方法論記事

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

DOI：

10.3791/66512

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2024年4月12日

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1School of Public Health, Chongqing Medical University

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、無菌(GF)魚の胚を取得し、幼虫から幼魚期まで維持するための主要な手順を概説しています。感染に対するGFモデルの使用は、宿主の健康における微生物の役割を理解するために重要です。

要約

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ゼブラフィッシュは、哺乳類とのゲノムの類似性、比較的きれいな絨毛膜環境で発達した透明な胚、およびげっ歯類モデルと比較して幼虫の非常に速い発育により、成長、免疫、および腸内細菌叢の研究にとって貴重なモデルとして機能します。無菌(GF)ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、汚染物質の毒性を評価し、微生物機能に関連するヒト様疾患モデルを確立するために重要です。従来の飼育(CR)モデル(一般的な飼育の魚)と比較して、GFゼブラフィッシュは宿主微生物叢をより正確に操作することができ、微生物と宿主の因果関係を決定するのに役立ちます。その結果、これらの関係の理解を深める上で重要な役割を果たします。しかし、GFゼブラフィッシュモデルは、免疫機能と栄養素の吸収に限界があるため、通常、初期の生活段階(胚から幼生まで)に生成および研究されています。この研究は、GFフード( アルテミア 属、ブラインシュリンプなど)を使用して、給餌なしおよび長期給餌による初期のGFゼブラフィッシュモデルの生成、維持、および同定を最適化します。プロセス全体を通して、毎日のサンプリングと培養が行われ、プレートや16S rRNAシーケンシングなどの複数の検出によって同定されました。GFゼブラフィッシュの無菌率、生存率、および発生指数を記録して、生成されたモデルの質と量を確保しました。重要なことに、この研究はGF魚の細菌分離と感染技術の詳細を提供し、GF食物サポートを使用して幼生から幼魚期までのGF魚モデルを効率的に作成できるようにします。これらの手順を生物医学研究に適用することにより、科学者は腸内細菌機能と宿主の健康との関係をよりよく理解することができます。

概要

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微生物叢(古細菌、細菌、真核生物、ウイルスなど)は、腸管関門、上皮表面、ムチン機能内の共生相互作用を通じて生理学的および病理学的プロセスに影響を与えることにより、宿主の健康を維持し、さまざまな疾患の発症に寄与する上で重要な役割を果たします1,2,3.乳児期から若年期、成人期、老化までのさまざまなライフステージにわたる微生物叢の構成、および鼻、口腔、皮膚、腸の部位などのさまざまな場所での存在は、多様な生息地と環境によって動的に形成されます4。生物の腸内細菌叢は、栄養素の吸収、免疫応答、病原体の侵入、代謝調節などに関与しています5,6。患者を対象とした研究では、腸内細菌叢の破壊が人間の肥満、睡眠障害、うつ病、炎症性腸疾患(IBD)、神経変性疾患(パーキンソン病、アルツハイマー病)、老化、およびさまざまな癌に関連していることが実証されています7,8,9。さらに、腸内細菌叢と宿主の間の相互作用経路には、マウスと魚のモデルを使用した以前の研究で観察されたように、炎症因子、神経伝達物質、代謝物、腸バリア、および酸化ストレスが含まれます10,11。

最近、潜在的なプロバイオティクスや糞便微生物叢移植(FMT)を含む複数の細菌関連のアプローチまたは治療法が、臨床および動物モデルでこれらの障害について調査されています。これらの調査は、微生物叢-腸-脳/肝臓/腎臓軸、微生物叢由来の産物、および受容体活性の変化に関連する発見に基づいています12,13。しかし、微生物叢-宿主システムの発生、さまざまな機能、およびメカニズムは、微生物群集の複雑さと強力なヒト様疾患モデルの生成という課題のために、まだ完全に理解および特定されていません。

これらの問題に対処するために、無菌(GF)動物モデルが19世紀半ばに緊急に提案され、主に20世紀に開発されました。抗生物質処理モデルやノノトバイオティクスモデルなどのその後の改良と、微生物の検出および観察技術の進歩により、これらのモデルはさらに完成しました14,15,16。GF動物は、自身の背景を消し去り、環境微生物を避けて作られており、微生物とその宿主との相互作用を探るための優れた戦略を提供している17。動物モデルと洗練されたプロトコルの適用により、研究者はGFマウスと魚の患者に見られる同様の微生物組成を再現することに成功しました。さらに、イヌ、ニワトリ、ブタなどの他のGF動物モデルは、研究対象として多様な選択肢を提供する18,19,20,21。このアプローチにより、ヒトの癌免疫療法を含むさまざまな疾患に対する共生微生物叢の潜在的な治療効果の調査が可能になりました16,18。GFモデルは、宿主内の特定の細菌のコロニー形成、移動、増殖、相互作用の特性とメカニズムについて、より正確な洞察を提供します。これは、微生物叢関連疾患の発生と発症に関する重要な新しい洞察を提供します22,23。GFゼブラフィッシュを微生物研究に確立し、応用してきた歴史は、2004年のRawlsらと2006年のBatesらの報告から、2017年のMelancon et al.のプロトコルへと発展してきました16,24,25。しかし、成体または繁殖GFモデルの実現可能性は、依然として長期にわたるプロセスであり、寿命、成功率、および健康上の課題にばらつきがあります。

さまざまな動物モデルの中で、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、ヒトの臓器やゲノミクスとの有利な類似性、短い発生サイクル、高い繁殖力、および透明な胚により、基礎研究と生物医学研究の両方にとって重要なツールとして際立っています19,26。ゼブラフィッシュは、信頼性の高いヒト疾患モデルとして機能し、生体内の生理学的および病理学的プロセスを視覚的に表現し、宿主と微生物の相互作用の魅力的な特徴に関する洞察を提供します。特に、ゼブラフィッシュは異なる細胞系譜を示し、腸の生理機能、微生物の動態、生殖腺と生殖発達、宿主の免疫系の成熟、行動、代謝のイメージングを可能にします27。ゼブラフィッシュの胚は、孵化するまで保護絨毛膜内で発生し、受精後3日(dpf)で幼生になります。彼らは5 dpfで積極的に餌を探し、受精後約3か月(mpf)で性的成熟に達します28。Rawlsらによって報告された最初の無菌(GF)ゼブラフィッシュは、卵黄吸収後にオートクレーブ飼料を与えられた幼虫が8dpfからの組織壊死と20dpfで全死を示したことを示しました。これは、食事の影響、または長期(>7 dpf)GF魚29を含む実験における外因性の栄養素供給を考慮することの重要性を示しました。その後の研究は、GF魚の生成プロトコルを改善し、無菌食品とさまざまな魚モデルで完成された方法を採用しました16。

