方法論記事

バイオインフォマティクスに基づくヨモギ花粉アレルゲンART v 1タンパク質のB/Th細胞エピトープ予測

DOI：

10.3791/66517

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2023年12月22日

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1School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, 2Preparation Center, General Hospital of Ningxia Medical University, 3Department of Pharmacy, General Hospital of Ningxia Medical University, 4Institute of Neurological Diseases, Shizuishan First People's Hospital, 5Department of Pharmacy, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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ここでは、ヨモギ花粉の主なアレルゲンArt v 1タンパク質の物理化学的特性、二次構造、およびBおよびTヘルパー細胞エピトープを予測するためのバイオインフォマティクス相関分析を実行するためのプロトコルを提示し、ヨモギ花粉アレルギー疾患ワクチンと疾患治療のその後の開発のための理論的基礎を提供します。

要約

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ヨモギ花粉アレルゲンArt v 1タンパク質の配列特性を解析し、そのB細胞およびTh(ヘルパーT細胞)細胞エピトープを予測するために、Genebankを参照してArt v 1タンパク質の遺伝子配列とアミノ酸配列を求めた。ExPASyのProt Param、TMHMM、DNAstar Protean、Swiss-Model、UCLA-DOE LAB SAVES v6.0、およびIEDBを使用して、タンパク質の物理化学的特性、膜貫通領域、二次構造、三次構造、およびタンパク質のB細胞およびTh細胞エピトープを解析および予測しました。

Art v 1タンパク質は132アミノ酸残基で構成され、相対分子量は13404.26、分子式はC584H903N157O181S12、pI値は7.49、脂質溶解度指数は41.59、親水性指数は-0.454で、親水性タンパク質と見なされます。不安定性指数(ii)は78.11で、不安定タンパク質に分類されます。タンパク質のN末端には、5〜27アミノ酸残基配列に位置するαヘリックス膜貫通領域があり、1〜24位がシグナルペプチド配列です。ランダムコイル、βターン、αヘリックス、βシートがあり、親水性領域、フレキシブル領域、表面アクセシビリティ領域の構造も含まれています。

三次構造の予測結果は、二次構造の解析結果と一致しています。5つの優性B細胞エピトープが予測され、それらはArt v 1 71-87、Art v 1 33-49、Art v 1 104-120、Art v 1 95-111、およびArt v 1 86-102でした。5つのTh細胞優性エピトープがあり、それらはArt v 1 2-16、Art v 1 3-17、Art v 1 4-18、Art v 1 5-19、およびArt v 1 6-20でした。Art v 1タンパク質は、B細胞およびTh細胞エピトープの存在により、良好な抗原性を有すると予測されています。

概要

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ヨモギは、キク科のヨモギ属で、内モンゴル自治区、甘粛省、および中国の他の地域に広く分布しています1。ヨモギ花粉によって誘発されるさまざまなアレルギー疾患は、通常、アトピー性の個人が花粉アレルゲンに繰り返し曝露され、生理活性メディエーターが生成されることによって引き起こされるI型アレルギーであり、鼻粘膜、結膜、気管支のカタル性炎症、さらには喘息発作を引き起こします2。WHO/IUIS アレルゲン命名小委員会3 は、現在、7 つのヨモギアレルゲン、すなわち Art v 1-Art v 6 と Art AN 7 を公式に認めています。Art v 1タンパク質は、ヨモギ花粉アレルギーの主な原因の1つです。分子量は24-28kDaで、ヨモギ花粉4にアレルギーのある個人の95%が認識できます。これは、C末端のプロリンに富む尾部に接続されたN末端のβ-ディフェンシン様ドメインで構成されています。デフェンシンは、いくつかの真核生物5で発現する内因性抗菌ポリペプチドです。

現在、アレルゲン免疫療法(AIT)は、アレルゲンへの曝露を避けるだけでなく、アレルギー疾患の自然な経過を変えることができる唯一の病因学的治療法です6。ここ数十年でアレルギー疾患の有病率が増加していることから、アレルゲン分子に関する基礎研究と臨床研究の重要性、およびアレルギーの診断と治療への応用の可能性が浮き彫りになっています。AITに使用されるアレルゲンの多くは組換えタンパク質に属し、その物理的、化学的、免疫学的特性は、アレルゲン性が低下したアレルゲンワクチンの製造に適しています。したがって、AITは、アレルギーワクチンが低コストで比較的簡単に製造できるため、アレルギー疾患を効果的に予防および治療するための主要な手段と考えられています7。しかし、これまでのワクチン開発は、分子生物学や免疫実験のみに依存していました。また、ワクチン開発にはエピトームの同定が不可欠であり、現在、エピトープの同定に最も確実な方法はX線結晶構造解析とNMR技術です。ただし、時間と費用がかかります8.したがって、低コストと高速の利点を備えた計算方法とツールを使用して、エピトープを予測しました。

