このプロトコルは、HEK-293T細胞におけるNHEJおよびHRの効率を定量化するための染色体外非相同末端結合(NHEJ)アッセイおよび相同組換え(HR)アッセイについて説明しています。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
DNA二本鎖切断(DSB)は、最も危険なDNA病変であり、大量の遺伝情報の損失と細胞の死を誘発する可能性があります。これに対して、細胞はDSB修復に非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)の2つの主要なメカニズムを採用しています。NHEJとHRの効率を別々に定量化することは、それぞれに関連するメカニズムと要因を調査するために重要です。NHEJアッセイとHRアッセイは、それぞれの修復経路の効率を測定するために使用される確立された方法です。これらの方法は、DSBを誘導するエンドヌクレアーゼI-SceIの認識部位を持つ破壊された緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含む、細心の注意を払って設計されたプラスミドに依存しています。ここでは、HEK-293T細胞にEJ5-GFP/DR-GFPプラスミド、I-SceI発現プラスミド、およびmCherry発現プラスミドを同時トランスフェクションする染色体外NHEJアッセイとHRアッセイについて説明します。NHEJおよびHR効率の定量的結果は、フローサイトメトリーでカウントされたGFP陽性細胞とmCherry陽性細胞の比率を計算することによって得られます。染色体統合アッセイとは対照的に、これらの染色体外アッセイは、複数の確立された安定細胞株を含む比較研究を行うのにより適しています。
概要
DNA二本鎖切断(DSB)は、DNA損傷の最も有害な形態であり、迅速に修復しないと、ゲノムの不安定性、染色体再配列、細胞老化、および細胞死につながる可能性があります1。非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)の2つの確立された経路は、DNA DSBへの対処における有効性が認められています2,3。HRは、DSB修復のためのエラーのないメカニズムと考えられており、姉妹染色分体の相同配列をテンプレートとして利用して、損傷したDNA分子の元の構成を復元します3。一方、NHEJは、テンプレート2に依存せずに壊れたDNA末端を結合するエラーが発生しやすいDSB修復経路です。
NHEJ アッセイと HR アッセイは、もともとメモリアル スローン ケタリングがんセンターの Jasin の研究室で開発された古典的な方法であり、NHEJ と HR の効率をそれぞれ定量化するために利用されました 4,5,6,7。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1. プラスミドの単離
- コンピテント 大腸菌 をプラスミドEJ5-GFP、DR-GFP、pCBASceI(I-SceI発現プラスミド)、およびPCI2-HA-mCherry(mCherry発現プラスミド)( 材料表を参照)で、標準形質転換プロトコル20に従って形質転換します。
注:PCI2-HA-mCherryは、他のmCherryまたはDsRed発現プラスミドで置換できます。 - 形質転換 した大腸菌 を、100 μg/mL アンピシリンを添加した 500 mL の液体 LB 培地で 37 °C で一晩振とうしながら培養します。
- 製造元の指示に従って、市販のエンドトキシンフリープラスミドマキシ単離キットを使用してプラスミドを単離します( 材料の表を参照)。
- ナノ滴微量分光光度計を使用してプラスミド濃度を定量化します。プラスミド濃度を1 μg/μLに調整します。
2. 細胞調製とトランスフェクション
- HEK-293T細胞をDMEM培地で培養し、10%ウシ胎児血清を添加します。HEK-293T細胞または確立されたHEK-293T安定....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
NHEJおよびHR分析の精度を確保するためには、適切な報酬調整およびゲーティング戦略の実施が必要です。通常、530 nmフィルターを使用すると、mCherry蛍光はGFP検出器に現れません。しかし、細胞が非常に高いGFP発現を示す場合、575 nmフィルターを使用すると、GFP蛍光がmCherry検出器を汚染する可能性があります。これらの懸念に対処するために、ネガティブコントロール、GFP単色コントロール、およびmCherry単色コントロールのサンプルを、補正とゲーティング戦略の調整に使用しました。コントロールセルの典型的なFACS結果を 図2に示します。コンペンセーション調整とゲーティング戦略では、GFP陽性細胞の大部分を右下の象限に配置し(図2C)、mCherry陽性細胞の大部分を左上の象限に配置する必要があります(図2D)。
最終的な代表的なプロットを 図3.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ここで述べる方法は、NHEJ効率およびHR効率を評価するためにいくつかの論文で採用されている9,10,11,12,13,14,16,17,18,19。この方法は、DNA DSB修復の根底にあるメカニズムを解明し、NHEJおよびHRに関連する新しい因子を特定するのに適しています。例えば、DNA依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット(DNA-PKcs)
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
開示すべき利益相反はありません。
謝辞
本研究は、中国黒竜江省自然科学基金会(YQ2022C036)と七七春医科大学大学院イノベーション基金会(QYYCX2022-06)の助成を受けて行われました。図 1 は MedPeer を使用して作成されています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 6cm皿 | BBI | F611202-9001 | |
| 6ウェルプレート | コーニング | 3516 | |
| アンピシリン | Beyotime | ST007 | 作業濃度:100 μg/mL |
| DH5&α;コンピテントセル | TIANGEN | CB101 | |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| DR-GFP | Addgene | 26475 | |
| EJ5-GFP | Addgene | 44026 | |
| EndoFree Maxi Plasmid kit | TIANGEN | DP117 | alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used |
| FACSチューブ | FALCON | 352054 | |
| ウシ胎児血清 | CLARK | FB25015 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | |
| FlowJo V.10.1 | Treestar | 代替解析ソフトは、 | |
| HEK-293T細胞 | 細胞株の国立インフラ Resource | 1101HUM-PUMC000091 | |
| Lipo3000 | Invitrogen | L3000015 | 代替トランスフェクションリージェントは、 |
| PBS | Biosharp | BL601A | |
| pCBASceI | Addgene | 26477 | I-SceIを発現するプラスミド |
| PCI2-HA-mCherry | DsRedを含む代替プラスミドは、 | ||
| トリプシン | Gibco | 25200-056 |
参考文献
- Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
- Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