しかし、GFゼブラフィッシュモデルに関するほとんどの研究は、5dpfで24時間から48時間にわたって細菌感染を含む初期ライフステージに焦点を当てており、実験25,30,31の終わりに7dpfより前にサンプルが収集されました。ヒトやゼブラフィッシュなどの生物の微生物叢は、生命の初めにコロニーを形成し、成長と発達の過程で形成されることは広く認められています。組成は成虫の段階で安定しており、宿主における微生物叢の役割は、特に老化、神経変性、代謝関連肥満、および腸疾患の側面において、生涯を通じて重要です3。したがって、生存期間の長いGF動物からの視点は、初期生活における魚の幼生の未熟な免疫系と生殖系を考慮して、宿主器官の発生と機能における微生物の役割のメカニズムへの洞察を提供することができます。ゼブラフィッシュの腸内の細菌株は、以前の研究で単離され、同定されており、GF動物モデルに感染してプロバイオティクスを選択したり、宿主の細菌機能を研究したりする可能性があります19,25が、GF魚類モデルの生成と応用は、主に初期のライフステージに限定されています。この制限は、複雑な生産プロセス、高い維持費、および食物と免疫に関連する問題に起因し、宿主における微生物叢の発生的および慢性的な影響を調査することを目的とした研究努力を妨げています。

魚の生存率、行動、成長、成熟、および全体的な健康状態は、特に無菌(GF)モデルでは、初期の幼虫から幼魚までの口を開けた期間中の栄養摂取と吸収を含む摂食慣行に大きく影響されます32,33。しかし、GFの養殖における課題の1つは、適切な無菌食が不足しており、幼虫の成長と生存を維持するための栄養サポートの有効性が制限されていることです。この問題を解決することは、GF魚の発生防御機構と腸内細菌叢の欠如による消化能力の弱さを考慮すると、GF魚の生命を回復するために重要です。食物の面では、生きたブラインシュリンプ(Artemia sp.)が、口を開けた幼魚から稚魚に最も適した餌として浮上しています。生きたブラインシュリンプを与えられた魚は、調理された卵黄または他の天然および合成餌を与えられた魚と比較して、より高い成長率と生存率を示すことが観察されている34。GF魚の初期の生命モデルは卵黄のサポートで生き残ることができ、GF幼虫モデルは無菌摂食で維持できますが、幼虫から幼魚までの長期モデルを生成し、性的成熟に達することは依然として困難です。さらに、フレークや粉末状の食品は、栄養組成の不均一によって制限され、水質に影響を与える可能性があります。対照的に、生きたアルテミアは、塩水と淡水の両方での生存、幼虫から成虫に適した小型、バッチ処理の容易さ、孵化品質の向上などの利点があります35。以前の方法16,24,30に基づいて、複雑な処理プロセスを簡素化し、初期のGF魚よりも長期間無菌食品として容易にインキュベートできるGF生きたアルテミアsp.を確立することにより、食事の課題に対処しました。

この研究では、胚から幼生および幼魚期までの無菌(GF)ゼブラフィッシュの成長を確実にするための、(1)生成、(2)維持管理、(3)不妊率の特定、および(4)維持管理と給餌をカバーする最適化されたプロトコルを提示します。この結果は、GFゼブラフィッシュの孵化、生存、成長、および不妊性に関する予備的な証拠と、無菌食品としてのGF アルテミア sp.の重要な指標を提供します。無菌生食品のモデル生成と調製の詳細な手順は、長期的なGF魚モデルの構築と適用、および微生物叢と宿主の相互作用研究におけるGF アルテミア sp.の重要な技術サポートを提供します。このプロトコルは、GF魚類モデルでの細菌の分離、同定、および感染に対処し、細菌の蛍光標識の方法を概説し、顕微鏡下で魚の腸内でのコロニー形成を観察します。GF魚類、細菌感染したノトバイオティクス魚類、または移植されたヒト微生物叢モデルは、宿主免疫、消化、行動、トランスクリプトーム調節、および代謝面に対するそれらの機能と影響を解明するために、さまざまな検出を受けます。長期的には、このプロトコルは、海洋メダカなどのさまざまな野生型魚種に拡張することができ、場合によっては、特定の組織や疾患に関連する他の選択されたトランスジェニックゼブラフィッシュ系統にも拡張できます。

プロトコル

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魚類実験は、重慶市動物管理委員会および中国重慶医科大学動物管理委員会のガイドライン、および国家品質技術監督局が発行した実験動物基準(承認ID:GB14922-2001〜GBT14927-2001)に従って実施されました。ゼブラフィッシュ(Danio rerio、野生型、AB株)は、中国科学院水文生物学研究所から調達し、以前に報告された手順36に従って実験室で維持されました。

1. 成魚の飼育と胚採取

注:以前の研究とレポート16、37、38、39からの修正を利用して、私たちの研究室での成体のゼブラフィッシュの維持、幼虫の飼育、および無菌(GF)モデルの実践は、以下に概説する手順に従って実施されました。魚類養殖用の超高純度フローシステムが商業的に入手されました( 材料表を参照)。pH、塩分、アルカリのバランスが取れた水は、循環中にろ過され、清浄な状態を確保します。

  1. オートサイクルシステム( 材料の表を参照)で、暗い日長で次の標準的な手順で成魚を維持します:光= 10時間:28°C±0.5°Cで14時間、新鮮な孵化した アルテミア spを与えます。 1日2回。
  2. 性的に成熟した成体のゼブラフィッシュ(オス:メス=2:1)を、前夜に真水できれいな水を入れた水槽に入れます。
  3. 翌朝(午前8時30分頃)に、実験室で定期的に光刺激を受けて産卵させます。1〜2時間後、魚を別の水槽に移します。
  4. 使い捨てのパスツールピペットを使用して、培養皿の飼育培地としてオートサイクリングシステムから胚を水に集めます。

2. 胚から幼生までのGFゼブラフィッシュの生成

注:無菌(GF)魚類を作製する手順を 図1に概説し、従来型(CR)モデルとGFモデルの基本的な発生指標を 補足図1に示します。クリーンルームで無菌無菌技術を使用して、ベンチトップの生物学的安全キャビネットまたは層流フードで以下に概説する手順に従ってください。