この論文では、ヨモギ花粉の主なアレルゲンであるArt v 1タンパク質の物理化学的特性、二次構造、三次構造、およびB/Th細胞エピトープを予測するためのバイオインフォマティクス相関分析法について説明します。これは、その後のヨモギ花粉アレルギー疾患ワクチンの開発と疾患治療の理論的基礎を提供します。

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プロトコル

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1. Art v 1タンパク質の物理的および化学的性質

  1. GeneBank(Table of Materials)にAF493943.1を入力して、Art v 1タンパク質のアミノ酸配列を取得します(Supplemental File 1-Supplemental Figure S1)。
    注:Art v 1タンパク質は、624 bpの遺伝子配列によってコードされる132個のアミノ酸を含んでいます。そのアミノ酸配列(AAO24900.1)はMAKCSYVFCAVLLIFIVAIGEMEAAGSKLCEKTSKTYSGです
    KCDNKKCDKKCIEWEKAQHGACHKREAGKESCFCYF
    DCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGSPSPグスプ
    PPADGGSPPVDGGSPPPPSTH.
  2. Expasy ProtParamツール(材料表)を起動し、ステップ1.1で説明したArt v 1タンパク質アミノ酸配列を入力します。 [パラメータの計算]ボタンをクリックすると 、アミノ酸組成、原子番号、分子式、相対分子量、正電荷と負電荷、等電点、不安定性指数が表示されます(補足ファイル1-補足図S2)。
    注:不安定性指数は<40で、タンパク質が安定していることを示しています。値が40>、タンパク質が不安定であることを意味します9。

2. Art v 1タンパク質の膜貫通領域とシグナルペプチドの予測

  1. 上記のArt v 1タンパク質アミノ酸配列をオンラインソフトTMHMM Server v.2.0(Table of Materials)に入力してください。出力形式としてグラフィックスを使用して、拡張を選択し、送信をクリックして膜構造を表示し、膜貫通タンパク質の物理的および化学的特性を取得します(補足ファイル1-補足図S3)。
  2. 上記のArt v 1タンパク質アミノ酸配列をSignaIP5.0サーバーオンラインツール(Table of Materials)に入力します。EukaryaをOlekaryaグループとして選択し、Long出力を出力形式として選択し、Submitをクリックして電子メールアドレスを記入し、予測されたタンパク質シグナルペプチドの結果を受け取ります(補足ファイル1-補足図S4)。

3. Art v 1タンパク質の二次構造予測

  1. Art v 1タンパク質の親水性、表面アクセシビリティ、柔軟性、抗原指数を解析するには、GeneBank(Table of Materials)にAF493943.1を入力し、protein id AAO24900.1 |ファスタ。FASTA シーケンスを新しいテキスト ファイルにコピーし、ファイル タイプを FASTA (補足ファイル 1 から補足図 5) に変更します。次に、ソフトウェア DNAstar プロティアンモジュールを起動し、FASTA ファイルを開いて Art v 1 タンパク質の二次構造を表示します (補足ファイル 1-補足図 S6)。

4. Art v 1タンパク質の三次構造予測と立体構造評価

  1. Art v 1タンパク質の三次構造モデルを予測するには、上記のArt v 1タンパク質アミノ酸配列をSwiss-Modelオンラインソフトウェア(Table of Materials)に入力し、 Search For Templatesをクリックし、最も類似性の高いタンパク質 2kpy.1.A を テンプレートとして選択し、 Build Models |Model 01をダウンロードし、PDB形式ファイル(Supplemental File 1-Supplemental Figure S7)をダウンロードします。
  2. ステップ4.1で表示された相同モデリングコンフォメーションを評価するには、UCLA-DOE LAB SAVES v6.0オンラインソフトウェア(Table of Materials)を開き、Select file をクリックしてステップ4.1 |プログラムの実行 |プロチェック |リザルト |ラマチャンドランプロット (補足ファイル1-補足図S8)。

