この研究では、アルツハイマー病(AD)患者33人の単一核トランスクリプトームを解析し、グリア細胞における性特異的なDEGを明らかにしました。機能強化解析では、シナプス、神経、およびホルモン関連の経路が強調されました。主要な遺伝子、すなわちNLGN4Yとその調節因子が特定され、性別特異的ADの潜在的な治療候補が提案されました。
方法論記事
グリアトランスクリプトームプロファイルに基づくアルツハイマー病の性別特異性のためのバイオマーカー同定
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
最近、アルツハイマー病(AD)において多くの性特異的バイオマーカーが明らかになりました。しかし、脳グリア細胞はほとんど報告されていませんでした。この研究では、GEOデータベースに登録されているADの33人の前頭皮質から得られた220,095の単一核トランスクリプトームを分析しました。性特異的差次的発現遺伝子(DEG)は、アストロサイトに243個、ミクログリアに1,154個、オリゴデンドロサイトに572個を含むグリア細胞で同定されました。Gene Ontology(GO)の機能アノテーション解析と京都遺伝子・ゲノム大百科事典(KEGG)のパスウェイエンリッチメント解析により、シナプス、神経、ホルモン関連パスの機能的集中が明らかになりました。タンパク質間相互作用ネットワーク(PPI)は、アストロサイトにおけるMT3、CALM2、DLG2、KCND2、PAKACB、CAMK2D、およびNLGN4Y、ミクログリアにおけるTREM2、FOS、APOE、APP、およびNLGN4Y、およびオリゴデンドロサイトにおけるGRIN2A、ITPR2、GNAS、およびNLGN4Yを主要な遺伝子として同定しました。NLGN4Yは、3つのグリアが共有する唯一の遺伝子であり、ADの性別特異性のバイオマーカーとして同定されました。遺伝子転写因子(TF)-miRNA共調節ネットワークは、NLGN4Yとその標的TCMの主要な調節因子を特定しました。Ecklonia kurome Okam(Kunbu)とHerba Ephedrae(Mahuang)が同定され、ADに対する有効成分の影響が示されました。最後に、KunbuとMahuangの濃縮分析は、彼らがADの性別特異性の治療候補として作用する可能性があることを示唆しました。
概要
アルツハイマー病(AD)は、認知症の60%〜80%を占める世界的な疾患で、罹患率が高い疾患です1。その高い発生率にもかかわらず、ADのメカニズムの病因は明確に描かれておらず、これまで有効な治療法はありませんでした2。ADの主な病態は、神経細胞の萎縮と病理学的破片の蓄積、主に微小管関連タンパク質タウ、およびβ-アミロイド(Aβ)3,4であると特定されました。ADの病因は、異常なオートファジー、酸化ストレス、ミトコンドリア機能障害、炎症、およびエネルギー代謝障害に関連しています5。有病率調査では、AD患者の3分の2が女性であることが証明されました6。ADの性特異的な違いは、病因、臨床症状、予防、および治療に存在します。したがって、ADの性特異的な違いを引き起こす生物学的メカニズムを明らかにし、伝統的な漢方薬(TCM)を標的とすることで、ADの病因を理解し、正確な治療戦略をさらに導くためのより包括的な理論的枠組みを提供できる可能性があります。
神経膠細胞、特にミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイトは、ADの病因に寄与する可能性があります。ADでは、ミクログリアが活性化され、遺伝的に改変され、炎症反応、食作用、およびAβクリアランスに寄与します7,8。アストロサイトは遺伝的に改変され、シナプス活性、イオン恒常性、エネルギー代謝、脂質代謝に影響を及ぼします9。オリゴデンドロサイトは、性特異性を伴って遺伝的に変化し、これがニューロンの喪失、神経原線維変化、および白質病変の一因となります10,11。
本研究では、優れた技術として1核RNAシーケンシング(snRNA-seq)を採用しました。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)と比較して、snRNA-seqは、サンプルの豊富さ、細胞タイプの完全性、およびデータの信頼性の点で利点があります12,13。SnRNA-seqは、ADに焦点を当て、グリア細胞の役割を探求する研究で広く利用されています14,15,16。これらの研究分野で広く採用されていることは、ADにおけるグリア細胞の転写特性に関する貴重な洞察を提供する上での有効性を浮き彫りにしています。snRNA-seqの利点を活用することで、研究者はADの病理におけるグリア細胞の関与に関する重要な情報を明らかにし、潜在的な治療標的を特定することができました。ADにおける性特異的な神経膠細胞転写特性とADの性特異性に対する潜在的なTCMを調査するために、この研究では、NCBI GEO公開データベースからAD患者の前頭皮質からのsnRNA-seqデータを分析しました。性特異的発現差出せ遺伝子(DEG)、Gene Ontology(GO)、京都遺伝子・ゲノム大百科事典(KEGG)、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク、およびgene-TF-miRNAネットワークをさらに解析し、主要なバイオマーカーと潜在的な病因を明らかにします。最後に、潜在的なTCMが提案され、Coremine Medical、TCMIP、およびTCMSPデータベースを検索して、その有効成分を表とともに表示しました。
プロトコル
解析のステップ2から9はRソフトウェアを使用して実装し( 補足図1 および 補足ファイル1を参照)、残りのステップはオンラインプラットフォーム上で実行しました。このプロトコルで使用されるデータベースの詳細(およびWebリンク)は、 資料の表に記載されています。