  1. 魚の培養水を使用して胚を洗浄し、糞便、不純物、死卵または未受精卵を取り除きます。
  2. 抗生物質無菌ゼブラフィッシュ培地(AB-GZM、 材料表参照)溶液を充填した滅菌プレート(直径10cmの滅菌皿あたり最大480個の胚)に2hpfで胚を移し、28.5°Cで6〜8時間培養します。
    注:AB-GZMは胚を数時間処理して表面の微生物を除去するために使用され、抗生物質を含まないGZMはGF魚をサブシーケンスで培養するために使用されます。通常、完成培養時間は6時間です。
  3. 白い斑点や白っぽい外観の卵を除外し、通常発育する卵を選択し、透明で無傷の封筒を表示してさらに処理します。
  4. AB-GZMを使用して10分以内に3回胚をすすぎます。
  5. 胚を0.2 g / Lのポビドンヨード溶液(PVP-I)に1分間浸します( 材料の表を参照)。
    注:濃度が高く、2分を超えると、胚の死亡率と孵化率に影響します。
  6. 無菌ゼブラフィッシュ培地(GZM)を使用して、10分以内に3回胚を洗浄します。
  7. 次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)作業溶液に胚を加え、50 mLの微量遠心チューブをしっかりと覆い、15分間漂白します。この間、胚を漂白剤溶液にそっと振って懸濁します。
  8. GZMを使用して10分以内に3回胚を洗浄します。
  9. 胚を、5つの胚とウェルあたり10mLのGZMを含む滅菌6ウェルプレートに移します。暗光の光周期を持つ超清浄なプラットフォームまたはインキュベーターでそれらを培養します:光= 10時間:28°C±0.5°Cで14時間培養密度は無菌率に影響を与えます。
  10. 使用済みのGZMを取り出し、無菌状態検出用のサンプルとして収集し、各ウェルに同量の無菌GZMを補充することにより、培地を毎日更新します。
  11. 生存率、孵化率、心拍、体長、体重など、GF胚/幼虫の基本的な発生指標を記録します19。
  12. GF魚を容量を拡大した適切な容器(皿、細胞培養フラスコ、またはカバー付きガラス瓶)に移し、成長プロセス全体を通して無菌食品を提供します。

3. GFゼブラフィッシュの幼生から稚魚までの維持

  1. 7 dpfより前に給餌せずにGZMを更新し、毎日無菌状態を検出します(ステップ5を参照)。
  2. ゼブラフィッシュの幼生に、GZMを変更する前に、1日1回、無菌卵黄(ウェルあたり10μLの調製したストック溶液)を8dpfから幼魚期に給餌します。
  3. 14 dpfのGF稚魚に、GF Artemia sp.と混合した滅菌卵黄を1日1回(1〜3匹の アルテミア/幼虫、ステップ4を参照)与え、GF魚の成長と発達に伴って徐々に食物量を増やします。
  4. すべての魚が アルテミアノープリウスを消費できるようになるまで卵黄を提供します。
    注:GF アルテミア は、使用前に無菌試験を受ける必要があります。 残ったアルテミアノープリウス の数を評価し、追跡と捕獲の進行状況を観察し、消費された食物を含む魚体を調べて、摂食の成功を示します。
  5. 28 dpfから初期の成虫段階まで、GF アルテミア を1日1回(3〜5アル テミア/幼虫)給餌し、未開発または死んだ アルテミア、および死んだ魚を毎日のサンプルとして廃棄物GZMに洗浄します。
  6. GF魚の増殖中に、7 dpf後の6ウェルプレートを8〜21 dpfの滅菌プレートまたは細胞培養フラスコに変更し、21 dpf後に滅菌ボトルに変更します。各容器内のGF魚の数と重量に応じて、培地と食品の質量を増やします。
  7. GZMを毎日更新し、サンプルをチェックして、GFモデルの成功を確実にします。
    注:無菌(GF)魚類モデルを成人期初期および性成熟まで維持することは困難であり、平均生存率は30dpfと低く、通常は10%未満である。これは主に、免疫力の低下、発達の遅れ、腸の機能障害に起因します。

4. 慢性GF魚類モデルの無菌食品としてのGFアルテミアノープリウスの調製

注:無菌(GF) アルテミア の栽培方法と調製方法を 図2に示します。以下のステップはすべて、ベンチトップの生物学的安全キャビネットで、無菌無菌技術を使用して行われることに注意してください。

  1. 2.4 g / Lの次亜塩素酸ナトリウム(NaClO、材料の表を参照)を使用して、0.25 gのアルテミア嚢胞を5分間すすぎます。.
  2. すすぎた アルテミア 嚢胞を滅菌した超高密度フィルター(開口部約170メッシュ)でろ過し、滅菌した超純水で毎回1〜2分間3回洗浄します。
  3. 洗浄した アルテミア 嚢胞を100mLの2.5%滅菌生理食塩水に移し、混合し、以下の手順に従って無菌孵化のために包装します。
  4. 50 mLで処理した アルテミア 嚢胞混合物溶液を100 mLの容量の滅菌ボトルに詰め、フィルムで密封し、150 rpm、30°Cで18〜24時間光で振とうするインキュベーターでインキュベートします。
  5. 使い捨てのパスツールピペットを使用して、中層と下層から約30 mLの孵化アル テミアノープリウス を抽出します。
    注:浮遊卵や空の殻が上層に到達しないようにしてください。無菌(GF) アルテミア 嚢胞と ノープリウス を24時間インキュベートした指標を 図3に示します。
  6. アルテミアを滅菌フィルターでろ過し、滅菌超純水を入れた滅菌ビーカーで1回3回、1回約30秒から1分程度洗浄します。最後に、滅菌した超純水4mLを加えて、アルテミア混合液を調製します。
  7. 使い捨てのパスツールピペットを使用して、上層から活発に泳いでいる アルテミア を取り出し、洗浄し、摂食および無菌同定用の ノープリウス 溶液を調製します。

5. ライフステージ全体におけるGF魚類モデルの同定

注:無菌(GF)魚のライフステージ全体を通じて、モデルの成功を確実にするためには、主要なインデックスと毎日のサンプル検出が不可欠です。このステップでは、サンプルの一般的な分類と通常の同定方法を要約します(図4)。

