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方法論記事

成体ゼブラフィッシュにおける腹腔内注射技術により、体の損傷とそれに伴う死亡を最小限に抑える

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DOI:

10.3791/66500

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2024年3月29日

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 2Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic, 3Cardiovascular Surgery Department, Guilin Hospital of 2nd Xiangya Hospital, Central South University, 4Cardiovascular Surgery Department, 2nd Xiangya Hospital, Central South University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

成体ゼブラフィッシュにおける新しい腹腔内(IP)注射法について記載する。ドキソルビシンなどの有毒化合物を取り扱う場合、この手順は以前に報告された2つのIPメソッドよりも効果的です。この手法は、ゼブラフィッシュモデルの経験が限られている研究者が簡単に採用できるように設計されています。

要約

遺伝的にアクセス可能な成魚のゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、心筋症などのヒトの疾患を研究するための貴重な脊椎動物モデルとして採用されています。腹腔内(IP)注射は、治療効果の試験やドキソルビシン誘発性心筋症(DIC)などの疾患モデルの生成のために、化合物を体内に送達する重要な方法です。現在、IPインジェクションには2つの方法があります。どちらの方法も、ドキソルビシンなどの有毒化合物の取り扱いには制限があり、体型に深刻な損傷を与えたり、魚を死に至らしめたりする副作用が現れます。これらの欠点は、広範な研究者のトレーニングによって克服できますが、副作用が最小限の新しいIP注入方法が望ましいです。ここでは、毒性化合物を扱える独自のIP注入方法について報告します。心機能が一貫して低下すると、魚の死を招くことなく結果を得ることができます。この技術は、ゼブラフィッシュの成魚の経験がほとんどない研究者でも簡単に習得できます。

概要

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、ヒトとの高い遺伝子・臓器相同性、体外受精、遺伝子操作の容易さ、早期成熟期の体内透明性など、ヒトの疾患研究の実験モデルとして注目されています1。ゼブラフィッシュの胚や幼虫のために直接水に薬を投与する単純なプロセスとは異なり、成体のゼブラフィッシュに薬を投与することは、より複雑で困難な試みを提示します2。

成魚では、化合物は、水中への直接投与などの受動的な薬物送達技術、または強制2のような経口薬物送達方法によって送達することができる。他のアプローチには、魚介類を化合物でコーティングし、続いて魚に給餌すること3、および眼窩後または腹腔内注射4,5を含む、所定の濃度での水不溶性薬物の直接投与が含まれる。腹腔内投与は、その明確な薬物動態学的利点により、疾患モデルのin vivo研究に好まれます6。この方法は、高い薬物濃度と腹腔内の長い半減期を提供し、薬物送達のための効果的な経路を提供する7,8。このアプローチは、最適な薬物の吸収と分布を確保するために、研究環境で一般的に利用されています9。注射ベースの方法は、1回の投与には効率的であることが証明されていますが、長時間の繰り返しの注射は、しばしば体の損傷や慢性感染症につながります2。

現在、成魚のゼルバフィッシュ4,10にIPインジェクションを行うには2つの方法があります。しかし、どちらの方法もドキソルビシンのような有毒化合物を送達する際には限界があり、体型や魚の死亡率に深刻なダメージを与えることになります。副作用は、データの解釈を著しく複雑にする可能性があります。これらの課題は広範なトレーニング10で対処できるかもしれませんが、副作用を最小限に抑える新しいIP注入方法が明らかに必要です。

ここでの目標は、ドキソルビシンを成体ゼブラフィッシュに効果的に送達するために最適化された新しいIP注射法を開発し、信頼性の高いドキソルビシン誘発性心筋症(DIC)モデルの生成を促進し、身体の損傷とそれに伴う死亡率を最小限に抑えることです。

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プロトコル

実施されたすべての手順は、メイヨークリニックの施設内動物管理および使用委員会によって承認され、「実験動物のケアと使用に関するガイド」(National Academies Press、2011年)に概説されている基準に準拠していました。この研究に参加したすべてのゼブラフィッシュは、野生インド核型(WIK)株に属しています。本試験に使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.ドキソルビシン原液の調製と保管

