動と心電図の同時記録により、行動が心電図に及ぼす影響を理解することができ、各行動における自律神経活動の特徴を明らかにすることができました。このように、本実験手法は、妊娠から子育てを通じて母親の生理特性がどのように変化するかを理解するのに役立ち、子犬の健全な発育をサポートします。

概要

母子関係は、子孫の将来に大きな影響を与えるため、さまざまな動物種によって確立された関係の中でも独特です1。人間の場合、子供の発達と内的/外的行動は、虐待とネグレクトの程度だけでなく、子育てスタイルにも影響されます2,3。同様に、げっ歯類では、母親の行動の質が子犬の発育と行動に大きな影響を与えます4,5,6。したがって、母親の養育行動の詳細な追跡と調査は、子孫の発達と健康的な支援における個人差のメカニズムについての洞察を提供することができる。

行動学的および生理学的研究は、哺乳類の母親が妊娠から授乳期にかけて動的な行動的および生理学的変化を受けることを示しています。雌の哺乳類が妊娠すると、エストロゲンや他のホルモンの変化の分泌が母体の行動に影響を与える7。子孫が成長し、授乳の頻度が減少するにつれて、ホルモン分泌は妊娠前の状態に向かって動的に変化し、母親の行動の発現に終止符を打つ8,9,10。これらの知見は、哺乳類の母親が妊娠中や授乳中に経験する変化には、内分泌系と母性行動、および子孫発生との間の相互作用が重要な役割を果たしていることを示唆しています。

妊娠から授乳期までの哺乳類の母親の行動的および生理学的変化は、内分泌系だけでなく自律神経系にも密接に関連しています11,12。ヒトの研究は、母親と乳児の接触が母親と乳児の両方の自律神経系に変化を誘発することを示唆している13。いくつかの研究は、人間の母親と乳児の心電図(ECG)と心拍変動を測定し、それぞれの行動が他の行動の心拍数とRR間隔を変化させることを示しています14,15,16。しかし、自律神経系、母性行動、児子発生の3つの因子が、妊娠から授乳期にかけてどのように相互作用するのかは明らかではありません。また、ヒトの授乳期間は約2年であるため、ヒトにおけるこれらの相互作用を長期間にわたってモニタリングすることは困難です。

このような研究では、人間の代わりにげっ歯類がよく使用されます。げっ歯類の自律神経系は、麻酔下または子犬から分離したときに、不安定な記録や測定装置の損傷を防ぐために測定されています。したがって、測定は行動制限された状況下では一時的なものとなる17,18,19。ネズミが自由に動き回り、他者とコミュニケーションをとることができる環境で自律神経系を観察することは不可欠であり、母親と子犬の相互作用は母親の行動や生理機能を変化させる可能性があるためである8,9,10,15。

この実験方法は、母親が自由に動くことができるように開発されました。この方法では、妊娠中の母親に心電図テレメータを皮下装着することで、機器の損傷を防ぎ、妊娠から授乳までの心電図を安定して長期間記録できるようにしました。マウスの母親は、自宅のケージで一般的な行動(自己グルーミング、食物摂取など)と通常の母親の行動を示すことができます。したがって、各動作とECGを同じマウスで簡単に観察および比較できます。ドライブレコーダーは、マウスの行動を4週間にわたって24時間記録しました。この実験プロトコルにより、妊娠から出産期までの自律神経活動と行動のダイナミックな変化を追跡することができました。

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プロトコル

すべての手続きは、麻布大学倫理委員会(#210319-30)によって承認されました。本研究では、妊娠14日目(GD)のC57B/6Jマウス(体重22g以上)を用いた。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。本試験に必要な試薬および機器は、 材料表に記載されています。

1. 実験の準備

  1. パネルヒーターの電源を入れ、アルミホイルで覆います。70%エタノールですべての表面を拭きます。
  2. すべての手術器具(ハサミ、鉗子、細いピンセット、ピンセット)は事前にオートクレーブ滅菌されています。
  3. 滅菌縫合糸を希望の長さに準備し、準備しておきます。
  4. 麻酔マスクをゴム製のマスクで覆い、無菌性と患者の快適性を確保します。
  5. マウスの生体電位テレメーター(図1A)に異常や損傷がないか、記録可能なコンピューターにインストールされたtBaseおよびLabChart(生理学的データ分析ソフトウェア)アプリケーションを使用して検査します。

