このプロトコルは、無菌(GF)魚の胚を取得し、幼虫から幼魚期まで維持するための主要な手順を概説しています。感染に対するGFモデルの使用は、宿主の健康における微生物の役割を理解するために重要です。
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この記事について
サマリー
要約
ゼブラフィッシュは、哺乳類とのゲノムの類似性、比較的きれいな絨毛膜環境で発達した透明な胚、およびげっ歯類モデルと比較して幼虫の非常に速い発育により、成長、免疫、および腸内細菌叢の研究にとって貴重なモデルとして機能します。無菌(GF)ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、汚染物質の毒性を評価し、微生物機能に関連するヒト様疾患モデルを確立するために重要です。従来の飼育(CR)モデル(一般的な飼育の魚)と比較して、GFゼブラフィッシュは宿主微生物叢をより正確に操作することができ、微生物と宿主の因果関係を決定するのに役立ちます。その結果、これらの関係の理解を深める上で重要な役割を果たします。しかし、GFゼブラフィッシュモデルは、免疫機能と栄養素の吸収に限界があるため、通常、初期の生活段階(胚から幼生まで)に生成および研究されています。この研究は、GFフード( アルテミア 属、ブラインシュリンプなど)を使用して、給餌なしおよび長期給餌による初期のGFゼブラフィッシュモデルの生成、維持、および同定を最適化します。プロセス全体を通して、毎日のサンプリングと培養が行われ、プレートや16S rRNAシーケンシングなどの複数の検出によって同定されました。GFゼブラフィッシュの無菌率、生存率、および発生指数を記録して、生成されたモデルの質と量を確保しました。重要なことに、この研究はGF魚の細菌分離と感染技術の詳細を提供し、GF食物サポートを使用して幼生から幼魚期までのGF魚モデルを効率的に作成できるようにします。これらの手順を生物医学研究に適用することにより、科学者は腸内細菌機能と宿主の健康との関係をよりよく理解することができます。
概要
微生物叢(古細菌、細菌、真核生物、ウイルスなど)は、腸管関門、上皮表面、ムチン機能内の共生相互作用を通じて生理学的および病理学的プロセスに影響を与えることにより、宿主の健康を維持し、さまざまな疾患の発症に寄与する上で重要な役割を果たします1,2,3.乳児期から若年期、成人期、老化までのさまざまなライフステージにわたる微生物叢の構成、および鼻、口腔、皮膚、腸の部位などのさまざまな場所での存在は、多様な生息地と環境によって動的に形成されます4。生物の腸内細菌叢は、栄養素の吸収、免疫応答、病原体の侵入、代謝調節などに関与しています5,6。患者を対象とした研究では、腸内細菌叢の破壊が人間の肥満、睡眠障害、うつ病、炎症性腸疾患(IBD)、神経変性疾患(パーキンソン病、アルツハイマー病)、老化、およびさまざまな癌に関連していることが実証されています7,8,9....
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プロトコル
魚類実験は、重慶市動物管理委員会および中国重慶医科大学動物管理委員会のガイドライン、および国家品質技術監督局が発行した実験動物基準(承認ID:GB14922-2001〜GBT14927-2001)に従って実施されました。ゼブラフィッシュ(Danio rerio、野生型、AB株)は、中国科学院水文生物学研究所から調達し、以前に報告された手順36に従って実験室で維持されました。
1. 成魚の飼育と胚採取
注:以前の研究とレポート16、37、38、39からの修正を利用して、私たちの研究室での成体のゼブラフィッシュの維持、幼虫の飼育、および無菌(GF)モデルの実践は、以下に概説する手順に従って実施されました。魚類養殖用の超高純度フローシステムが商業的に入手されました( 材料表を参照)。pH、塩分、アルカリのバランスが取れた水は、循環中にろ過され、清浄な状態を確保します。
- オートサイクルシステム( 材料の表
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結果
GFゼブラフィッシュモデルは、ゼブラフィッシュのつがいで産む豊富な卵を利用することで効率的に作製することができ、従来のGF魚類モデル35に基づいてプロトコルを最適化した。1枚の6ウェルプレートで約30〜48個の胚/幼虫を培養できるため、十分なデータ収集と統計分析が可能です。無菌処理後、GF胚は48〜72時間で幼虫に孵化するまで清潔なインキュベーターで培養され、無菌状態を維持するために重要な収集されたサンプルの検出とともにGZMを毎日交換します(図1)。7 dpfの後、卵黄と生きた アルテミア の食物は、幼虫から幼虫期まで準備する必要があります。魚の成長と発達の間、GZMの量、容器、および密度は、死や不妊状態の失敗を避けるために、時間内に調整または変更する必要があります。検出で細菌汚染が見られない場合、成功したGFモデルは、若年期から成人期初期まで慢性モデルとして維持できますが、実際には生存率ははるかに低くなります。最後に、GFおよびCR魚類モデルの無菌率、生存率、発生指数、行動、組織病理学的分析、および転写プロフ.......
