In-vitro血栓溶解モデルにおけるせん断流下におけるChandler Loop形成全血栓の線維素溶解の追跡

サマリー

in vitro血栓溶解アッセイは、消化されるモデル血栓や血栓溶解が起こっている環境など、生体内条件を再現するのに苦労することがよくありました。ここでは、ChandlerループとReal-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay(RT-FluFF)の結合が、高忠実度のex-vivo血栓溶解モニタリングにどのように使用されているかを探ります。

要約

血栓塞栓症および関連する合併症は、世界中の罹患率と死亡率の主な原因であり、 in vitro と in vivo の両方で血栓溶解薬の有効性をテストするためのさまざまなアッセイが開発されています。動物モデルには複雑性とコストがかかることに加え、ヒトの生理機能への翻訳性が欠如していることが多いことから、医薬品開発のためのより生理学的に関連性のある in-vitro 血栓モデルに対する需要が高まっています。流量、圧力、およびせん断速度は循環器系の重要な特性であり、流れの下で形成される血栓は、静的に形成された血栓とは異なる形態と消化特性を示します。これらの因子は、従来の in-vitro 血栓消化アッセイでは表現されないことが多く、薬物の翻訳成功率に影響を与える薬理学的な意味を持つ可能性があります。

Real-T ime Flu造山運動法 Flowing F線溶 (RT-FluFF) アッセイは、せん断流下で形成された蛍光タグ付き血栓を使用し、線維素溶解薬の有無下で循環プラズマを使用して消化する高忠実度の血栓溶解試験プラットフォームとして開発されました。血栓形成と血栓消化ステップの両方の流速を変更することで、システムは非常に多様な実験設定で動脈、肺、静脈の状態を模倣することができます。測定は、インライン蛍光光度計を使用するか、離散的な時間点を取ることによって連続的に行うことができ、従来のエンドポイントの血栓質量測定も可能です。RT-FluFFアッセイは、in-vitro試験システムの制御性と再現性を維持しながら、in-vivoの生理学的条件をより正確に表現する流条件下での血餅消化のリアルタイム追跡を可能にする柔軟なシステムです。

概要

基本的に血栓塞栓症の病因に起因する疾患は、現代社会における罹患率と死亡率の主要な原因を示しています。血栓塞栓症の病因の徴候には、心筋梗塞、虚血性脳卒中、深部静脈血栓症、および肺塞栓¹が含まれるが、これらに限定されない。病原性血栓症に対処するための安全で効果的な方法の開発を中心に、複数の分野にまたがる膨大な量の進行中の研究が展開されています。血栓症の動脈および静脈の症状の変動と解剖学的位置の変動により、さまざまな治療アプローチが開発されました。ただし、急性期の治療は一般に、プラスミノーゲン活性化剤を介した薬理学的血栓溶解の使用に依存しており、特定の臨床状況下で機械的血栓摘出術の可能性があります²。

新しい薬理学的治療戦略の開発は、基本的に前臨床試験のためのinvivo動物モデルとinvitro消化モデルの両方に依存しています^3,4。In-vivoモデルは、医薬品のクリアランスや薬物との細胞相互作用など、治療効果に関するさまざまな生理学的パラメータの複雑な相互作用を捉える能力から自然に恩恵を受けます。しかし、この同じ複雑さにより、このようなモデルは非常に高価になることが多く、ヒトの生理機能とは大きく異なる動物の基礎と....

プロトコル

以下に示すすべての方法は、治験審査委員会(IRB)のプロトコルおよび機関のヒト研究倫理委員会に準拠しています。すべての健康なボランティアは、献血前に書面でインフォームドコンセントを提供しました。なお、プロトコール内で参照されているすべての材料は、 材料表に記載されています。このプロトコルでは、ヒトの WB と血漿について説明しますが、研究動物の血液と因子が枯渇した血液製剤の使用を購入して代用することができます。

1.全血採取

1. 標準的な瀉血技術を使用して、同意した健康なボランティアから静脈全血(WB)を採取します。
   注意: このプロトコル全体で、血液やその他の感染性の可能性のある物質との接触のリスクを減らすために、普遍的な予防措置が守られていることを確認してください。手袋、白衣、フェイスシールドの使用が必要です。
2. ~50 mL の WB を 3.2% クエン酸ナトリウムチューブに直接集め、すぐに 50 mL チューブにプールして後で使用します。
   注:クエン酸チューブに採血する前にチューブを廃棄することに加えて、チューブがメーカー推奨の量まで充填されていることを確認する必要があります。採集したばかりのWBは、宿主の凝固ダイナミクスを最もよく再現します。WBの室温(使用≤4時間前)での短期保存は許容されます。WBは、トロンボエラスト