  1. ドキソルビシンストックは市販の供給元から入手してください。
    注:ドキソルビシンは光感受性があるため、粉末状にして入手し、不透明な容器に保管して光への曝露から保護します。薬品フード内でDox粉末調製のすべての手順を実行します。
  2. Dox粉末を蒸留水に完全に溶解し、最終濃度5 mg / mLのストック溶液を調製します。
  3. ストックを1.5mLのチューブに分割して分注します。
  4. チューブをアルミホイルで包み、光にさらされないように保護します。
  5. アリコートDox溶液は、短期保存(<1か月)の場合は4°Cで、長期保存の場合は-20°Cで保存します10。

2.魚を体重に応じてグループ化します

  1. BW差が10%未満の魚をグループ化して、その後の注入に備えます。
    注:このフェーズでの労力を節約するために、BWの変動が10%未満の魚は同じサイズとして分類されます。
  2. 注入する前に、魚を24時間絶食させます。
  3. 0.16 mg / mLのトリカインを含む胚水を使用して魚に1分間麻酔をかけます。.
  4. トリカインで魚を水から取り出し、魚の体の両面をきれいな濾紙で軽くたたいて余分な水分を取り除きます。
  5. 各魚のBWを測定して記録し、その後、魚を新鮮なシステム水で満たされた回収タンクに速やかに戻します。
    注:Dox注射は、生後3か月に達した後に魚に対して行われました。この研究では、研究者は生後3か月から10か月の魚を利用しました。成熟したWIK株ゼブラフィッシュのBWは、0.2 gから0.5 gまでさまざまです。5分以上続く長時間の麻酔とそれに続くドックス注射は、魚の死亡率を高くしました。

3.注射針と注射ステーションの準備

  1. 目標用量の20 μg/gを達成するためには、平均体重に基づいて各魚に必要なDox原液の注入量(例:5 mg/mL)を決定します。
  2. 次の式を使用して、射出量を計算します。
    注入量計算式、魚の投与量、濃度、科学図。
  3. 1x Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)を添加して、ステップ1で計算したDox溶液を注射用に希釈し、総容量5 μLにします。
    注:魚のBWに基づいて各グループのバルク溶液を利用し、実験の過程で注射用の溶液が不足しないように、各グループにさらに3匹の魚を含めます。
  4. チューブを軽くたたいてから、最高速度で短時間微量遠心分離し、室温で10秒間溶液を回収します。
  5. 調製した溶液を氷の上に置き、光にさらされないようにシールドします。
  6. きれいな100mmシャーレとスポンジを解剖顕微鏡の下に置き、ピントを調整します。
    注:スポンジには長さ4cmの溝があります。スポンジの弾性収縮は、魚を支え、魚の体を所定の位置に保ちます。スポンジは再利用できます。
  7. 10 μLマイクロシリンジに34 Gの斜め針を取り付けます。
  8. 1x HBSSバッファーで針を洗い流し、気泡を取り除き、シリンジから潜在的な詰まりを取り除きます。
  9. ステップ4で調製した注入用溶液の5 μLを測定します。

4. IP Doxインジェクションの手順

  1. 成魚を0.16 mg / mLトリカインを入れた水に1分間入れて、意識不明の状態を誘発します。.
  2. 腹部を上に向けて、埋め込まれたスポンジの溝に魚を置きます(図1A)。
  3. 胸鰭の中点から心腔の後側に向かって、0°に近い角度で針を挿入します(図1B)。
    注:処置中は心臓との接触を避けてください。
  4. 針を尾に向け、銀色の皮の下に入ります。
    注意: 針を銀色の肌に近接して配置し、引っかき傷やピアスがないように注意してください。
  5. 手術全体を通して腹腔内の針先を監視します(図1C)。
    注意: 肝臓、腸、水泳用膀胱、およびその他の臓器に損傷を与えないでください。針が腸の端、総排泄孔の近くに到達することを確認します。
  6. 5 μL Dox溶液を徐々に均一に分注し、その後、漏れを防ぐために元の経路に沿って針をゆっくりと引き抜きます(図1D)。
  7. Dox溶液の赤色を観察することにより、腹腔内のDoxの存在を監視します(図1E)。
  8. 注入した魚を新鮮なシステム水で満たされたきれいなクロッシングタンクにすばやく移動して、魚が回復するのを助けます。
    注:注射の合間に、針を1x HBSSバッファーで1回洗い流します。