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ディスカッション
GF魚とGF食品調製のプロトコル内の重要なステップ
GF魚類モデルの作成中に、無菌材料の調製、胚の滅菌、GZMの毎日の更新、さまざまなサンプルの収集、複数の方法を使用した各サンプルの無菌検査など、いくつかの重要なステップが含まれていました。これらのステップの中で、胚の初期治療はGFモデルの成功にとって基本的かつ決定的です。薬剤、その濃度、および処理時間の制御は、最適な滅菌率と孵化の成功を達成するために重要です。GF魚の胚を幼虫まで取り扱う際には、毎日の培地交換を行い、インキュベーターからプレートを取り外すときに紫外線またはオートクレーブを使用して材料とプラットフォームを完全に滅菌することを確実にする細心の注意が必要です。クリーンベンチの温度低下による幼虫の死を防ぐためには、冬季の温度条件や稼働時間の監視が不可欠です。
無菌卵黄とGF アルテミア は、長期GFモデルで無菌状態を確保するために、7dpf後に魚に与える前に検出を受ける必要があります。給餌期間中、食品残渣の洗浄は、廃液を更新するときに検出するために収集されたサンプル.......
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開示事項
GF アルテミア のプロトコルは、中国国家知識産権局から特許として付与されており、著者の許可を得た後、方法の制限された使用が緩和されます。著者らは、他に競合する利害関係や金銭的な利害関係がないことを宣言する。
謝辞
重慶医科大学人材プロジェクト(DSP第R4014号、PPJ第R4020号)、中国国家自然科学基金会(NSFC、PPJ第32200386号)、重慶ポスドク・イノベーション・メンター・スタジオ(X7928 DSP)、中国科学院(CAS)による中国・スリランカ水技術研究・実証共同センター/CASによる中国・スリランカ合同教育研究センターのプログラムからの支援に心から感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| AB-GZM | アンホテリシン:Solarbio; カナマイシン:Solarbio;アンピシリン:ソーラーバイオ。 | アンホテリシン:CAS:1397-89-3; カナマイシン:CAS:25380-94-0;アンピシリン:CAS:69-52-313。 | 49.6 mL GZM、50 & マイクロ;Lアムホテリシンストック溶液(250 µg / mL)、25 µLカナマイシンストック溶液(10mg / mL)、および250µLアンピシリンストック溶液(20 mg / mL)。 |
| 1.5 mL、15 mL、50 mL EPチューブバイオ | シャープ | BS-15-M | サンプルを収集し、エージェント |
| 2.4 g / L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co.、Ltd.を保持します。 | CAS:7681-52-9 | 8%次亜塩素酸ナトリウム水溶液で希釈。 |
| 6ウェルプレート、24ウェル、48ウェルプレート | LABSELECT | 11112 | 魚 |
| Aeronomas | NCBIデータベース | No.MK178499 | 2019-JPP-ESN |
| 嫌気性TSAプレート | トリプトン:オキソイド; 大豆ペプトン:Solarbio;NaCl:バイオシャープ; 寒天粉末:BioFroxx. | トリプトン:LP0042B; 大豆ペプトン:Cat#S9500; NaCl:BS112; 寒天粉末:9002-18-0。 | TSA プレートは、嫌気性システム下で 6 g のトリプトン、2 g の大豆ペプトン、2 g の NaCl、および 6 g の寒天粉末を含む 400 mL の培地で調製しました。 |
| 嫌気性ワークステーション | GENE SCIENCE | E200G | 細菌分離、無菌試験 |
| 分析 | GraphPad Prism 5 | v6.07 | データAPI |
| 20 Eキット | nbsp;BioMerieux SA, France | No.1005915090 | Ref 20100 細菌代謝を検出するキット |
| アルテミア (ブラインシュリンプ) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | アクアマスターブランドの | アルテミアシストとブラインシュリンプの卵 |
| 魚の養殖のための自動サイクルシステム | 寧波Hairuiの技術Co.、株式会社 | 猫 魚の | |
| オートクレーブ | の熱意G154DWSの方法 | 材料BHI | |
| の好気性 | Coolaber | Cat#PM0640 | BHIの媒体は、100mLの媒体が3.7 gのBHIの粉を含んでいた準備された。 |
| BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHIミディアムを調製し、嫌気性システムの下で嫌気性チューブに分割しました。 |
| 生化学インキュベーター | LongYue Co., Ltd | SPX | 魚やプレート用 |