5. Art v 1タンパク質のB細胞エピトープの予測

  1. Art v 1タンパク質のB細胞エピトープを予測するには、IEDB Analysis Resourceオンラインツール(Table of Materials)のWebサイトを開き、 抗原配列プロパティをクリックし、上記のArt v 1タンパク質アミノ酸配列を入力し、 Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0方法を選択し、最後に Submit (Supplemental File 1-Supplemental Figure S9)をクリックします。
  2. ABCpredオンラインツール(Table of Materials)のWebサイトを開き、上記のArt v 1タンパク質アミノ酸配列、しきい値として0.51、予測に使用するウィンドウ長として16を入力し、オーバーラップフィルターでONを選択し、Submit sequence (Supplemental File 1-Supplemental Figure S10)をクリックします。

6. Art v 1タンパク質のTh細胞エピトープの予測

  1. Art v 1タンパク質のTh細胞エピトープを予測するには、IEDB Analysis Resourceオンラインツール(Table of Materials)のWebサイトを開き、MHC II Bindingをクリックして、上記のArt v 1タンパク質アミノ酸配列を入力します。予測方法として NetMHCllpan 4.1 EL (推奨エピトープ予測子-2023.09)、種/遺伝子座として Human、HLA-DR として DRB1*01:01、長さとして 15、長さとして 15 を選択し、ペプチドをパーセンタイルランクでソートし、Submit (Supplemental File 1-Supplemental Figure S11) をクリックします。

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結果

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ExPASyのProt Param Toolオンラインソフトウェアは、タンパク質10の物理化学的および機能的特性評価に使用されました。オープンテキスト読み取りフレームの長さは624 bpで、132個のアミノ酸をコードし、合計1,837個の原子と13,404.26の相対分子量を持つタンパク質をコードしました。分子式はC584H903N157O181S12であり、そのうち上位3つのアミノ酸はプロリン(Pro、15.9%)、アラニン(Ala、12.1%)、グリシン(Gly、11.4%)であり、残りのアミノ酸は10%未満を占めています。等電点(pI)値は7.49、負電荷残基の総数(Asp + Glu)は13、正電荷残基の総数(Arg + Lys)は14です。脂質溶解度指数は41.59、親水性指数は-0.454で、親水性タンパク質です。不安定性指数(ii)は78.11で、不安定タンパク質に分類されます。

TMHMM Server V.2...

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ディスカッション

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ヨモギは中国で最も重要な屋外アレルゲンの1つであり、その花粉粒子は直径19〜25μmと小さく、風によって簡単に分散され、大量の粉末が生成されます。さらに、患者のアレルギー症状の重症度は、空気中の花粉含有量と相関しています5。Art v 1 はヨモギ花粉アレルギーの画期的なアレルゲンと見なされており、ヨモギアレルギーの患者の 95% 以上が Art v 1 に敏感です。中国では、ヨモギアレルギー患者の~81%がArt v 1可溶性免疫グロブリンE(sIgE)14陽性を示しています。

本研究では、主にヨモギ花粉タンパク質Art v 1の基本特性をバイオインフォマティクス技術を通じて解析した。タンパク質の二次構造と膜貫通構造領域の予測と解析において、Art v 1タンパク質は不安定な親水性タンパク質であることがわかりました。構造内にαヘリックス構造とβシート構造が存在し、これらは安定しており、水素結合の存在により変形しにくい...

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開示事項

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著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

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この研究は、寧夏回族自治区自然科学財団(2022AAC03601および2023AAC02087)および寧夏医科大学研究財団(XM2019052)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ABCpredIndraprastha Institute of Information Technology, Indiahttps://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html
DNAstar Protean ソフトウェアDNASTAR, Inc.バージョン7.1
Expasy ProtParamツールSIB Swiss Institute of Bioinformaticshttps://web.expasy.org/protparam/
GeneBankNational Center for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/
IEDB Analysis Resource, National Institute of Allergy and Infectious Diseaseshttp://www.iedb.org/
SignaIP-5.0サーバーDTU Health Techhttps://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/
スイスモデルオンラインソフトウェアBIOZENTRUMhttps://swissmodel.expasy.org/interactive
TMHMM サーバーDTU Health TechVersion 2.0https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
UCLA - DOE LAB SAVESUS Department of Energy Office of ScienceVersion6.0https://saves.mbi.ucla.edu/

参考文献

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B Cell EpitopeBioinformatics AnalysisProtein Structure PredictionAmino Acid SequencePhysicochemical PropertiesTransmembrane Region
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