5. 注射後の魚の管理

  1. 注射後、魚を循環させてシステムに戻します。
  2. 注入されたすべての魚をさらに24時間速くして、回復を促進します。
  3. 最初の1週間は、魚から目を離さないでください。他の魚に感染しないように、死んだ魚をできるだけ早く取り除いてください。
    注:最初の24時間以内の魚の死亡は、注射または長時間の麻酔による身体的損傷が原因である可能性があります。魚の数を記録して生存曲線を生成します。
  4. 心エコー検査を実施して、注射後 56 日で Dox 注射された魚の表現型を 11.
    注:HBSS溶液を注入する対応する対照群の条件と手順の均一性を確保します。

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結果

これまで、成体ゼブラフィッシュにおけるドキソルビシンの投与には、2つの腹腔内(IP)法が用いられていました4,10。方法Iは、Kinkelらによって記述されたクラシックIP注射法としても知られています4、腹部を上に向けて、針を骨盤鰭間の正中線に対して45°の角度で挿入しました。方法II、またはMaら10によって記載された代替IP注入法では、針は魚の背側を通して挿入されました(図2A(i、ii))。これに対し、本手法IIIには大きく2つの変更点があります。まず、注射の位置を変更し、腹部を上に向けて、針を胸鰭の中点から腹部に向けています。侵入部位は、この領域の自然の穴によって導かれます。次に、針の角度を小さくし、0°に近づける必要があります(図2A(iii)、

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ディスカッション

新しいIPインジェクション方法は、既存の2つのIPインジェクション方法4,10とは異なり、以下の明確な特徴によって特徴付けられる。まず、独自の針貫通角度が使用されます(ゼロに近い)。第二に、針は、ユニークな場所、すなわち、魚の腹側表面の自然な穴を介して魚を貫通し、これにより注入が容易になります。そして最後に、針の動きは前部から後部への動きです。これらの調整は、浸透過程でのDoxの漏れを最小限に抑えることに起因する臓器損傷を効果的に減少させます。針の経路は銀色の皮膚のすぐ下にあり、研究者は銀色の皮膚を継続的に監視できます。その結果、針の先端と内臓との直接接触を効果的に回避できます。注射後、注入されたすべてのドックスは腹腔内に留まり、魚が目を覚まして前方に泳ぎ始めたときには、唯一の出口(穿刺点)を閉じることができます。

既存の2つのIP注入方法4,10

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謝辞

この研究は、NIH(HL107304およびHL081753)およびメイヨー財団(生物医学発見センターおよび心臓血管研究センター)のX.X.J.L 56021702.の支援を受けました。ゼブラフィッシュ施設の管理に携わってくださったベニニオ・ゴア氏とクエンティン・スティーブンス氏に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 μL NanoFil-syringeWorld Precision Instruments, IncNANOFIL注入ツール
34 G needleWorld Precision Instruments, IncNI34BV-2注入ツール
60 mm シャーレフィッシャー サイエンティフィック/フィッシャーブランドスポンジを置くFB0875713A 
解剖顕微鏡ニコンSMZ800DIC
モデル作成用ソルビシン塩酸塩シグマD1515-10MG
心エコー検査VISUAL SONICSVevo 3100心機能の測定
泡スポンジJaece IndustriesL800-D魚を置く
ハンクの平衡塩溶液 (HBBS)サーモフィッシャー14025076機用車両
 southernlabwareMyFuge/C1012は、Doxソリューションを収集します 
Precision Balance ScaleTorbalAD60Digital Scales
TricaineArgentMS-222Anesthetizing fish
TubeEppendorf1.5 mLstorage 
vevo LAB  ソフトウェアFUJIFILM VISUAL SONICS 5.6.0心臓の定量化
ドキの注入  Dox マイクロ遠心分離

参考文献

  1. Tavares, B., Lopes, S. S. The importance of Zebrafish in biomedical research. Acta Medica Portuguesa. 26 (5), 583-592 (2013).
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  4. Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), e2126(2010).
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