フィブリノーゲン-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による Sipunculus nudus における活性フィブリノゲン分解剤の迅速な分離と表示

サマリー

ここでは、 Sipunculus nudusのフィブリノゲン分解剤を迅速に分離して表示するためのフィブリノーゲン-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)プロトコルを紹介します。

要約

フィブリノーゲンを直接溶解できるフィブリノゲン溶解剤は、抗凝固治療に広く用いられてきました。一般に、新しいフィブリノジェノジェノリシス剤を同定するには、まず各成分を分離し、次にそれらのフィブリノジェノジェノリシス活性を確認する必要があります。現在、分離段階ではポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)とクロマトグラフィーが主に使用されています。一方、PAGEに基づくフィブリノーゲンプレートアッセイおよび反応生成物は、通常、それらのフィブリノジェノ溶解活性を表示するために採用されます。しかし、これら2つのステージは時空間的に分離しているため、同じゲルで活性なフィブリノゲン分解剤を分離して表示することは不可能です。フィブリノジェノジェノリシス剤の同定の分離と表示プロセスを簡素化するために、本研究では、ピーナッツワーム(Sipunculus nudus)のフィブリノゲンゲン剤を迅速に分離して表示するための新しいフィブリノーゲン-PAGE法を構築しました。この方法には、フィブリノーゲン-PAGE調製、電気泳動、再生、インキュベーション、染色、および脱色が含まれます。タンパク質のフィブリノゲン分解活性と分子量を同時に検出できます。この方法によれば、6時間以内にピーナッツワームホモジネートの複数の活性フィブリンゲン分解剤を検出することに成功しました。さらに、このフィブリノーゲン-PAGE法は、時間とコストにやさしいです。さらに、この方法は、他の生物のフィブリンゲン分解剤の研究にも使用できます。

概要

近年、血栓性疾患の増加が続いているため、血栓性疾患は新たな主要な世界的な健康問題となっています¹。現在、抗血栓薬は、抗血小板凝集薬、抗凝固薬、血栓溶解薬の3つに分類されています。その中で、ウロキナーゼ(英国)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)などの血栓溶解薬は、血栓²を加水分解できる唯一の臨床的に使用されている薬です。一方、新規の血栓溶解薬の同定により、より安全で効果的な血栓溶解薬が開発されています³。

しかし、新規血栓溶解剤の同定には、主に分離/精製、特性評価/チェックの段階が含まれ、時間と労力がかかります。前者は各成分を分離することであり、後者はそれらのフィブリノ(ジェノ)分解活性を示す^{ことである4,5}。これまでの研究では、アフィニティークロマトグラフィーとフィブリン(ogen)プレートアッセイ^6,7,8により、ピーナッツワーム(Sipunculus nudus)から新規のフィブリノ(遺伝子)溶解酵素(sFE)を単離することに成功しましたが、これらのプロセスは非常に時間と労力がかかります。まず、ピーナッツワームのホモジネートがフィブリン(ogen)プレート法と反応生成物によってフィブリノ(遺伝子)溶解活性を有するかどうかをPAGE⁹に基づいて判断する必要があります。次いで、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および他の方法などの一連のクロマトグラフィーを、分離および精製^10,11のために実施しなければならない。続いて、フィブリンプレートアッセイを再度実施して、分離された各成分のフィブリンゲン分解活性を確認します。最後に、活性フィブリノゲン分解剤¹²の分子量を決定するために、Native-PAGEおよびdodecyl sulfate(SDS)-PAGEを実行する。したがって、活性なフィブリンゲン分解剤を迅速に分離して表示することが重要です。