2.テレメータ埋め込み

  1. マウスを4%イソフルランを含む導入麻酔ボックスに入れます。
  2. 麻酔の手術面を達成した後、マウスをパネルヒーターの腹臥位に置きます。麻酔マスクをマウスに置き、イソフルランレベルを1%〜2.0%、酸素流量を0.5〜2L / minに保ちます。
    注:このプロトコルでは、胎児への影響と行動観察を考慮して、鎮痛薬は使用されませんでした。
  3. バリカンを使用して耳の間の毛皮を取り除き、ヨウ素ベースの消毒剤と70%アルコールを交互に使用して皮膚を3回消毒します。
  4. 麻酔の手術面を確認するには、マウスの後足のつま先をピンセットでつまみます。はさみを使用して耳の間の皮膚に切開(2〜3 cm)を行います。切開部に鉗子を挿入して、首と腹側の周りの皮膚と筋肉を分離し、腹側にテレメトリーの配置専用のスペースを作ります。
  5. テレメーターを耳の間の切開部に挿入し、腹側スペースに置きます。
  6. 鉗子を使用して、正と負のリード線を転がして束ねます。リード線をネックスペースに配置します(図1B)。
  7. 13mmの針と20cmの縫合糸を使用して、リード線が損傷しないように注意しながら、切開部を縫合します。
  8. マウスを仰臥位に置き、バリカンで鎖骨の周りの毛皮を摘み取ります。ヨウ素ベースの消毒剤と70%アルコールを交互に使用して、皮膚を3回消毒します。
  9. 鎖骨の皮膚の周りに小さな切り込みを入れ、首の皮膚から筋肉を分離します。鉗子を使用して首の後ろから正と負のリード線を抽出します。
  10. 鉗子を使用して唾液腺を分離し、鎖骨から始まり首の両側を斜めに移動する胸鎖乳突筋(SCM)の「V字型」の外観を露出させます(図1C、D)。
  11. 負のリード線の長さを調整して、鎖骨近くのSCMに到達します。負極リード線からリード線チューブを慎重に取り外し、細いピンセットを使用して内部のコイル状のステンレス鋼電極が引き伸ばされていることを確認します。
  12. 10cmの縫合糸で縫合針(7mm)をSCMのV字曲げに通し、ループを作ります。負のリード線からステンレス鋼電極をこのループに通し、鎖骨近くのSCMの下に配置します。
    1. SCMの損傷を避けるためにループを軽く結び、3回繰り返してステンレス鋼電極を固定します。2番目の縫合糸をSCMの頭蓋側に配置し、負のリードのチューブの周りに結ぶことにより、負のリードをさらに固定します(図1E)。
  13. 剣状突起の周りを切片化し、剣状突起から鎖骨までの筋肉から皮膚を慎重に分離します。
  14. 正のリード線を伸ばして、剣状突起に到達します。マイナスリード線と同様に、プラスリード線からリードチューブを取り外し、細いピンセットを使用して内部のコイル状のステンレス鋼電極が引き伸ばされていることを確認します。
  15. 18 Gの針を使用して剣状突起の周りの筋肉の下にトンネルを作り、次にステンレス鋼電極を針に入れて剣状突起の周りの筋肉に通します。
  16. 針を抜いた後、コイル状のステンレス鋼電極を剣状突起の周囲の筋肉に軽く縫合します (10 cm 縫合糸でステッチ針 (7 mm) を使用します (図 1D)。ポジティブリードをさらに固定するには、2番目の縫合糸を剣状突起の頭蓋側に配置し、ポジティブリードのチューブの周りに結びます。
  17. 縫合糸の長さが20cmのステッチ針(13 mm)を使用して、すべての切開部を閉じます(図1E、F)。
  18. 移植後、マウスを清潔なケージに置き、マウステレメトリのレシーバーとして機能するtBase上にケージを配置します(図1G)。記録可能なコンピューターの電源を入れ、インストールされているデータ分析ソフトウェアアプリケーションを使用してECGデータを収集します。ECGデータが正常な波形を表示していることを確認します(図2A、B)。
    注意: 異常な波形やノイズが発生した場合( 図2Cを参照)は、麻酔下で負のリード線と正のリード線を再度取り付けてください。
  19. 2日間の回復期間中は、ケージの底にウォータージェルと餌を置いて、マウスが適切に治療されていることを確認してください。この復旧期間中は、ホームケージの動作のみをドライブレコーダーで記録します。