  1. GFゼブラフィッシュの幼生の生存状態と生存率を毎日観察し、数えます。関連する速度を計算する実験では、GF魚は24ウェルまたは48ウェルプレートで培養され、ウェルごとに1匹の魚がいます。
    1. 生存率=(観察時の生きた魚の数/卵の総数)×100%。
    2. 不妊率=(不妊魚の数/生き残った魚の数)×100%。
      注:このプロトコルは、生きた魚の無菌率に焦点を当てています。不妊魚の数は、生きた魚の間で複数のチェックを行った後、成功したGF魚を数えることによって決定されます。細菌の存在により失敗した死んだ魚または生きた魚のGFモデルは、その後のGF手順で排除されます。
  2. GFゼブラフィッシュの幼生の以下のサンプルを収集します。
    1. 各ウェルまたはボトル容器からのGFゼブラフィッシュの培地。
    2. 無菌卵黄やGF アルテミアなどの魚介類。
    3. 孵化後の卵膜の破片や、幼生から稚魚への給餌期間中の食物残渣や糞便などの廃棄物媒体。
    4. バクテリアの存在を特定するための死んだ魚のサンプル。
    5. 無菌対照として胚治療に使用される魚培地および薬剤。
    6. 材料、操作プラットフォーム、インキュベーターなどのサンプル
  3. 複数の方法を使用して毎日収集されるサンプルを検出します。
    1. まず、スプレッドプレート法とインキュベーター内の30°Cの培養プレートを使用します。
      1. 好気性条件下で、トリプチカーゼ大豆寒天(TSA)プレート( 材料の表を参照)に20〜50μLの廃媒体サンプルをコーティングします。
      2. 嫌気性条件下でTSAプレートに20〜50μLの廃媒体サンプルをコーティングします。
      3. 好気性条件下で、血液TSAプレート( 材料の表を参照)に20〜50μLの廃媒体サンプルをコーティングします。
      4. 嫌気性条件下で、血液TSAプレートに20〜50μLの廃液サンプルをコーティングします。
    2. 第二に、液体培養法を使用します。
      1. 200 μLのサンプルをBrain Heart Infusion Broth(BHI)培地( 材料表を参照)を入れた好気チューブに入れ、30°C、150〜180rpmの振とうインキュベーターで培養します。
      2. BHI培地を入れた嫌気性チューブに200μLのサンプルを加え、インキュベーターで30°Cで培養します。
      3. 200 μLのサンプルをトリプチカーゼ大豆ブロス(TSB)培地を入れた好気性チューブに加え、30°C、150〜180rpmの振とうインキュベーターで培養します。
      4. 200 μLのサンプルをTSB培地を入れた嫌気性チューブに加え、インキュベーター内で30°Cで培養します。
    3. 第三に、分子技術-16sポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを使用します。
      1. 2組のプライマー27Fと1492R、および63Fと1387Rで廃水サンプルを分析します(表1)。
        注:PCRマスターミックスは、市販のDNAポリメラーゼキット(材料の表を参照)を使用して表2に従って調製し、PCR装置を表3に規定されたプログラムでセットアップした。
      2. PCRプログラムが完了した後、1465 bp(プライマー27Fおよび1492Rを使用)または1324 bp(プライマー63Fおよび1387Rを使用)の標的バンドで1%アガロースゲル電気泳動40 によって産物を検査し、サンプルの無菌性を推測する。
  4. 24時間から3日および7日間のプレートおよび培地培養を含む無菌試験を記録し、観察し、その間、プレート上のコロニーがなく、液体中の濁りがないことは、GFモデルの構築が成功したことを示しています。24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、144時間、および168時間でプレートと媒体を観察して記録します。

6. GF魚を餌にする前のGF アルテミア サンプルの同定

注:GF魚を餌にする前に生きた餌として不可欠なGF アルテミア サンプル(図4)を検出するには、以下の手順に従ってください。

  1. GF アルテミア モデルのサンプルを収集します。
    1. 未治療の アルテミア 嚢胞。
    2. 治療されたGF アルテミア 嚢胞。
    3. 孵化したGF アルテミアノープリウス。
    4. 対照として滅菌された超純水。
  2. GF アルテミア は、以下の方法で検出します。
    1. 好気性および嫌気性条件下でTSAプレートおよび血液TSAプレートにサンプルをコーティングすることにより、サンプルを検出するスプレッドプレート法を使用します。30°Cでインキュベートします。
    2. 液体媒体を使用して、好気性および嫌気性のTSBおよびBHIチューブ内のサンプルを検出します。150〜180rpm、30°Cのシェーカーで培養します。
    3. PCRアッセイを使用して、16sリボソームRNA標的遺伝子プライマー27Fおよび1492R、63Fおよび1387Rを使用して収集されたサンプル中の細菌の存在を検出します(表1)。ボリュームとプログラムを 表 2 と 表 3 に示します。
  3. 結果を記録する:1465 bp(プライマー27Fおよび1492Rを使用)または1324 bp(プライマー63Fおよび1387Rを使用)を測定するターゲットバンドに対して、1%アガロースゲル電気泳動40 によりPCR産物を検出する。プレートと液体培地の結果は、GF魚の餌として使用する前にGF アルテミア の無菌状態を保証することができます。

7. ゼブラフィッシュの腸内細菌株の単離と同定

注: in vitro および in vivoで腸の機能を調べるには、ゼブラフィッシュから細菌株を分離する必要があり、これはGF動物を使用して感染によってスクリーニングされた潜在的なプロバイオティクスの種源も提供します(図5)。このプロトコルでは、腸の内容物を得るための従来の解剖方法について説明していますが、サンプルは麻酔をかけた生きた魚から直接収集することもできます(データは示されていません)。