| バイオセーフティキャビネット | ハイアール | HR40-IIA2 | 滅菌処理と試験 |
| 0.02 g/L NaClO | XILONG Scientific Co., Ltd. | CAS:7681-52-9 | 次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)濃度の作業溶液:8%次亜塩素酸ナトリウム水溶液または166.6μL 6%次亜塩素酸ナトリウム500mL蒸留水で希釈 |
| 血液プレート | の血液:Solarbio | Cat. NO. TX0030 | TSAに滅菌除細動羊の血液を添加し、5%の血液プレートを調製しました。 |
| 細胞培養フラスコ | Corning | 430639 | 魚の培養へ |
| CM-Dil dyes | Molecular Probes | Cat#C7000 | バクテリアをラベル付けするには |
| 恒温振盪用インキュベーター | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | Bacterial culture |
| Database | NCBI | Bacteria and Archaea データベース | リンク: 古細菌 FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ バクテリアFTP: |
| ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ 使い捨てパスツールピペット | バイオシャープ | bs-xh-03l | 水の交換と卵の移動に使用 |
| 使い捨てペトリ皿 | バイオシャープ | BS-90-D | 魚の |
| DNAキットを | Solaribio | Cat#D1600 | 細菌ゲノムDNA抽出キット |
| 電動ピペット | SCILOGEX | Levo me | Change water |
| Exiguobacterium | NCBI database | No.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
| GZM | Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. | No Cat | 1 Lの水と1.5 mLの海塩溶液(40 g / L)で構成され、オートクレーブ滅菌されています。GZM溶液中の海塩の含有量は60 mg / Lでした。 |
| 実験室純水システム | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | 薬剤の準備 |
| 顕微鏡 | Nikon | SMZ18 | 魚の幼生を観察するための蛍光灯付き |
| PCR キット | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq DNA ポリメラーゼ キット |
| ピペット | LABSELECT | sp-013-10 | 水交換 |
| ポビドンヨウ素 (PVP-I) | アラジン | ロット#H1217005 | 水溶液 ポビドンヨウ素 0.4 g/L 純水。 |
| タイミングコンバータ | PinYi Co.、Ltd | AL-06 | 光 |
| TSAプレート | トリプトンを調整するには:Oxoid; 大豆ペプトン:Solarbio;NaCl:バイオシャープ; 寒天粉末:BioFroxx. | トリプトン:LP0042B; 大豆ペプトン:Cat#S9500; NaCl:BS112; 寒天粉末:9002-18-0。 | TSA プレートは、6 g のトリプトン、2 g の大豆ペプトン、2 g の NaCl、6 g の寒天粉末を含む 400 mL の培地で調製しました。 |
| TSB好気性 | トリプトン:オキソイド; 大豆ペプトン:Solarbio;NaCl:バイオシャープ; | トリプトン:LP0042B; 大豆ペプトン:Cat#S9500; NaCl:BS112; | TSB培地を調製し、400mLの培地に6gのトリプトン、2gの大豆ペプトン、および2gのNaClを含有させた。 |
| TSB嫌気性 | トリプトン:オキソイド; 大豆ペプトン:Solarbio;NaCl:バイオシャープ; | トリプトン:LP0042B; 大豆ペプトン:Cat#S9500; NaCl:BS112; | TSB培地を調製し、嫌気性システムの下で嫌気性チューブに分割しました。 |
| 超清浄ワークベンチ | エアテック | SW-CJ-2FD | 魚 |
| 類養殖用超高純度フローシステム | 海洋生物装置会社 | No Cat | 魚用水 |
| Vibrio | NCBIデータベース | No.MK178501 | 2019-JPP-ESN |
参考文献
- Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118(2021).
- Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbio....
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