ピーナッツワームホモジネート中の活性フィブリノゲン溶解剤を迅速に分離して表示するために、PAGE法とフィブリノーゲンプレート法を組み合わせることにより、新しいフィブリノーゲン-PAGE法、すなわちフィブリノゲン分解剤の基質であるフィブリノーゲンをネイティブ-PAGEゲルに添加して開発した。native-PAGEの後、成分は分子量によって分離されました。一方、各活性フィブリノゲン溶解成分は染色により表示することができる。この方法により、6時間以内にピーナッツワームホモジネートの複数の活性フィブリノゲン分解剤を検出することに成功しました。さらに、このフィブリノーゲン-PAGE法は、時間とコストにやさしいです。さらに、この方法は、他の生物のフィブリンゲン分解剤の研究にも使用できます。

プロトコル

1.ピーナッツワームホモジネートの準備

1. 50 gのピーナッツワームと150 mLの生理食塩水をホモジナイザーに加えます。
2. 24000rpmで60秒間均質化します。
   注意: 3回繰り返します。
3. ホモジネートを9710 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
4. さらなる研究のために、上清をピーナッツワームホモジネートとして収集します。

2. Fibrinogen-PAGEゲル調製

1. 0.01 gのフィブリノーゲンを50 mLのガラスビーカーに秤量します。
2. 1.9 mLのDDH₂O、1.3 mLのTris-HCl(1.5 M、pH 8.8)、および0.05 mLのSDS(10%、w / v)をビーカーに加えます。ピペッティングでよく混ぜます。
3. ビーカーを37°Cに30分間置きます。
   注:このステップは、フィブリノーゲンを溶解することです。
4. アクリルアミド1.7 mL(30%、w / v)、過硫酸アンモニウム0.05 mL(APS;10%、w / v)、TEMED0.002 mLを追加します。ピペッティングでよく混ぜます。
   注:これは分離ゲルです。
5. 分離ゲルを10ウェルゲル型に注ぎます。
6. 2 mLのDDH₂Oをゲル型に加えます。30分待ちます。
7. 型を逆さまにして水を完全に取り除きます。
8. 1.4 mLのDDH₂O、0.25 mLのTris-HCl(1.0 M、pH 6.8)、0.02 mLのSDS(10%、w / v)、0.33 mLのアクリルアミド(30%、w / v)、0.02 mLのAPS(10%、w / v)、0.002 mLのテトラメチルエチレンジアミン(TEMED)をビーカーに加えます。ピペッティングでよく混ぜます。
   注:これはローディングジェルです。
9. ローディングゲルをステップ2.5と同じゲル型に注ぎます。すぐにコームを挿入します。
   注:ここで使用したフィブリノーゲン-PAGEゲルは、分離ゲルとローディングゲルを含むフィブリノーゲン(0.2%)で構成されていました。フィブリノーゲンの濃度は必要に応じて調整できます。

3. 電気泳動

1. 調製したフィブリノーゲン-PAGEゲルを接着剤型と一緒に電気泳動タンクに入れます。1300 mLの電気泳動溶液(1.963 gのTris、12.22 gのグリシン、0.65 gのSDS、および1300 mLのDDH₂O)をタンクに注ぎます。櫛を取り出します。
2. 5 μL の 5x 非変性ローディングバッファーを 20 μL の sFE と 20 μL のピーナッツワームホモジネートに加えます。ピペッティングでよく混ぜます。調製したフィブリノーゲン-PAGEゲルにロードします。
   注:混合物を沸騰させないでください。sFEは^{、以前に同定}されたフィブリノ(遺伝子)溶解酵素であり^、6,7,8であり、この研究ではポジティブコントロールとして使用されます。ピーナッツワームホモジネートは検出されるサンプルです。ブロモフェノールブルー、β-メルカプトエタノール、SDSを含まない非変性ローディングバッファーとSDS-PAGEローディングバッファーの比較。各サンプルレーンは、タンパク質の動きを明確に検出するために、1x SDS-PAGEローディングバッファーで分離されています。
3. 80 Vで30分間、または120 Vで20分間電気泳動を行います。
4. 接着剤の型からfibrinogen-PAGEゲルを取り出します。