  1. 健康な成魚のゼブラフィッシュを選び、滅菌水で洗います。クリーンベンチで次の手順を実行します。
  2. 100 mg / L MS-222で魚を5〜10分間麻酔します。
  3. 魚の体表を処理するために75%アルコールを使用してください。
  4. 魚の腸を解剖し、TSBまたはBHI培地で腸の内容物を押し出します。
  5. TSA、血液プレート、TSB、およびBHI培地を好気性および嫌気性の条件で塗布することにより、腸上清をインキュベートします。
  6. 細菌を翻訳してシグナル株を取得し、さまざまなコロニーの特性を記録します。
  7. バクテリアを-80°Cで30%グリセロール以内に保管してください。
  8. 次に、ゲノムDNA抽出とPCRシーケンシングにより腸内細菌を同定します。
    注:細菌ゲノムDNA抽出の主なステップには、液体遠心分離、RNase AおよびプロテアーゼKの解離、エチルアルコール抽出、すすぎ、および製造元の指示に従って市販のキットを使用した溶解が含まれます( 材料の表を参照)。
  9. National Center for Biotechnology Information(NCBI)とBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)を使用して、Bacteria and Archaeaデータベース40,41(資料表を参照)を使用して16S配列を分析します。
  10. 最も一致する細菌と形質を選択して、属レベルで分離された腸株を特定します。
  11. 市販のキットを使用して細菌株の代謝機能を検出します( 材料の表を参照)。

8. GFゼブラフィッシュ腸内細菌のインフルエンザ標識、感染、コロニー形成

注:GFゼブラフィッシュに感染する前に、単離された細菌を染料で改変してカウントし、微生物のコロニー形成と移動を連続的かつ 生体内で 可視化しました(図6)。

  1. GF魚モデルに感染するために、宿主に豊富に存在する潜在的な有益な細菌または優性株を選択します。
    注:この研究で使用された細菌は、実験室で成体の野生型ゼブラフィッシュから分離および同定された8つの属から選択された Aeromonas sp.と Vibrio sp.( 材料の表を参照)でした42。
  2. 新鮮な細菌をCM-Dil染料で標識し(材料の表を参照)、10 6-108コロニー形成単位(CFU)/mLの濃度で5 dpfのGFゼブラフィッシュに曝露します。
  3. 蛍光顕微鏡で蛍光を3×倍率で観察し、6dpfおよび14dpfからのGFゼブラフィッシュ幼生の腸内の細菌のコロニー形成と分布を示します。
  4. GF魚のバクテリアの数をプレート培養ごとに各時点で手動でカウントします。
  5. コロニーと配列を検出して、標的の細菌株で感染が成功したことを確認します。
  6. 神経行動、発達指数、病理組織学的分析、ホルモン測定などを含む、その後のアッセイのために、細菌感染したGF魚のサンプルを収集します43,44,45。
    注:感染実験に用いた細菌は、新たに回収し、液体培地で新たに培養してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GFゼブラフィッシュモデルは、ゼブラフィッシュのつがいで産む豊富な卵を利用することで効率的に作製することができ、従来のGF魚類モデル35に基づいてプロトコルを最適化した。1枚の6ウェルプレートで約30〜48個の胚/幼虫を培養できるため、十分なデータ収集と統計分析が可能です。無菌処理後、GF胚は48〜72時間で幼虫に孵化するまで清潔なインキュベーターで培養され、無菌状態を維持するために重要な収集されたサンプルの検出とともにGZMを毎日交換します(図1)。7 dpfの後、卵黄と生きた アルテミア の食物は、幼虫から幼虫期まで準備する必要があります。魚の成長と発達の間、GZMの量、容器、および密度は、死や不妊状態の失敗を避けるために、時間内に調整または変更する必要があります。検出で細菌汚染が見られない場合、成功したGFモデルは、若年期から成人期初期まで慢性モデルとして維持できますが、実際には生存率ははるかに低くなります。最後に、GFおよびCR魚類モデルの無菌率、生存率、発生指数、行動、組織病理学的分析、および転写プロファイルを測定して、微生物叢および薬物スクリーニング分野の影響を探ることができます。この研究では、主要な発生指標が比較され(補足図1)、GF魚の孵化率はCR魚よりも45.7%低く、72hpfで60%でした。7dpfでのGF幼生の心拍数は、22.6拍/10秒のCR魚と比較して、18.2拍/10秒で有意に低かったが、14dpfの2つのグループ間に差はなく、23.5-23.8拍/10秒の速度であった。7dpfでのGF魚の生存率は、CR魚の86.7%と同じでしたが、CR魚の80%と比較して、14dpfで60%に減少しました。しかし、GF魚とCR魚の両方の生存率は、摂食能力または習性を獲得した口を開けた期間後に25%〜10%に減少しました。魚の不妊状態を維持できなかったことが、生存率の低下の理由の1つでした。したがって、幼体から成体初期までの摂食と栄養の維持は、魚類養殖における重要な課題です。

魚の成長と発達に影響を与えるもう一つの重要な要素は摂食です。本研究では、GF アルテミア を稚魚および成魚の長期稚魚の生餌として入手するための複数の方法を検討します( 図2に示すプロセス)。GF魚の餌は毎日使用するため、GF アルテミア 用に最適化されたプロトコルは、実際には簡単で、時間を節約し、経済的でなければなりません。顕微鏡で観察した ノープリウス の活発な動きと死滅・不動、 ノープリウスの特徴、孵化していない卵、殻を比較した上で、完成です。毎日孵化させた後、ボトルから得られた新鮮なGF アルテミア の孵化率、生存率と変形率、 ノープリウスの長さと重量などの指標を顕微鏡で観察および測定しました(図3)。治療後、 アルテミア 嚢胞の孵化率は平均88.15%と高く、水泳 ノープリウス の生存率は77.83%、奇形率は1.87%でした。 ノープリウス の体長は546.70μm、体重指数は3.80mg/100で、開稚生期から幼魚・成虫期までの魚の捕獲・摂食に適している。

GFフィッシュとGF アルテミア の検出は、モデルのメンテナンスにとっても重要です。サンプル収集と複数の試験方法によると、その結果は、培養プレートと液体培地で処理されたゼブラフィッシュの胚と アルテミア 嚢胞の成功をもたらすことができます(図4)。毎日採取されたさまざまなサンプルは、すべての試験方法で無菌として検出する必要があり、収集時にGFモデルを示すことができます。GF アルテミア は、GF魚を食べる前に検出するか、プレートと培地インキュベーターの結果は、新鮮な生き たノープリウスの無菌状態を参照する必要があります。つまり、TSAプレート上のシストやTSBやBHIの液体培地ガラスを振盪インキュベーションしてGF アルテミア を培養し、GF アルテミア の生成と無菌検証を同時に行うことができる。GF アルテミア プロトコルは、限られた数の幼虫を摂食することができます。給餌の過程で、GF アルテミア がGZM内を泳ぎ、その後、GF魚の幼生に捕獲され、消費されたことは明らかでした。