3. 妊娠から離乳までの心電図とホームケージ行動の記録

  1. 暗い段階では、ドライブレコーダーはライトなしでは機能できないため、赤いライトを点灯します。ドライブレコーダーをホームケージのそばに配置して、動作を記録します。記録可能なPC上のLabChartアプリケーションを使用してECGを記録します。ECGデータを収集する前に、LabChartでECGのサンプリングレートを確認します。
    注:このプロトコルでは、ドライブレコーダーはどこにでも配置できるため、ドライブレコーダーが選択されました。また、ドライブレコーダーはビデオカメラに比べて広角で録画でき、データ保存容量も少なくて済みます(例えば、ドライブレコーダーで24時間録画すると約70GBかかります)。このデモでは、データ解析ソフトウェアのECGのサンプリングレートを1 k/sに設定しています。
  2. ドライブレコーダーの電源を入れた後、コンピューターでLabChartを起動して、動作と心電図を記録します。
    注:このデモンストレーションでは、マクロを使用してECGを継続的に記録し、2時間ごとにファイルを自動的に保存しました。この反復的なプロセスは、実験全体を通して実行されました。さらに、記録目的で256GBのSDカードが選択され、1日あたり約24時間のデータ収集が可能になりました。
  3. マウスに分娩や身体の異常がないか確認し、ドライブレコーダーや記録用パソコンからデータをサンプリングします。マウスが子犬を出産した日は、出生後日(PD)0と見なされます。出生後毎日子犬の体重を測定します。
    (注)本研究では、ドライブレコーダーからの録画映像と録画可能PCからの心電図データファイルを毎朝7時30分から8時30分にかけて収集しました。また、複数の子犬が母親に触れることによる振動による心電図音を防ぐため、子犬は4匹(半分はオス、残りの半分はメス)に淘汰されました。
  4. マウスを確認してデータを収集したら、すべてを元の位置に戻します。ドライブレコーダーと記録可能なコンピューターの電源を入れます。LabChartアプリケーションを起動します。
    注:マクロを使用してECGを記録する場合は、マクロボタンをクリックし、管理オプションから実行ボタンを選択してマクロを初期化します。
  5. 週に一度、ケージを新しいものと交換してください。このプロセスでは、寝具を含め、その半分は以前に使用され、残りの半分は新しいものです。
    注:データサンプリングとマウスチェックを含むこのプロセスは、GD17から出生後(PD)21まで繰り返されました。

4. 心電図の解析

  1. ECGデータの解析には、データ解析ソフトウェアを使用します。 LabChart を起動し、記録期間 のデータファイル を開きます。心拍変動(HRV)を分析するには、 HRV ボタンをクリックして、心拍検出設定を調整します。
    注:このデモでは、 カスタム 設定を選択し、検出調整のために最小ピーク高さを1.2に変更します。
  2. 設定を調整したら、view すべてのビートを削除し、ノイズデータを削除します( 図2Cを参照)。
    注意: R波が検出されない場合は、 HRV ボタンを使用して追加または変更します。
  3. HRVボタンをクリックして、ビート分類器ビューを選択します。ビート分類子ビューですべてのビートを選択し、HRV ボタンからレポート ビューを選択します。レポート ビューからデータをコピーして、Excel に貼り付けます。
    注: 表1に示すように、HRVの結果は、データ解析ソフトウェアを通じて時間領域とスペクトル領域の両方を表示し、観察を可能にします。

