著者らは開示するものは何もない。

使い捨て診断用マイクロ流体アプリケーション

このインタビューでは、博士Klapperichは、熱可塑性マイクロ流体デバイスの作製と新しい診断薬の開発への応用について説明します。

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new ...

私の名前はCatherine CloudBridgeで、ボストン大学で製造、工学、生物医学工学の教授をしています。また、私はBiomedical Micro Devices and Microenvironments Laboratoryの所長も務めています。私たちは主に、リソースが限られた設定のアプリケーションに対する使い捨て診断の作成に取り組んでいます。ですから、私たちはマイクロ流体工学を使って、これらのデバイスを作っています。私たちは、実は2つの研究分野に興味を持っています。主に、生体分子や細胞がプラスチックポリマー表面とどのように相互作用するかに注目しています。それが私たちの主要な傘です。その作業は、使い捨て診断用のマイクロ流体アプリケーションに具現化されています。ですから、研究室では、マイクロ流体デバイスを作っています。私たちが使用しない熱可塑性材料では、通常はPDMSを使用しますが、これはほとんどの人が実験室でマイクロ流体工学を作るために使用するゴム状の材料です。私たちは熱可塑性プラスチックでデバイスを作っています。私たちは、これらの熱可塑性デバイスを使用して、中央集権的な実験室から遠く離れたフィールドで分子生物学を行えるように、マイクロスケールで分子生物学を行うことに興味を持っています。研究室では、小さなプラスチックカードを作っており、その小さなプラスチックカードの中には固相抽出カラム、細胞溶解カラム、ミキシングカラムがあります。また、検出技術としてチップ上でポリメラーゼ連鎖反応を行います。これらすべてが小さなデバイスに統合されており、最終的には、長期的な研究の見通しでは、ハンドヘルドでフィールドや、すべてのアテンドセンター、フュージョン、加熱インキュベーターなどを備えた大規模な実験室が利用できない環境に実施できる統合デバイスになります。ですから、理想的には、血液尿便や鼻咽頭ぬぐい液のような人間のサンプルから始められるようにしたいと考えています。これは粘液です。そして、チップの出力には、誰かが特定の微生物に感染しているかどうかが「はい」または「いいえ」かどうかの答えがあります。そのための方法は、患者のサンプルに含まれる特定の微生物の微生物に応じて、その特定のDNAまたはRNAを探すことです。したがって、到着する技術的な課題は、主にその方程式のサンプル調製側にあります。ですから、血液や便、尿から始めるときは、粒子の可能性があるものや、PCRやその他の増幅技術に対する阻害剤がたくさん含まれている乱雑なヒトサンプルがある状況から抜け出さなければなりません。そして、最終的には、非常にきれいで逃れた核酸のサンプルを採取し、それを使って特定のDNAやRNAを増幅したり、探している微生物がそこにいたかどうかを教えてくれるようにしたいのです。そのため、これらのサンプルをクリーンアップするには、いくつかのことを行う必要があります。まず、サンプルをろ過する必要がありますが、これにはサンプルによっては、サンプルがチップ上に送られる前にコースろ過やクイックスピンステップが含まれる場合があります。ですから、私たちは常に臨床医からのサンプルから始めるようにしています。ですから、尿や便、鼻咽頭スワブを使って、私たちの目標は、臨床医が通常どおりに仕事をし、通常どおりにサンプルを採取することです。そして、そのサンプルを取り出してチップに載せます。したがって、そのステップでさらにろ過を行う必要がある場合、そのろ過はチップ内で行われます。2番目のステップでは、分子アッセイを行っているため、そのサンプルに含まれる細胞と微生物を溶解する必要があります。そこで、通常は細孔径の小さいフィルターにサンプルを強制的に通す溶解ステップを実行します。そのフィルターには、鋭いエッジを持つカーボンナノチューブのようなナノ粒子も含まれていることがあり、これを使用して、私たちが扱っているグラム陽性菌であるCディフィシルのようなより堅牢な細胞壁を持つ生物の一部を引き裂くことができます。そのため、より堅牢な溶解カラムが必要です。しかし、通常はチップ内で化学的溶解と機械的溶解を組み合わせて行います。その後、ライセートを採取し、精製した核酸を抽出することが目標です。そこで、溶解液をマイクロ流体チップ内で共振する固相抽出カラムにライセートを通します。そして、その固相抽出カラムはプラスチックでできており、すでに製造された後、マイクロ流体チャネル内で光開始化学を使用して作られます。また、通常はシリカ粒子を含浸させるのは、核酸を結合して放出するためです。