GF魚類モデルの応用は、生物学と医学のさまざまな分野に関係しており、微生物の機能、成長と発達、疾患メカニズム、プロバイオティクスまたは薬物スクリーニングなどの調査を可能にします46。例えば、この研究では、ゼブラフィッシュから2つの主要な腸内細菌、 Aeromonas sp.と Vibrio sp.が分離されました。コロニーの特徴と同定を行い、市販のキットを使用して in vitro で複数の代謝機能を測定しました(図5)。これらの細菌は16Sシーケンシングで単離および同定され、ブラストの結果は以前のレポート42で提示されました。同定された細菌株は、GF魚類モデルに感染することにより、単一または複合微生物叢が宿主の健康に与える影響に関する科学的研究を可能にします。魚の幼生の透明性により、CM-Dil色素を使用して蛍光標識細菌細胞を観察することができ、GF魚の腸内でのコロニー形成と分布を明らかにします( 図6を参照)。5 dpfで細菌感染した後、GFゼブラフィッシュの幼生を蛍光顕微鏡で画像化し、6〜14 dpfで連続的に観察することができ、発生指数、病理組織学的変化、および分子変化と組み合わせた微生物機能に関する洞察を提供します47。

figure-results-1
図1:胚から幼虫および幼魚までのGFゼブラフィッシュのプロトコル。 GFゼブラフィッシュの作製における重要なステップには、(1)野生型ゼブラフィッシュからの胚の採取とAB-GZMへの配置が含まれます。(2)PVP-IおよびNaClO剤で治療をすすぎ、完全な無菌性を確保します。(3)GF胚/幼虫をGZMを含む6ウェルプレートで培養し、培地を毎日更新します。(4)最適な成長と発達のための培養条件の調節。(5)さまざまな開発段階でサンプリングし、その後、プレートおよび液体培地法による無菌試験を行います。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:GF魚の生き餌としてのGF アルテミア 調製のプロトコル。 主なステップは次のとおりです:(1)完全な無菌性のための アルテミア 嚢胞のすすぎ治療。(2)培地中のGF嚢胞の調製。(3)孵化を促進するために、塩溶液で24時間インキュベートします。(4)孵化失敗や空の卵をろ過して、活性 ノープリウスを収集します。(5)収集した ノープリウス を洗浄して破片を取り除き、高品質で汚染物質のない生きた食品を確保します。(6)GF魚の幼生に給餌する前のGF アルテミア の無菌試験。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:24時間インキュベートしたGFアルテミア嚢胞とノープリウスのインデックス(A)不純物フィルムを含む未処理のアルテミア嚢胞(スケールバー:500μm)。(B)吸水後の表面がわずかに凸状で、外観がきれいになったアルテミア嚢胞(スケールバー:500μm)の治療。(C)新鮮にインキュベートされた生きたGFアルテミアノープリイ(スケールバー:2000μm)の顕微鏡検査および(D)1000μmのスケールバーによる倍率。

figure-results-4
図4:各ライフステージでのGF魚とGFアルテミアの無菌検出(A)TSBおよびBHI液体培地、TSA、および血液プレートを使用したCRおよびGF魚サンプルの好気性および嫌気性条件下での無菌試験。(B)TSBおよびBHI液体培地、TSA、および血液プレートを使用した未処理のアルテミア嚢胞、GFアルテミア嚢胞、およびノープリウスの好気性および嫌気性条件下での無菌試験。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図5:ゼブラフィッシュの腸内細菌の単離と同定(A)細菌株、コロニーの特徴、16Sシーケンシングマップ(例:Aeromonas sp.およびVibrio sp.)。(B)属とNCBIのアクセッション。(C)ゼブラフィッシュ腸から分離された細菌の代謝機能。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図6:GFゼブラフィッシュにおける腸内細菌株の感染とコロニー形成(A)感染実験のための単離および同定された細菌株の回収。(B)蛍光染料による細菌の標識と5dpfでのGFゼブラフィッシュ幼生の感染。倍率:1倍(C)腸内組織における細菌(ビブリオ属)の分布とコロニー形成の観察 in vivo.倍率:3倍(D)毎日のサンプリングによる各魚の幼生中の細菌(Aeromonas sp.およびVibrio sp.)のCFUのカウント。データはSEM±平均を示しています。

プライマーシーケンス(5'-3')製品の長さ
27階AGAGTTTGATCMTGGCTCAG1465 bp
1492RACGGYTACCTTGTTACGACTT
63階CAGGCCTAACACACACCAAGTC1324 bp
1387RGGGCGGWGTACAAGGC

表1:細菌検出に使用されるプライマー。

コンポーネント単位容量(μL)
Taq DNAポリメラーゼ2.5 U/μL0.1
10×バッファー(Mg2+)---2.1
dNTP混合物2.5 mM1.6
プライマー27F10 μM1
プライマー 1492R10 μM1
DNA/RNAフリーH2O---13.2
テンプレートDNA---1
総ボリューム---20

表2:反応ごとの成分の最終濃度と量。

歩温度時間サイクル
初期変性95°C4分間--
変性94°C1分間35
アニーリング55°C1分間
延長72°C1分間
最終延長72°C10分--
持つ4°C∞--

表3:16S rRNA遺伝子を増幅するためのPCRプログラム。

補足図 1:GFおよびCRゼブラフィッシュモデルの重要な発達指標。 (A)72 hpfでのCRおよびGFゼブラフィッシュの孵化率、および(B)7 dpfおよび14 dpfでのCRおよびGF魚の心拍/10秒。CRおよびGF魚の生存率(%)は、7日と14日に減少し、30dpfで86%、60%-80%、10%-25%に減少しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GF魚とGF食品調製のプロトコル内の重要なステップ
GF魚類モデルの作成中に、無菌材料の調製、胚の滅菌、GZMの毎日の更新、さまざまなサンプルの収集、複数の方法を使用した各サンプルの無菌検査など、いくつかの重要なステップが含まれていました。これらのステップの中で、胚の初期治療はGFモデルの成功にとって基本的かつ決定的です。薬剤、その濃度、および処理時間の制御は、最適な滅菌率と孵化の成功を達成するために重要です。GF魚の胚を幼虫まで取り扱う際には、毎日の培地交換を行い、インキュベーターからプレートを取り外すときに紫外線またはオートクレーブを使用して材料とプラットフォームを完全に滅菌することを確実にする細心の注意が必要です。クリーンベンチの温度低下による幼虫の死を防ぐためには、冬季の温度条件や稼働時間の監視が不可欠です。