1. データ取得
- National Center of Biotechnology Informationの一般公開されている Gene Expression Omnibus(GEO) データベースにアクセスしてください。
- 検索ボックスで 「Alzheimer's disease」 という名前のGEOデータを検索します。
- 右側の「 Top Organisms 」を 「Homo sapiens 」として選択します。
注:検索結果は、ホモ・サピエンスのアルツハイマー病に関するデータであった。 - 検索した情報をフィルタリングした後、個々の単一核サンプルのfeatures.tsv、barcode.tsv、matrix.mtxを含む GSE167490 および GSE183068 データファイルをダウンロードします。データセットは、前頭皮質に由来するADの34のサンプルで構成され、17の男性サンプルと17の女性サンプルが均等に分布していました(補足表1)。
2. サンプルのマージ
- コンピュータ上でデータパスとサンプル名を適宜設定します。ダウンロードした34個のサンプルをインポートし、関数名を使用してサンプルに性別固有の名前を割り当てます。
- 関数リストと Read10Xを使用して、すべてのサンプルのSeuratオブジェクトをバッチ処理方式で生成し、パラメータを min.cells = 3 および min.features = 200として指定します。
- RenameCells 関数を使用して、サンプル ID をプレフィックスとしてセル バーコードに追加し、マージ プロセス中にセル バーコードを保持します。これにより、各セルが独自のIDを保持し、マージ後に元のサンプルソースまでさかのぼることができるようになりました。
3.品質管理(QC)
- PercentageFeatureSet 関数を使用して、各細胞のミトコンドリア遺伝子比、赤血球遺伝子比、およびリボソーム遺伝子比を計算します。
- これらの計算された比率を [[ ]] 演算子を使用してメタデータに格納し、この情報を各セルのメタデータに直接アタッチします。
- サブセット機能を利用して細胞ろ過を行い、パラメータを nFeature_RNA > 200、nFeature_RNA < 10000、nCount_RNA < 60000、percent.mt < 10、percent.rb < 5、および percent に指定します。HB<75。
- GSM5106107分析から除外します。
4.バッチ効果チェック
- データ処理を実行します。
- NormalizeData 関数を使用してデータを正規化します。
- FindVariableFeatures 関数を使用して、データセット内の上位 2000 個の変数特徴を特定します。
- RunPCAを使用してデータに対して主成分分析(PCA)17を実施し、50の主成分を保持します。
- 関数 ElbowPlot を使用してエルボー プロットを生成し、後続の解析に最適な次元数を決定します。最初の 50 次元について考えてみましょう。
- ScaleData を使用してデータをスケーリングし、すべてのフィーチャが同等のスケールになるようにします。
- 30 次元に基づく FindNeighbors を使用して最近傍を特定します。
- RunUMAP を使用して UMAP アルゴリズムを適用し、データの次元を 30 次元に減らします。
- 関数 DimPlot を使用して、reduction パラメーターを umap に、group.by パラメーターを orig.ident に設定して、処理されたデータを可視化します。
注:この手順では、縮小されたUMAP空間のデータを視覚化し、元のセルIDでグループ化したプロットを生成できます。UMAPプロットを調べると、バッチ効果の存在が明らかになりました。細胞のバッチまたは実験起源に基づく細胞の明確なクラスタリングまたは分離は、実験バッチが遺伝子発現プロファイルに影響を与えたことを示唆しています。
5. データ統合
- SCTransform 関数を使用してデータを正規化および標準化します。
- ハーモニーアルゴリズム18 を適用して、残りの33の単一核データを統合する。統合には SCT アッセイを使用し、ハーモニーの最大反復回数を 20 に設定します。
- FindClusters 関数を resolution パラメーターを 0.07 に設定して、データ内の個別のクラスターを識別します。
- 指定した次元数 (dims = 30) で RunUMAP 関数を使用して、データの次元をさらに削減し、低次元空間でクラスターを視覚化します。
6. 細胞タイプのアノテーション
- 既存の文献の広範なレビューを通じて、細胞のマーカー遺伝子(補足表2)を収集します。
- 細胞クラスターの不均一性を同定した後、特異的に発現するマーカー遺伝子によって各クラスター細胞の種類を分類します。
- ggplot2パッケージを用いた UMAPの可視化 により、オリゴデンドロサイトは #DB7093 色、興奮性ニューロンは #FF69B4、アストロサイトは #1874CD、ミクログリアは #63B8FF、オリゴデンドロサイト前駆細胞は #DB7093、抑制性ニューロンは #FFC0CB、内皮細胞は #FF69B4 で強調表示されています。
- 性別で層別化された各細胞タイプの比率を計算します。
7. グリア細胞データの抽出
- サブセット関数を用いて、統合バルクデータからアストロサイトデータを抽出します。
- サブセット機能を用いて、統合バルクデータからミクログリアデータを抽出します。
- サブセット関数を用いて、統合バルクデータからオリゴデンドロサイトデータを抽出します。
8. グリア性特異的差次的発現遺伝子(DEG)の捕捉