場合によっては、mRNAに特異的に結合して放出したい場合はオリゴDTビーズを、特定のタンパク質に結合して放出したい場合は特定の抗体を持つビーズを組み込んでいます。そして、これらすべてを行う抽出カラムを作ることができます。しかし、今日は、シリカビーズを使用してサーゼ抽出カラムを作成する方法を紹介します。その後、ライセートをシリカカラムに通すと、マクロスケールの実験室で狂言キットが機能するのと同じように機能します。次に、細胞溶解物やヒトサンプルの残りの部分に含まれる不要な炭水化物や脂質など、不要なものをすべて取り除きます。そして、最後の最後には、水のことを言っています。そして、これらのマイクロスケール固相抽出カラムの優れた点は、通常1〜5マイクロリットルのオーダーの非常に少量の水で溶出できることです。そして、私たちが入れた核酸のほとんどすべてを取り戻しています。効率は約70〜90%で、そのチャネルから最初の10マイクロリットルが戻ってきます。ですから、2〜10マイクロリットルで2回洗い流すと、そこに置いた核酸のほとんどすべてが戻ってきます。つまり、PCR可能なクリーンなサンプルであるだけでなく、標準的なベンチトップキットよりもはるかに高濃度のサンプルでもあります。したがって、これらすべてのサンプル調製技術の最終目標は、人々が行った他の作業の一部と互換性のあるものを作ることです。チップ上でPCR増幅を行うことができることを示す、現場での非常に素晴らしい研究。逆転写酵素反応は、RNAウイルスを扱っている場合や、遺伝子発現実験を行いたい場合に、チップ上で行うことができます。当社のサンプル調製技術は、チップ上のPCRと直接組み合わせることができるため、ベンチでクリーンアップやサンプル調製を行う必要はありません。そして、小さなチップでマルチプレックスPCRを行うために必要な微量を得るために必要な濃縮ステップも必要になります。そこで、今日ご紹介する実験では、PDMSではなく熱可塑性プラスチックで作られたマイクロ流体チップの組み立て方をご紹介します。そのため、通常使用されるものとは少し異なる製造プロセス、つまりチップのシール方法が必要です。そして、チップ内部で光による化学反応をどのように行い、細胞溶解と固相抽出の両方に使用されるポリマーモノリスを作るかです。そして、そのプロセスの最後には、現在、ラボではモジュール式のプロセスですが、それらは統合されており、最終的には水中の核酸、RNA、DNAの高濃度サンプルが得られ、その後、微生物や感染の同定が行われるPCRモジュールまたは別の増幅モジュールに下流に行くことができます。現在、ボストン・メディカル・センターからインフルエンザに感染しているかどうかの患者からヒトサンプルを収集し始めています A.So インフルエンザの季節なので、これらのサンプルを収集しています。そして、研究室では、インフルエンザA型に感染しているかどうかを調べるためのゴールドスタンダードアッセイを行っていますが、これは基本的に培養アッセイであり、実施には数日かかります。そして、それと並行して、私たちは現在、これらのサンプルをチップのモジュールに通しています。そこで、それらを溶解カラムに通し、固相抽出カラムに通し、次にPCRを実行して、ゴールドスタンダードの方法と比較してどれだけうまくいくかを確認します。それが今の私たちの段階です。これらの実験がうまくいけば、今後4年から6年の間に、インフルエンザA型の完全な分析装置が統合され、クロストリジウム・ディフィシルと便のサンプルに取り組むことになると思います。そして、私たちは、デバイスだけでなく、アッセイも統合することに非常に近づいています。そのため、アッセイの開発とチップ設計の両方を連携して行う必要があります。ですから、特定のアプリケーションの場合、ベッドサイドにたどり着くことは、実際にはターゲット指向のプロセスです。ベッドサイドでの使用にチップを最適化するためには、まず使用するサンプルと探している微生物を知る必要があります。ですから、それをプロトタイプで実現するのは、それほど遠くないと思います。それが私たちの最終目標なので、そこにたどり着けることを願っています。

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JoVE Journal

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Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

Boston University.  このインタビューでは、博士Klapperichは、熱可塑性マイクロ流体デバイスの作製と新しい診断薬の開発への応用について説明します。

使い捨て診断用マイクロ流体アプリケーション

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