無菌卵黄とGF アルテミア は、長期GFモデルで無菌状態を確保するために、7dpf後に魚に与える前に検出を受ける必要があります。給餌期間中、食品残渣の洗浄は、廃液を更新するときに検出するために収集されたサンプルの一部として重要です。容器、GZMの量、および食物の質量は、限られた環境と水質の問題によるGF魚の損失を防ぐために、成長と発達の段階とともに調整する必要があります。これらのパラメータの定期的な監視と調整は、GF魚類モデルのメンテナンスの成功に貢献します。

これらのプロトコルの変更と重要性
AB-GZM、PVP-I、およびNaClO溶液の薬剤、濃度、および曝露時間を最適化するGFゼブラフィッシュ胚を生成するための簡素化された3ステップのプロセスにより、高い無菌率とモデルの健全な開発が保証されます。さらに、毎日のサンプルの無菌検出法は、一般的な細菌プライマーを使用した分子技術とともに、好気性および嫌気性の条件下でのプレートおよび液体培地培養を含むように完成しています。細菌および真菌汚染物質の試験におけるさらなる経験は、GF動物技術48中のアイソレーター汚染物質と無菌試験を最適化することを目的としています。

魚の生きた餌としてのGF アルテミアノープリウス の特定のプロトコルが私たちの研究で調査され、中国国家知識産権局からPPJとDSPに特許が付与されました(No.ZL202210482684.8). 長期のGF魚類モデルは、一貫して不十分で不適切な栄養によって制約され、消化と吸収に関連する腸機能の弱点を悪化させます。GF Artemia sp.は、さまざまなライフステージのメダカモデルとゼブラフィッシュモデルにとって信頼できる食料源として、簡単な手順、短いインキュベーション時間、および毎日の使用のためのリアルタイムの無菌検出により、簡単に調製できるはずです。この方法では、正常な アルテミア 嚢胞を無菌化するのに十分な濃度のNaClOですすぎ、フィルムコーティングされたボトル、プレート上、および検出用の液体培地でインキュベートします。これは、GFの魚の餌付けのために孵化したばかりの ノープリウス をサポートします。 アルテミアの無菌率と孵化率、および体長、体重、活性は優れており、実際に利用可能なアプリケーションを示しています。

GF魚類およびGF食品プロトコルにおけるこれらの変更の重要性は、研究者が胚、幼虫、幼若期、さらには海洋および淡水モードμ種の初期の成虫および成虫期でモデルを生成するのに役立ちます。長期GF動物は、宿主の成長と発達、特に免疫および関連する腸細胞株の成熟における薬物スクリーニングと微生物機能に関する研究において、in vivoモデルとして許可を提供します。たとえば、ゼブラフィッシュの幼生は最初の1週間にしか自然免疫を持っていませんが、その後、胸腺の成熟度31,49とともに、7〜21 dpfの間に適応免疫系を発達させます。さらに、GF魚類モデルは、生物50,51の動的コロニー形成および移動過程のライブ観察により、細菌-細菌および微生物叢-宿主の相互作用を分析する可能性を提供することができる。

方法の制限
幼魚から早期成体(28 dpf-2.5 mpf)および性成熟成体(>2.5 mpf)までのGF魚の養殖は、死亡率の増加とモデルメンテナンス中の細菌汚染のリスクにより、依然として困難です。これらの制限は、主にGF環境に生息する魚に適した自動養殖システムがないために生じます。これらのシステムには、動物とその環境を効果的に維持し、外部の微生物から完全に隔離するためのきれいな空気、水、およびフードシステムが含まれている必要があります。マウスやニワトリなどの他のGF動物モデルとは異なり、CRの親からの解剖学的操作によるGFゼブラフィッシュの入手は、その水生習性および自然な受精スタイルのために困難である。

成獣を腸内細菌叢が全くないものとして扱うこともまた困難です。抗生物質治療は、糞便サンプルで検出された微生物叢の減少を特徴とする、特定の病原体を含まない(SPF)動物と同様の状態を誘発する可能性がありますが、真のGF成魚モデルを達成することは依然として困難です。GFモデルの確立と維持に伴う課題は、特に幼若期から長期状態への移行期に重要です。微生物研究における、成魚のGFF1またはF2卵などのGF子孫の重要性は認められています。しかし、長期的な成魚GFモデルの確立と維持における課題を克服するには、かなりの時間が必要です。

特筆すべきは、特定の細菌のコロニー形成を持つノトバイオティクスゼブラフィッシュが開発され、GFモデルに基づいて慢性的な生存を示していることです。それにもかかわらず、これらのモデルが細菌感染や生物医学研究においてGFモデルの実行可能な代替手段として役立つかどうかは不明のままです。

GF魚類モデルの将来応用
本研究では、胚から幼体へと進行するGFゼブラフィッシュモデルを生成するためのプロトコルを改良しました。この進歩は、発生生物学、免疫学、ヒト疾患研究、器官形成において重要な応用を秘めています。この研究では、質量の分離と同定を通じて、単一の細菌株の機能、メカニズム、および腸由来代謝物を調査しています。調査には、噴出孔がステージ47,53を開いた後のGFゼブラフィッシュモデルへの感染が含まれます。さらに、蛍光で標識された細菌は、他の微生物の影響から解放され、生きたGF幼虫におけるコロニー形成および分布の観察を容易にする54。海洋メダカや淡水メダカなどの同様のGF魚類モデルは、さまざまな薬剤や媒体の変化を伴う同等の方法を使用して作成できます。

ヒトの疾患メカニズムを調査するために、この研究ではFMT法を採用し、患者またはドナーから健康な動物またはGFモデル55にサンプルを移します。従来の飼育(CR)動物とは異なり、GFモデルは、特にバクテリオファージと組み合わせて微生物叢の標的細菌を調節する場合、宿主における微生物の機能、影響、または応答の堅牢な証拠を提供します46。