- FindMarkers関数(ident.1 = 男性、ident.2 = 女性、group.by = group.sum、assay = RNA)を使用して、アストロサイトの性特異的なDEGを同定します。これは、p値が0.05<および|avg_log2FC|>30。アップレギュレーションされた DEG をアップ、ダウンレギュレーションされた DEG をダウン、残りを安定とラベル付けします。
- 関数 ggplot を使用して DEG を視覚化し、x 軸は 2 つの条件 (pct.1 - pct.2) の差をパーセンテージで表し、y 軸はavg_log2FCを表します。アップレギュレーションされた遺伝子はPaleVioletRed、ダウンレギュレーションされた遺伝子はPink、安定遺伝子はDodgerBlue3で強調されました。
- FindMarkers関数(ident.1 = オス、ident.2 = メス、group.by = group.sum、assay = RNA)と閾値(p値 0.05< |avg_log2FC|> 1.アップレギュレーションされた DEG をアップ、ダウンレギュレーションされた DEG をダウン、残りを安定とラベル付けします。
- 関数 ggplot を使用して DEG を可視化し、x 軸は 2 つの条件 (pct.1 - pct.2) の差をパーセンテージで表し、y 軸はavg_log2FCを表します。アップレギュレーションされた遺伝子はOrangeRedの色を使用して強調され、ダウンレギュレーションされた遺伝子はLightSalmonで、安定した遺伝子はSteelBlue1で強調表示されました。
- FindMarkers関数(ident.1 = 男性、ident.2 = 女性、group.by = group.sum、assay = RNA)と閾値(p値 0.05< |avg_log2FC|>10.アップレギュレーションされた DEG をアップ、ダウンレギュレーションされた DEG をダウン、残りを安定とラベル付けします。
- 関数 ggplot を使用して DEG を可視化し、x 軸は 2 つの条件 (pct.1 - pct.2) の差をパーセンテージで表し、y 軸はavg_log2FCを表します。アップレギュレーションされた遺伝子は DeepPinkの色を使用して強調され、ダウンレギュレーションされた遺伝子は HotPinkで、安定した遺伝子は DeepSkyBlue3を使用して強調表示されました。
9. 性特異的DEGの機能強化解析
- enrichGO機能を使用して、各グリア細胞タイプの性特異的DEGに対するGene ontology(GO)エンリッチメント解析を実施します。次のパラメーターを設定します: OrgDb = org。Hs.eg.db、keyType = SYMBOL、ont = ALL、pAdjustMethod = BH、pvalueCutoff = 0.01、qvalueCutoff = 0.05です。
- function bitrを使用して、遺伝子シンボルを対応する遺伝子IDに変換します。 enrichKEGG 機能を用いて、各グリア細胞種の性特異的DEGの京都遺伝子・ゲノム大百科事典(KEGG)のエンリッチメント解析を行う。設定を次のように調整します: organism = has、keyType = kegg、pAdjustMethod = BH、pvalueCutoff = 0.01、qvalueCutoff = 0.05。
10. go経路とkegg経路におけるglial DEGsの頻度統計、各glial性特異的DEGのベン図、およびPPIネットワークの構築
- 頻度ヒストグラムを使用して、GOおよびKEGG経路におけるグリア性特異的DEGの頻度を計算します。
- STRING データベースにアクセスして、PPI ネットワークを構築します。
- [Multiple proteins] を選択します。検索ボックスで名前のリストを検索します。「Organisms」をホモ・サピエンスとして設定します。
- 検索から得られたタンパク質のリストを確認します。 「続行 」をクリックして続行します。
- PPIネットワークをエクスポートするには、ダウンロードオプションを選択し、できれば高解像度のPNG形式でエクスポートします。
- ベン図を使用して、上位の性特異的遺伝子の共発現の分布を視覚化します。
- ベン図解析に基づいて、研究の主要な遺伝子として共有遺伝子を特定します。
11. 多要素規制ネットワークの構築
- NetworkAnalyst にアクセスします。
- Gene List Inputをクリックし、生物をH. sapiens (human)と指定します。IDタイプを公式遺伝子シンボルとして設定します。検索フィールドに遺伝子名を入力し、[アップロードして続行]をクリックします。
- 「Gene-miRNA Interactions」を選択し、「miRTarBase v8.0」を選択します。[OK]をクリックして選択を確定します。
- TF-gene Interactionsに進み、ENCODEデータベースを選択します。[OK]をクリックして選択を確定します。
- 次に、 TF-miRNA Coregulatory Network に移動し、「 OK 」をクリックして続行します。
- 最後に、[ Proceed ] を選択して、遺伝子-miRNA 相互作用と TF-遺伝子相互作用を組み込んだ多因子制御ネットワークを生成します。
12. 遺伝子・標的TCM解析
- Coremine Medicalのオンラインデータベースにアクセスします。
- 特定の遺伝子名を入力し、接尾辞 gene/protein, human が付いた対応する遺伝子を Explore セクションの下の検索ボックスで選択します。