5. ホームケージの行動のエトグラムの分類

  1. Review すべての録画されたビデオをチェックして、暗い段階で赤いライトが点灯しない、ドライブレコーダーが機能しないなどの異常がないか確認します。
    注意: ビデオはECGと同じ方法で記録され、ビデオクリップは2時間ごとにキャプチャされます。
  2. 母親の行動時の姿勢、行動に費やした時間、行動が発生した場所(表2)などのパラメータでエトグラムを分類し、ドライブレコーダーから映像を観察する。

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結果

妊娠中のマウスにテレメータを埋め込んだ後、妊娠から授乳までの心電図を家庭用ケージで記録しました。サンプリングレートは1k/sに設定しました。概日リズムの影響を避けながら、母マウスの各生理状態の心電図を比較するために、23:32から23:42までの10分間のGD17、分娩、PD0、および2時間のデータファイル(図3、 表1)のデータを解析しました。23:32から23:42までの時間は、分娩中の最初の子犬の誕生前の10分を表しているため、選択されました。この特定の期間は、筋肉の収縮が存在した分娩中にデータ分析を実行する可能性を実証するために選択されました。すべての分析フェーズで、マウスは一般的な行動(飲む、掘る、食べ物を食べる、自分でグルーミングする)と母親の行動(巣を作る、舐める/グルーミング)の両方を示しました。これは、 表2にリストされている16個のエトグラムのうち6個から観察されました。

母親の心電図は、胎児が体内にいるGD17(

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ディスカッション

この方法では、テレメータを妊娠マウスに埋め込むことで、妊娠から授乳まで同じマウスで心電図を連続的に追跡することができた。マウスは、GD17からPD21までのすべての解析期間(23:32-23:42)で覚醒状態を示し、動きを含むエトグラムを示しました。また、今回の結果では、妊娠から授乳にかけて心拍数が徐々に減少していることが示されました。この減少は、いくつかの研究が血流の増加により妊婦の心拍数が増加することを示しているため、心拍数の正常化によるものと考えられています11,12。

さらに、交感神経活動は、同じマウスでPD0からPD21に増加しました。しかし、GD 17からPD 0まで交感神経活動または副交感神経活動に変化はなかった。妊娠中の交感神経データと同様に、以前の研究では、妊娠4日目から18日目までのラットの交感神経および副交感神経活動の変化は、処女ラットのものと比較して報告されていません

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

本研究は、日本学術振興会科研費(課題番号 JP 21H04981 and 30974521)および麻布大学ダイバーシティ・エクイティ&インクルージョンセンターの支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24時間繰り返しタイマーパナソニックWH3311BP
5-0 ナイロン縫合糸夏目製作所Co-23s-N2
酔ボックス夏目製作所KN-1010W110×D110×H110mm
酔マスク夏目製作所KN-1019-1
酔器夏目製作所KN-1071-E
C57BL6/Jマウスアジャパン株式会社14日
クリップライト矢沢製作所CLX60X02WH
コンフィギュレーターシステムアドインスチュメンツTR190
ドライブレコーダートランセンドTS-DP250A-32G
フードホルダークレアジャパン株式会社CL-2802
イソフルランFujiFilM099-06571
LabChart Pro V8AdinstumentsMLU260/8
LabChart8AdinstumentsMLS060/8
マウス生体電位テレメーターAdinstumentsMT10B
針 18G 1 1/2テルモNN-1838R
パネルヒーターSANKO4976285145407
PowerLab 4/26AdinstumentsPL2604
記録パソコンマウス パソコンK7-H
赤色電球ELPALDG1R-G-GWP254
ラバーマスク夏目製作所KN-1019-M
SDカード(256GB)トランセンドTS256GUSD350V24時間を記録できます
合針 13mm夏目製作所C-24-540-NO.0
合針 7mm夏目製作所C-24-540-NO.0000
tBaseAdinstumentsMT110
麻麻 麻 クレ 妊娠マウス マウス 約 縫 縫

参考文献

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