4. 再生

1. フィブリノーゲン-PAGEゲルをプラスチックの箱に移します。
2. 100 mLのTris-HCl(0.05 M、pH 7.4)と2 mLのTriton X-100をボックスに加えます。60〜70rpmのシェーカーに10分間置きます。
3. ピペッティングで洗浄バッファーを取り出します。
   注:3回繰り返します。

5. インキュベーション

1. プラスチックの箱にTris-HCl(0.05 M、pH 7.4)50 mLを加えます。
2. 37°Cで4時間インキュベートします。
   注:インキュベーション時間は、フィブリノゲン分解活性の強さに応じて調整できます。

6. 染色

1. ピペッティングでインキュベーションバッファーを取り出します。
2. 50 mLのCoomassie Brillant Blue Staining溶液をボックスに加え、ボックスを60〜70 rpmのシェーカーに30分間置きます。

7. 脱色

1. ピペッティングで染色液を除去します。
2. 50 mLのDDH₂Oをボックスに加えます。
3. ボックスを60〜70rpmのシェーカーに30分間置きます。
   注:ここではDD H₂Oを脱染液として使用しました。振とう時間は、フィブリノゲン分解活性の強さに応じて調整できます。

結果

電気泳動後、マーカーのすべてのバンドがはっきりと表示されました。1x SDS-PAGEのローディングレーンでは、10 kDaのバンド(ブロモフェノールブルー)しか表示されませんでした。sFEとピーナッツワームのサンプルには、観察可能なバンドは見られませんでした(図1)。試料のバンドは見えませんが、マーカーとブロモフェノールブルーの性能は電気泳動が成功したことを示しており、試料は分子量に応じて分離されました。

染色によりゲル全体が青くなってしまいましたが、脱色によりフィブリノゲンがフィブリノゲン分解剤によって分解された部分が透明になりました。マーカーと比較すると、sFEは25 kDa付近の活性なフィブリノゲン溶解バンドを示しました。ピーナッツワームのホモジネートは、25 kDa、33 kDa、43 kDa、および 70 kDa を超える一連のバンドを示しました(図 2)。その結果、sFEには25 kDaのフィブリノジェノジェノ分解成分しか含まれていませんでしたが、ピーナッツワームのホモジネートにはsFE成分と他のフィブリノジェノジェノ溶解剤が含まれていました。 補足図1 は、マーカーを深い青色で示し、標的サンプルを明るいバンドとして示したゲル画像の一例です。

図1:電気泳動後のゲル。 M:マーカー;レーン 1: 1x SDS-PAGE 読み込みバッファー。レーン2:sFE;レーン3:1x SDS-PAGE読み込みバッファ。レーン4:ピーナッツワームホモジネート。レーン 5: 1x SDS-PAGE 読み込みバッファー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:脱色後のゲル。 M:マーカー;レーン 1: 1x SDS-PAGE 読み込みバッファー。レーン2:sFE;レーン3:1x SDS-PAGE読み込みバッファ。レーン4:ピーナッツワームホモジネート。レーン 5: 1x SDS-PAGE 読み込みバッファー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:マーカーを濃い青色で示し、ターゲットサンプルを明るいバンドとして示したゲル画像。 M:マーカー;レーン 1: 1x SDS-PAGE 読み込みバッファー。レーン2:sFE;レーン3:1x SDS-PAGE読み込みバッファ。レーン4:ピーナッツワームホモジネート。レーン 5: 1x SDS-PAGE 読み込みバッファー。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