- 「Drugs」セクションに移動し、検索した薬物に関連付けられているTCMを特定します。
注:統計的に有意な薬物は青色でマークされています。 - 治療用TCMとしての「重要性」値に基づいて上位5つのTCMを決定します。
13. 主要遺伝子を標的とするTCM成分の研究概要
- Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine(TCMIP)およびTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(TCMSP)にアクセスできます。検索バーにハーブの名前を入力して、対応する成分を取得します。
- 2023年4月10日までの時間制限付きでPubMedデータベースから成分を取得します。検索語としては、TCMSPの Molecule Name や Chemical Components in TCMIPなど、英語で発表された論文に限定して使用しました。
- ADに作用するハーブとそれに対応する成分を要約し、分析します。
14. ADの性特異性におけるTCMの治療機能の標的化の確認
- ハーブをTCMIPにインポートし、対応する説明ページに移動します。
- データのエクスポート機能を利用し、CSV形式を選択して、GO - Biological Process、GO - Cellular Component、GO - Molecular Function、 およびReactome Pathwayのエンリッチメント条件をダウンロードします。
- ダウンロードした各ハーブのエンリッチメント用語を棒グラフで視覚化します。
結果
前頭葉グリアトランスクリプトームプロファイルのSnRNA-seq解析と細胞種のアノテーション
合計で、男性AD17人、女性AD17人の前頭皮質に220,095個の核と32,077個の遺伝子が取得されました(図1A)。UMAPプロットは、次元縮小解析後に異なるタイプの核を示す全単一核前頭トランスクリプトームを視覚化しました(図1B)。性別別に捕捉された注釈付き核の総数が示され、合計には、58,902個のアストロサイト、14,265個のミクログリア、77,466個のオリゴデンドロサイト、3,520個の内皮細胞、25,252個の興奮性ニューロン、31,268個の抑制性ニューロン、および9,422個のオリゴデンドロサイト前駆細胞が含まれていました(図1C)。各グリアの既知の細胞型マーカーの平均発現をUMAPプロットに投影して、細胞集団を特定しました(図1D)。
アストロサイトにおける性特異的DEG
58,902個のアストロサイト核を解析し(図2A)、そのうち27,504個が男性型ADから(46.69%)、31,398個が女性ADから(53.31%)分析されました。性特異的DEGは、DST、CACNA2D3、およびAC016831.7を含む138の遺伝子のアップレギュレーション、CNTN5、RORA、RASSF8、およびCADM2を含む105の遺伝子のダウンレギュレーション、および変化しない4995遺伝子(図2B)を明らかにしました。さらに、GOとKEGGの解析により、これらのDEGは主にニューロン、シナプス、ホルモンの経路に集中しており、ニューロンプロジェクト発生の制御、ニューロンスパインなどの神経経路、シナプス組織やグルタミン酸作動性/コリン作動性シナプスなどのシナプス経路、甲状腺ホルモン合成やインスリン分泌などのホルモン経路があることが明らかになりました(図2C、D)。最高周波数の遺伝子が30個取得され(図2E)、PLCB1が1位にランクされました。これらの遺伝子間の関係を探るためにPPIネットワークを構築し(図2F)、DLG2、CAMK2D、CALM2、およびPRKACBをコア遺伝子として同定しました。UMAPプロットは、選択したDEGの差を示しました:KCND2、CAMK2D、MT3、LINC00278、およびXISTは女性のADで高く、男性ADで低く、NLGN4Y、DLG2、PRKACB、CALM2、UTY、およびTTTY14は反対でした(図2G)。表 1に示すように、MT3、CALM2、DLG2、KCND2、PRKACB、CAMK2D、およびNLGN4Yは、最終的にアストロサイトの性特異的DEGとして決定されました。
ミクログリアの性特異的DEG
14,265個のミクログリア核(図3A)が解析され、そのうち5,327個(37.34%)が男性ADから、8,938個(62.66%)が女性ADからでした。性特異的DEGは、KCNIP4やLRRTM4を含む224個の遺伝子のアップレギュレーションと、APOE、MT-CO3、FTLを含む930個の遺伝子のダウンレギュレーション、および変化のない13,111個の遺伝子(図3B)を明らかにしました。さらに、GOとKEGGの解析により、これらのDEGは主にニューロン、ファゴソーム、ホルモンなどの経路に集中しており、ニューロン間シナプスなどのニューロン経路、ファゴソームを含む食細胞経路と食作用の調節、エストロゲンシグナル伝達経路、オキシトシンシグナル伝達経路などのホルモン経路、炎症反応の制御、学習または記憶、アミロイドベータクリアランスなどの神経経路が中心であることが明らかになりました。 など(図3C、D)。最高頻度の遺伝子が30個得られ、TLR2とTREM2が同率で2位となりました(図3E)。これらの遺伝子間の関係を探るためにPPIネットワークを構築し(図3F)、ACTB、APP、およびFYNをコア遺伝子として同定しました。UMAPプロットでは、選択したDEGの差が示されました:APP、FOS、XIST、およびCTSDは女性のADで高く、男性のADで低く、NLGN4Y、TREM2、LINC0028、APOE、UTY、およびTTTY14は反対でした(図3G)。 表2に示すように、TREM2、FOS、APOE、APP、およびNLGN4Yは、最終的にミクログリアの性特異的なDEGとして決定されました。