要約すると、GFゼブラフィッシュは、その敏感で純粋な腸内環境のために、細菌の安全性、薬効、汚染物質の毒性、または化合物の干渉を評価するための強力なモデルとして機能します。GF魚類の応用に関する今後の調査は、さまざまな分野を網羅する必要があり、さまざまなライフステージにわたる微生物機能をより深く理解するために、成魚GF魚モデルを作成する必要があります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GF アルテミア のプロトコルは、中国国家知識産権局から特許として付与されており、著者の許可を得た後、方法の制限された使用が緩和されます。著者らは、他に競合する利害関係や金銭的な利害関係がないことを宣言する。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重慶医科大学人材プロジェクト(DSP第R4014号、PPJ第R4020号)、中国国家自然科学基金会(NSFC、PPJ第32200386号)、重慶ポスドク・イノベーション・メンター・スタジオ(X7928 DSP)、中国科学院(CAS)による中国・スリランカ水技術研究・実証共同センター/CASによる中国・スリランカ合同教育研究センターのプログラムからの支援に心から感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AB-GZMアンホテリシン:Solarbio; カナマイシン:Solarbio;アンピシリン:ソーラーバイオ。アンホテリシン:CAS:1397-89-3;
カナマイシン:CAS:25380-94-0;アンピシリン:CAS:69-52-313。		49.6 mL GZM、50 & マイクロ;Lアムホテリシンストック溶液(250 µg / mL)、25 µLカナマイシンストック溶液(10mg / mL)、および250µLアンピシリンストック溶液(20 mg / mL)。
1.5 mL、15 mL、50 mL EPチューブバイオシャープBS-15-Mサンプルを収集し、エージェント
2.4 g / L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co.、Ltd.を保持します。CAS:7681-52-98%次亜塩素酸ナトリウム水溶液で希釈。
6ウェルプレート、24ウェル、48ウェルプレートLABSELECT 11112魚
AeronomasNCBIデータベースNo.MK1784992019-JPP-ESN
嫌気性TSAプレートトリプトン:オキソイド;
大豆ペプトン:Solarbio;NaCl:バイオシャープ;
寒天粉末:BioFroxx.		トリプトン:LP0042B;
大豆ペプトン:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
寒天粉末:9002-18-0。		TSA プレートは、嫌気性システム下で 6 g のトリプトン、2 g の大豆ペプトン、2 g の NaCl、および 6 g の寒天粉末を含む 400 mL の培地で調製しました。
嫌気性ワークステーションGENE SCIENCEE200G細菌分離、無菌試験
分析GraphPad Prism 5v6.07データAPI
20 Eキットnbsp;BioMerieux SA, FranceNo.1005915090Ref 20100 細菌代謝を検出するキット
アルテミア (ブラインシュリンプ)Shangjia Aquarium Co., Ltd.アクアマスターブランドのアルテミアシストとブラインシュリンプの卵 
魚の養殖のための自動サイクルシステム寧波Hairuiの技術Co.、株式会社猫 魚の
オートクレーブの熱意G154DWSの方法材料BHI
の好気性CoolaberCat#PM0640BHIの媒体は、100mLの媒体が3.7 gのBHIの粉を含んでいた準備された。
BHI AnaerobicCoolaberCat#PM0640BHIミディアムを調製し、嫌気性システムの下で嫌気性チューブに分割しました。
生化学インキュベーターLongYue Co., LtdSPX魚やプレート用
バイオセーフティキャビネットハイアールHR40-IIA2滅菌処理と試験
0.02 g/L NaClOXILONG Scientific Co., Ltd.CAS:7681-52-9次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)濃度の作業溶液:8%次亜塩素酸ナトリウム水溶液または166.6μL 6%次亜塩素酸ナトリウム500mL蒸留水で希釈
血液プレートの血液:SolarbioCat. NO. TX0030TSAに滅菌除細動羊の血液を添加し、5%の血液プレートを調製しました。
細胞培養フラスコCorning430639魚の培養へ
CM-Dil dyesMolecular ProbesCat#C7000  バクテリアをラベル付けするには
恒温振盪用インキュベーターPeiving Co., LtdHZQ-X100Bacterial culture
DatabaseNCBIBacteria and Archaea データベースリンク: 古細菌 FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
バクテリアFTP:
ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ 使い捨てパスツールピペットバイオシャープbs-xh-03l水の交換と卵の移動に使用
使い捨てペトリ皿バイオシャープBS-90-D魚の
DNAキットをSolaribioCat#D1600細菌ゲノムDNA抽出キット 
電動ピペットSCILOGEXLevo meChange water
ExiguobacteriumNCBI databaseNo.MK1785042019-JPP-ESN
GZMSea salt:LANDEBAO Co., Ltd.No Cat1 Lの水と1.5 mLの海塩溶液(40 g / L)で構成され、オートクレーブ滅菌されています。GZM溶液中の海塩の含有量は60 mg / Lでした。
実験室純水システムHitech Co., LtdPrima-S15薬剤の準備
顕微鏡NikonSMZ18魚の幼生を観察するための蛍光灯付き
PCR キットTIANGENCat#ET101Taq DNA ポリメラーゼ キット
ピペットLABSELECT sp-013-10水交換
ポビドンヨウ素 (PVP-I)アラジンロット#H1217005水溶液 ポビドンヨウ素 0.4 g/L 純水。
タイミングコンバータPinYi Co.、LtdAL-06光
TSAプレートトリプトンを調整するには:Oxoid;
大豆ペプトン:Solarbio;NaCl:バイオシャープ;
寒天粉末:BioFroxx.		トリプトン:LP0042B;
大豆ペプトン:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
寒天粉末:9002-18-0。		TSA プレートは、6 g のトリプトン、2 g の大豆ペプトン、2 g の NaCl、6 g の寒天粉末を含む 400 mL の培地で調製しました。
TSB好気性トリプトン:オキソイド;
大豆ペプトン:Solarbio;NaCl:バイオシャープ;		トリプトン:LP0042B;
大豆ペプトン:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		TSB培地を調製し、400mLの培地に6gのトリプトン、2gの大豆ペプトン、および2gのNaClを含有させた。
TSB嫌気性トリプトン:オキソイド;
大豆ペプトン:Solarbio;NaCl:バイオシャープ;		トリプトン:LP0042B;
大豆ペプトン:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		TSB培地を調製し、嫌気性システムの下で嫌気性チューブに分割しました。
超清浄ワークベンチエアテックSW-CJ-2FD魚
類養殖用超高純度フローシステム海洋生物装置会社No Cat魚用水
VibrioNCBIデータベースNo.MK1785012019-JPP-ESN
の分析&を維持する を準備して材料BHIの好気性Coolaber Cat#PM0640 の漂白剤。羊培養する

参考文献

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