結果

チャンドラーループ血栓形成
血栓の形成では、一般的に四重結を目指して、血栓の外れ値(総形態と質量に基づく)が存在する場合でも、三重血栓溶解アッセイを実行する能力があることを確認しました。最適な負荷条件を仮定すると、 図3に示すように、血栓はすべて長さ(~3.3 cm)、重量(~100 mg)、および外観が非常に均一である必要があります。FITC-Fgを採用する際には、紫外線下での血栓の検査も目指し、血餅内の高蛍光標識の不規則な領域とは対照的に、蛍光の比較的均一な分散を確保することを目指しました。全血中のFITC-Fgの程度を変えても、調査した濃度内の血栓の重量や外観は変わらないはずです。ただし、マイクロクロットアーキテクチャは、最も高いFITC-Fg濃度(1:5 FITC-Fgから未修飾Fg)で影響を受けました。Zengらによって行われた先行研究は、選択されたせん断レベル¹⁶に応じて、チャンドラーループで予想される広範囲の血栓表現型を捉えている。

ディスカッション

血栓の形成と標識
チャンドラーループは、 生体内 血栓¹⁶を模倣する血栓を再現性よく生成する容易かつ効果的な手段を提供することが実証されている。チューブのサイズ、回転速度、ドラムの直径、凝固時間などのパラメータを微調整することで、動脈と静脈の両方の源を模倣したさまざまな血栓で評価される建築的特徴を捉えることができる、さまざまなせん断条件下での血栓の迅速な生成が可能になります。FITC-Fgなどのマーカーを導入できるという柔軟性が加わったことで、RT-FluFFシステムで実証したように、これらの血栓の潜在的な用途が広がります。チャンドラーループの基本原理は初歩的ですが、一貫した血栓形成に関連する急な初期学習曲線が残っており、同時に血栓形成プロセス全体で血液と血液製剤を取り扱います。これは、WBの凝固が凝固の開始前後の取り扱いに非常に敏感であるという事実に由来します。特に重要なのは、血液表面の相互作用が血栓形成の進行に影響を与える可能性があるため、チャンドラーループの血栓形成ステップで使用されるチューブの選択です。チューブは、生体反応性.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
30 G 使い捨て皮下注射針	Exel International	26439	その他の消耗品
6 mm HSS旋盤バーストックツール150 mm長い	uxcell	B07SXGSQ82	チャンドラーループ、
96ウェルクリアフラットボトムUV透明マイクロプレート	コーニング	3635	その他の消耗品、未処理アクリル共重合体、非滅菌
エアタイト ルアーロック 非滅菌 60mLシリンジ	エアタイト	MLB3	RT-FluFF装置、ダンパー
アリウムミニプラス 超純水システム	ザルトリウス	NA	DI水源
塩化カルシウム	ミリポア シグマ	C5670	その他の消耗品
ディスポーザブルBPトランスデューサー	ADインスツルメン	MLT0670	RT-FluFF装置
ドレーガー ジーマンス ヘモメッドポッド	ドレーガー	5588822	RT-FluFF装置
ドレーガー ジーマンス 生体情報モニタ	ドレーガー	SC 7000	RT-FluFF 装置
(シリンダー、直径120 mm、幅85 mm)			チャンドラーループ、
フェイスシールド	モックス	SHIELDS10	チャンドラーループ,
ヒト血漿由来フィブリノーゲン、Alexa Fluor 488 コンジュゲート	Thermo Scientific	F13191	その他の消耗品
フィッティング、ポリカーボネート、4方向ストップコック、オス ルアーロック、非滅菌	Masterflex	30600-04	RT-FluFF 装置
フルオレセイン (FITC)	Thermo Scientific	119245000	その他の消耗品
汎用ウォーターバス	Thermo Scientific	2839	チャンドラーループ,
ホットプレート4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF装置
源血漿新鮮冷凍	Zen-Bio	SER-SPL	その他の消耗品、CPDA-1抗凝固剤
人間全血	ゼンビオ	SER-WB-SDS	その他の消耗品、CPDA-1抗凝固剤
L/S Easy-Load II ポンプヘッド 高性能精密チューブ用、PPS ハウジング、SS ローター	Masterflex	77200-62	RT-FluFF 装置、ポンプヘッド
L/S 可変速デジタル駆動ポンプ、リモート I/O 付き、6 から 600 rpm; 90 から 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF 装置、ポンプ
モーター速度コントローラー	CoCocina	ZK-MG	チャンドラーループ、
Nalgene チューブ T 型コネクター	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF 装置
チューブ	マスターフレックス	06424-15	その他の消耗品
リン酸塩緩衝生理食塩水	ミリポアシグマ	P3813	その他の消耗品、粉末、pH 7.4、1 L溶液の調製用
電源	SoulBay	UC03U	チャンドラーループ、
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	その他の消耗品
組織プラスミノーゲン活性化剤、ヒト	ミリポア Sigma	T0831	その他の消耗品
チューブ ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	その他の消耗品、1.5cm セクションにカット チューブを T 型コネクター
に接続するために使用しますチューブID 5/32インチ、OD 7/32インチ	タイゴン	ND-100-65、ADF 00009	その他の消耗品
V3 365 nmミニ - ブラックライトUV懐中電灯	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	チャンドラーループ、DC
モーター、12 V、100 rpm	パンギョー	ZGA37RG	チャンドラーループZGA37RG ZYTD520

ツ ドラム人間チューブ スイッチング、完了した血栓をチェックするために使用されます。