オリゴデンドロサイトにおける性特異的DEG
77,466個のオリゴデンドロサイト核を解析し(図4A)、そのうち42,469個が男性型ADから(54.82%)、34,997個が女性ADから(45.18%)分析されました。性特異的DEGは、PCDH9、MT-CO1、NEAT1、NPAS3を含む384の遺伝子のアップレギュレーション、FRMD4A、PLP1、LSAMPを含む188の遺伝子のダウンレギュレーション、および残りの76,894遺伝子のダウンレギュレーションを明らかにしました(図4B)。さらに、GOおよびKEGG解析により、これらのDEGは主にニューロン、シナプス、およびホルモンの経路に集中しており、ニューロンスパインを含むニューロン経路、ニューロン間シナプスおよびグルタミン作動性/ドーパミン作動性シナプスを含むシナプス経路、およびニューロトロフィンシグナル伝達経路、アルドステロン合成および分泌、カルシウムシグナル伝達経路などのホルモン経路があることが特定されました(図4C、D)。最高周波数の遺伝子が30個得られ(図4E)、GRIN2AとPSEN1が同率で2位となりました。これらの遺伝子間の関係を探るためにPPIネットワークを構築し(図4F)、GRIN2AとGRIA2をコア遺伝子として同定しました。UMAPプロットは、選択したDEGに差を示しました:GRIN2A、ITPR2、GNAS、およびXISTは女性のADで高く、男性のADで低く、NLGN4Y、UTY、およびTTTY14は逆でした(図4G)。GRIN2A、ITPR2、GNAS、およびNLGN4Yは、 表3に示すように、最終的にオリゴデンドロサイトの性特異的DEGとして決定されました。
主要遺伝子とグリア細胞の上位30遺伝子との相互作用、および共通の共有遺伝子としてのNLGN4Y
ベン図とPPIネットワークは、各グリア細胞の主要な遺伝子(図5A、B)と上位30の遺伝子(図5C、D)との間の密接な相互作用の概要を提供しました。その結果、ACYB、APP、JUN、PRKACB、およびDLG2がPPIネットワークの中核であり、NLGN4Yはすべてのグリア細胞の性特異的DEGに共通する共有遺伝子であることが示されました。
Gene-TF-miRNAネットワークの構築
NLGN4Y-TF-miRNAネットワークには、13のノードと12のエッジが含まれていました(図6A)。NLGN4Yは、1つのTF、すなわちCTCFと、has-miR-185、has-miR-137、has-miR-9を含む11のmiRNAによって制御されていました。
NLGN4Yの標的薬剤とTCMをネットワークで表示
Coremine Medicalでは、合計1つのNLGN4Y標的薬と64の間接標的TCMが取得されました。結果に統計的有意性があるTCMは青色でマークされています。薬剤Antithrombin IIIと、ネットワークを持つ5つのTCM(Heikunbu、Wulingzhi、Xiazhicao、Shuizhi、Mahuang)を視覚化し、統計的に有意であると考えました(図6B)。
標的TCMおよび対応する有効成分のADへの影響
Kunbuについては、TCMIPの10の成分とTCMSPの48の成分が取得されました。PubMedデータベースを検索したところ、ADに関連する5つの成分(フコステロール、サリンステロール、チアミン、ステアリドン酸、フロロフクロエッコール-A)が取得され、そのうち最初の2つの経口バイオアベイラビリティ(OB)は≥30%、薬物性(DL)と同程度のもの(DL)は≥0.18でした。詳細を 表4に示します。Mahuangについては、TCMIPの28の成分とTCMSPの363の成分が回収されました。クンブと同じ方法で、ADに関連する25の成分が回収されました。その中で、OB≥30%、DL≥0.18の6つの成分、ケルセチン、エリオディクチオール、ナリンゲニン、タキシフォリン、スティグマステロール、ルテオリンが表 5の一番上にリストされています。
Hurb-gene-disease networkとエンリッチメント解析
Hurb-gene-diseaseネットワークを 図6Cに示します。KunbuとMahuangの共通の標的遺伝子はACEであり、その関連疾患はADと認知障害でした。Kunbu単独の標的遺伝子はALKBH3とELOVL4であり、それぞれ老化と脳萎縮に関連する疾患でした。
Kunbu(図7A、 図8A、 図9A)とMahuang(図7B、 図8B、 図9B)のGOエンリッチメント(BP、MF、CC)の結果が棒グラフで表示されます。Kunbu(図10A)とMahuang(図10B)のReactome経路も示されています。矢印でマークされた濃縮された用語は、クンブのステロイドホルモン受容体活性、ニューロン投射、ステロイドホルモン媒介シグナル伝達経路、馬黄の化学シナプス伝達、エストロゲン依存性遺伝子発現、神経系プロセスなど、「ホルモン-シナプス-ニューロン」軸に関連していました。