sFEは^{、私たちのチームが}以前に^3,6,8,13でピーナッツワームから単離した新しいフィブリノ(遺伝子)溶解酵素です。しかし、sFEの同定プロセスには、フィブリノジェノ溶解活性の検出、タンパク質成分の分離、活性確認の段階など、時間と労力がかかりました。簡単な方法として、フィブリノーゲンプレートアッセイは、主に予備スクリーニング段階でサンプルのフィブリノゲン分解活性を確認するために使用されます。しかし、フィブリノーゲンプレートアッセイ法では、どの成分が活性であるかを分離することはできません。したがって、クロマトグラフィーとネイティブ/SDS-PAGEを使用して、活性検出後にそれらの成分を分離する必要があります。その後、反応生成物をSDS-PAGEで再度分解し、基質フィブリノーゲンの分解を確認します。本研究では、基質フィブリノーゲンをPAGEゲルに添加し、フィブリノゲン溶解剤を検出しました。電気泳動、再生、インキュベーション、染色、脱色後、活性フィブリノゲン分解剤の分子量とフィブリノゲン分解活性を同じゲルで明確に示しました。この方法により、ピーナッツワームホモジネートから6時間以内に複数の活性フィブリノゲン分解剤を検出することに成功しました。

最適な結果を得るためには、フィブリノーゲン-PAGEゲルの調製、再生、インキュベーションにもっと注意を払う必要があります。一般的に言えば、フィブリノーゲンの濃度が低いほど、フィブリノゲン溶解ゾーンは無色になり、これは薬剤のフィブリノゲン分解活性を示しています。しかし、フィブリノーゲンの濃度が低いほど、バックグラウンドは無色化になり、フィブリノゲン溶解ゾーンとバックグラウンドを区別することが難しくなります。再生時間は、コンポーネントのフィブリノジェネシス活性に大きく影響します。この時間がPAGEゲル中のSDSを洗い流すのに短すぎると、残留SDSによって成分のフィブリノジェノ分解活性が阻害されます。同様に、インキュベーション時間が短すぎると、フィブリノジェノ溶解反応が完全ではありません。インキュベーション時間が長すぎると、分子量を示すために使用されるマーカーが洗い流されます。本研究では、これらの条件を最適化していますが、これらの条件はピーナッツワームからフィブリンゲン分解剤を分離して表示するように設定しました。したがって、これらの重要なステップの個別の条件は、特定のフィブリンゲン分解剤に従って設定する必要があります。

このフィブリノーゲン-PAGEは、フィブリノーゲン溶解活性を有するフィブリノゲン溶解剤のスクリーニングにのみ適しており、フィブリノーゲン溶解活性またはプラスミノーゲン活性化活性を有する薬剤には適していないことに言及することが重要です。これらの活性を展示したい場合は、フィブリノーゲンをフィブリンまたはプラスミノーゲンに置き換えることで、メソッドを最適化できます。注目に値する別の点は、この研究でテストされた活性フィブリンゲン分解剤はモノマーであり、SDS電気泳動条件下では影響を受けなかったことです。したがって、試験した薬剤がポリマーの場合、この方法は分子量を表示できないネイティブPAGE条件に調整する必要があります。したがって、ここで紹介したフィブリノーゲン-PAGE法は、他のフィブリノゲン溶解剤を迅速にスクリーニングするために最適化できる一般的な基本バージョンにすぎませんでした。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% アクリルアミド/ビスアクリルアミド	Biosharp	BL513B
過硫酸アンモニウム	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
ビーカー	PYREX	2-9425-02
遠心チューブ (1.5 mL)	バイオシャープ	BS-15-M
恒温インキュベータ	ーJINGHONGJHS-400
クーマスブリリアントブルー染色液	Beyotime	P0017F
電子分析天びん	デン	バーTP-213
ブリノーゲン	ソーラーバイオ	F8051
ゲルローディングピペットチップ、バルク	バイオシャープ	BS-200-GTB
ホモジナイザー	AHS	ATS-1500
水平回転発振器	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
ピペットチップ (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
ピペットチップ (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
ピペットチップ (200 μ;L)	Axygene	T-200XT-C
ピペッター (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
ピペット (10µL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ZX98775
ピペッター(200 & micro;L)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ZY20280
ピペッター(50 & micro;L)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ZY15331
冷蔵遠心分離	機	H1650R
ドデシル硫酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	V900859
トリス	ソーラーバイオ	T8060
スHCl	ソーラーバイオ	T8230
トンX-100	ソーラーバイオ	T8200