図1:遺伝子発現データの取得、単一核RNA-seqプロファイリング、および細胞タイプの特性評価 (A)解析準備のためにGEO DataSetsから取得したサンプル。(B)和核の2次元UMAPプロット(男性の場合N = 116,101;N = 103,994 (女性の場合)。(C)性別で分割された各タイプの細胞の割合。(D)UMAPプロット上に投影された5つの確立された細胞型マーカーの平均発現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:アストロサイトは不均一で、アルツハイマー病では性特異的なトランスクリプトーム変化があります。 (A)アストロサイト核のUMAPプロット(N = 59,010)。(B)性別特異的なDEG。(C,D)円プロットは、GOおよびKEGGデータベース(GO: C、KEGG: D)から得られたアストロサイトDEGの有意な機能的に濃縮された用語を示しています。(E)GOおよびKEGG経路で最も頻度の高いアストロサイト性DEGの上位30位。(F)GOおよびKEGG経路で最も頻度の高いアストロサイト性DEGの上位30のPPIネットワーク。(G)UMAPプロットに投影された顕著な性特異的DEGの平均発現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ミクログリアは不均一であり、アルツハイマー病では性特異的なトランスクリプトーム変化を呈する(A)ミクログリア核のUMAPプロット(N = 14,265)。(B)性別特異的なDEG。(C,D)円プロットは、GOおよびKEGGデータベース(GO:C、KEGG:D)から得られたミクログリアDEGの有意な機能的に濃縮された項を示した。(E)GOおよびKEGGpathwaysにおける最も頻度の高いミクログリア性DEGの上位30位。(F)GOおよびKEGG経路で最も頻度の高い上位30のミクログリア性DEGのPPIネットワーク。(G)UMAPプロットに投影された顕著な性特異的DEGの平均発現。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:オリゴデンドロサイトは不均一であり、アルツハイマー病において性特異的なトランスクリプトーム変化を有する。 (A)オリゴデンドロサイト核のUMAPプロット(N = 77,466)。(B)性別特異的なDEG。(C,D)円プロットは、GOおよびKEGGデータベース(GO: C、KEGG: D)から得られたオリゴデンドロサイト性DEGの有意な機能的に濃縮された用語を示しています。(E)GOおよびKEGG経路で最も頻度の高いオリゴデンドロサイト性DEGの上位30位。(F)GOおよびKEGG経路で最も頻度の高いオリゴデンドロサイト性DEGの上位30のPPIネットワーク。(G)UMAPプロットに投影された顕著な性特異的DEGの平均発現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:DEGと最高周波数DEGのPPIネットワークのオーバーラップ (A,B) 各グリアの主要な遺伝子と対応するPPIネットワークを示すベン図。(C,D)GOおよびKEGG経路および対応するPPIネットワークが豊富な各グリアの上位30の頻繁な性特異的DEGを示すベン図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:NLGN4Yとその標的TCMをコアとしたネットワーク図(A)Gene-TF-miRNA共制御ネットワーク。(B) NLGN4Yの遺伝子-薬剤-TCMネットワーク。(C)クンブとマファンのTCM遺伝子疾患ネットワーク。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:クンブとマフアンのGO(BP)濃縮分析 (A)クンブの濃縮生物学的プロセストップ20。(B)馬黄の濃縮生物学的プロセストップ20。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:GO(MF)KunbuとMahuangの濃縮分析 (A)Kunbuの濃縮分子機能トップ20。(B)馬黄の上位20の濃縮分子機能。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:KunbuとMahuangのGO(CC)濃縮分析(A)Kunbuの上位20の濃縮細胞成分。(B)Mahuangの上位20の濃縮細胞成分。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:クンブとマフアンのリアクトーム経路 (A)クンブのリアクトーム経路。(B)馬黄のリアクトーム経路。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:アストロサイトにおける性特異的DEGの主要遺伝子。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:ミクログリアの性特異的DEGの主要な遺伝子。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:オリゴデンドロサイトにおける性特異的DEGの主要遺伝子。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:ADのクンブの有効成分。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表5:ADのMahuang'有効成分。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:Rソフトウェアの使用方法のスクリーンショット。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:サンプル情報。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:マーカー遺伝子。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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ディスカッション
性別特異性は、AD19の疫学、病理学、および臨床症状で特定されています。本研究では、AD患者の性別特異的グリア遺伝子と関連経路から、「ホルモン-シナプス-ニューロン軸」の病態メカニズムの可能性を確認しました。NLGN4Yは、3つのグリアで唯一共有される遺伝子であり、ADの性別特異性のバイオマーカーとして選択されました。NLGN4Yを調節するTFおよびmiRNAは、性差と神経系の発達と強く関連していました。さらに、標的であるTCMであるKunbuとMahuangは、「ホルモン-シナプス-ニューロン」軸に影響を与える可能性があると考えられており、性別特異性の調節によりADの治療候補として作用することが確認されました。
Harmonyアルゴリズムは、希少細胞のデータを統合し、大規模なサンプルのメモリ使用量と計算速度を最適化し、多様な細胞源と技術プラットフォーム18による複雑な実験デザインに対応することにより、他の統合アルゴリズムに比べて明確な利点を提供しました。QCとデータ統合セクションは、分析の精度と信頼性を高めるための重要な要素であり、研究者がADやその他の神経変性疾患の生物学についてより深い洞察を得ることを可能にしました。これらのステップを綿密に実行することは、単一核RNAシーケンシング実験から得られた結果の全体的な品質と妥当性を達成するために極めて重要です。
このプロトコルで行われた変更の1つは、データ20を正規化および標準化するためのSCTransform関数の使用であった。このステップにより、データが比較可能になり、さらなる分析のために標準化されることが保証されました。バッチ効果を軽減するために、データ統合の追加ステップが取られ、バッチ効果を修正し、結果の精度を向上させるのに役立ちました。トラブルシューティングは、サンプルの1つ(GSM5106107)が他のサンプルと比較して異常なパフォーマンスを示し、分析から除外された場合に実施されました。
この研究の1つの制限は、採用されたサンプルサイズが比較的小さいことに関係しており、その結果、調査結果の代表性がより広範な集団に限定される可能性がある。さらに、複数の研究室や研究グループからのデータを利用すると、固有の不均一性が生じ、結果の再現性と一般化可能性が制限される可能性があります。NLGN4Yの主要な制御因子の同定は、遺伝子-TF-miRNA共制御ネットワークを通じて達成されましたが、これらの制御因子に起因する機能的役割と根本的なメカニズムを確認するためには、さらなる実験的検証が必要でした。エンリッチメント解析では、MahuangとKunbuが性別特異的なAD治療の潜在的な候補であることが示唆されましたが、バイオインフォマティクスの予測のみに頼るだけでは、その有効性と安全性を確立するには不十分でした。これらの有望な薬剤の治療効果を検証するためには、さらなる実験と臨床研究が不可欠でした。
この研究で描かれたアプローチは、特にADのグリア細胞内の性特異的DEGの識別において、多様な研究領域に対して大きな可能性を示しました。このような研究は、男性と女性の間の微妙な病原性格差を解明し、その結果、性別特異的な治療介入の定式化を促進することが期待されています。さらに、この手法の適用性は他の神経変性疾患にも広がり、性特異的なDEGを特定し、疾患の根底にあるメカニズムの理解を深める機会を提供しました。
結論として、この研究は、AD患者からの単一核RNAシーケンシングデータを分析するための包括的で堅牢なプロトコルを提示し、カスタマイズされた治療介入の開発への道を開く可能性があります。さらに、本研究で採用された方法論は、他の神経変性疾患にも拡張される可能性があり、性特異的な遺伝子発現パターンを明らかにし、これらの複雑な疾患の理解を深める機会を提供します。
開示事項
この原稿には利益相反はなく、すべての著者が出版のための投稿を承認しています。
謝辞
著者は、GSE167490データセットを提供してくれた Jessica S Sadick、Michael R O'Dea、Philip Hasel などに感謝しています。著者らは、Faten A Sayed、Lay Kodama、Li FanなどがGSE183068データセットを提供していることを高く評価しています。著者は、データ分析の支援を提供してくれたShuqing Liuと、データ分析プラットフォームを提供してくれたWen Yangに感謝します。この研究は、中国国立自然科学基金会(82174511)、成都伝統中国医学大学アプリコットグローブ奨学生、規律人材研究強化プログラム(QJJJ2022001)、遼寧活性化人材プログラム(XLYC 1807083)、四川行政局中医薬薬薬基金(2023MS578)、全国学部イノベーションおよび起業家精神トレーニングプロジェクト(202310633003X)、および科学研究実践の革新的なトピックの支援を受けました成都中国伝統医学大学(ky-2023100)の大学生向け。Hanjie LiuとHui Yangは、研究のデザイン、データの収集、データの解釈、原稿の起草と改訂に貢献しました。Shuqing LiuとSiyu Liは、研究のデザイン、データの収集、原稿の起草に参加しました。ウェン・ヤンとアンワル・アイシャは、データの収集と解釈を担当しました。Xin Tanは図や表を用意しました。Cen Jiang、Yi Liu、Lushuang Xieが研究を考案し、原稿をレビュー/編集しました。すべての著者が記事に貢献し、提出されたバージョンを承認しました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Database | |||
| Coremine Medicalデータベース | ノルウェー、中国科学院、中国医学院、米国国立医学図書館、その他の機関 | CoreMine Medicalで概念を探索すると、重要な概念を関連付けるように構造化されたデータベースにアクセスし、統計的関連性によってランク付けされます。 あなたのトピックに。たとえば、「アルツハイマー病」と入力すると、その病気について説明するドキュメントやリソースを取得するだけでなく、クエリの概念が他の生物医学の概念とどのように関連しているかを示すネットワークやリストを表示することができます。これは、検索に関連する概念の概要を提供するだけでなく、これらの概念に関する情報をナビゲートするためのインターフェースでもあります. Weblink: | |
| https://coremine.com/medical/ Gene Expression Omnibus (GEO) | National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI) | GEOは、MIAME準拠のデータ提出をサポートする公開機能ゲノミクスデータリポジトリです。配列ベースおよびシーケンスベースのデータを使用できます。 Weblink: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine (TCMIP, version: 2.0) | なし | Integrated Pharmacology Based Network Computational Research Platform for Traditional Chinese Medicine [TCMIP v2.0], http://www.tcmip.cn/ ) インテリジェントなデータマイニングです医療ビッグデータ管理と薬理学的コンピューティングサービスを統合したEncyclopedia of Traditional Chinese Medicine(ETCM)のオンラインデータベースに基づくプラットフォーム。それは、伝統的な漢方薬理論の科学的な意味合いと伝統的な漢方薬における独創的な思考の科学的価値を明らかにし、有名な医師の経験を要約して伝え、伝統的な漢方薬の品質を制御し、伝統的な漢方薬の行動の原則を説明し、新しい漢方薬の研究開発、特に現代の薬物の組み合わせの発見と最適化、 強力なデータ基盤と分析ツールを提供します。TCMIP v1.0 をベースとして、5 つの主要なデータベースと 7 つの機能モジュールを含む包括的なアップグレードが実装されています。システム統合とモジュール統合により、「疾患症候群処方」相互作用ネットワークのマルチレベル相関の包括的な分析を迅速に達成できます。インテリジェントなデータマイニングプラットフォームとして、TCMIP v2.0は、伝統的な漢方薬理論の科学的意味合いと伝統的な漢方薬における独自の思考の科学的価値を明らかにするための強力なデータ基盤と分析プラットフォームを提供し、有名な医師の経験を要約して継承し、伝統的な漢方薬の品質管理を行い、伝統的な漢方薬の行動の原則を解明します。 新しい伝統的な漢方薬、特に現代の薬剤の組み合わせの発見と最適化の研究開発. Weblink: http://www.tcmip.cn/TCMIP | |
| NetworkAnalyst | None | Networkanalyzeは、遺伝子発現解析およびメタアナリシスのためのオンライン可視化解析プラットフォームです。遺伝子発現の比較、定量、差分、濃縮分析、タンパク質間相互作用分析、複数のデータセットの統合分析を行うことができ、PCA、タンパク質間相互作用ネットワーク図、ヒートマップ、火山図、ウェイン図などの高価値画像も描画できます Weblink: | |
| https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/ PubMedデータベース | 米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI) | Pubmedデータベースは、米国国立医学図書館(NLM)が管理する生物医学文献データベースで、最新の医学研究成果を世界中の科学者、医師、研究者、学生に提供することを目的としています。このデータベースは、ジャーナル記事、論文、書籍など、世界中の生物医学文献を収集しています。現在、Pubmedのデータベースには3000万件以上の記事が収集されており、毎週更新されています Weblink: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ | |
| Rソフトウェアの | Ross IhakaとRobert Gentleman | Rは、統計計算とグラフィックスのための言語と環境です。これは、ベル研究所(旧AT&)で開発されたS言語と環境に似たGNUプロジェクトです。T、現在のLucent Technologies)ジョン・チェンバースと同僚による。R は、S の異なる実装と見なすことができます。いくつかの重要な違いがありますが><、S用に書かれた多くのコードは、R. Weblinkの下で変更されずに実行されます: | |
| https://www.r-project.org/ Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP) | Zhejiang Jiuwei Health Co., Ltd | TCMSPは、データリポジトリであるだけでなく、ユーザーが伝統的な漢方薬(TCM)を包括的に研究するための分析プラットフォームでもあります。 有効成分の同定、薬物標的のスクリーニング、化合物-標的-疾患ネットワークの生成、および薬物類似性(DL)、経口バイオアベイラビリティ(OB)、血液脳関門(BBB)、腸上皮透過性(Caco-2)、ALogP、フラクショナルネガティブ表面積(FASA-)および の数を含む詳細な薬物動態情報が含まれます。Hボンド ドナー/アクセプター (Hdon/Hacc)。これまでのところ、TCMSPは幅広い注目を集めており、いくつかのグループは、約1年以内にTCMSPデータベースを使用して10以上の論文を発表しています https://tcmsp-e.com><。 |
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