方法論記事

再発寛解型実験的自己免疫性脳脊髄炎におけるCD4 T細胞の役割

DOI：

10.3791/66553

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2024年1月19日

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1School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, 2Preparation Center, General Hospital of Ningxia Medical University, 3Institute of Neurological Diseases, First People's Hospital of Shizuishan, 4Department of Neurology, Xianyang Hospital of Yan’an University, 5Department of Pharmacy, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, 6Department of Pharmacy, General Hospital of Ningxia Medical University

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この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルを使用して、活性化段階と免疫効果機能の観点から、EAEの初期および再発におけるCD4T細胞の役割を調査しました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多発性硬化症(MS)は、免疫細胞の浸潤と中枢神経系(CNS)での脱髄を特徴とする自己免疫疾患です。実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) は、多発性硬化症を研究するためのプロトタイプ動物モデルとして機能します。本研究では、CD4 T細胞がEAEの開始と再発に関与する役割について、活性化期と免疫応答に着目して検討することを目指しました。EAEマウスモデルを作成するために、雌マウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55を完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化して免疫しました。臨床スコアは毎日評価され、その結果、EAEグループのマウスは古典的な再発寛解パターンを示したことが示されました。ヘマトキシリン-エオシン(H&E)およびルキソールファストブルー(LFB)染色分析により、中枢神経系の炎症細胞の有意な浸潤とEAEマウスの脱髄が明らかになりました。活性化期については、CD4+CD69+エフェクターT(Teff)細胞とCD4+CD44+CD62L-エフェクターメモリーT(Tem)細胞の両方がEAEの開始に寄与している可能性があるが、再発期はCD4+CD44+CD62L-Tem細胞が優勢であった可能性が高い。さらに、免疫機能に関しては、ヘルパーT(Th)1細胞が主にEAEの開始に関与しています。しかし、Th1細胞とTh17細胞の両方が再発期に寄与し、EAEの病理学的過程では制御性T(Treg)細胞の免疫抑制機能が阻害されました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多発性硬化症(MS)は、免疫細胞による中枢神経系(CNS)の浸潤と脱髄を特徴とする自己免疫疾患です1,2。最近の研究では、若者が罹患する最も一般的な障害疾患であり、その発生率は世界中で継続的に増加していることが示されています3。実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) は、ヒト MS4 の炎症期の多くの側面をシミュレートする MS のプロトタイプ動物モデルです。免疫機能の観点から、まだ抗原に遭遇していない最初のCD4 T細胞はヘルパーT(Th)0細胞と呼ばれます。これらの細胞は、成熟と活性化の過程を経て、さまざまな機能を発揮します。CD4 T細胞は、その特定の機能に応じて、Th1、Th2、制御性T(Treg)、濾胞ヘルパーT(Tfh)、Th17、Th9、およびTh22細胞5を含む、いくつかのサブセットに分類することができる。Th1およびTh17細胞サブタイプがEAE6の重要な病因因子であることは、一般的なコンセンサスです。Th1細胞はインターフェロンγ(IFN-γ)を分泌し、Th17細胞はインターロイキン(IL)-17やその他の炎症因子を分泌し、ミクログリア細胞や星状細胞などの他の免疫細胞を活性化する可能性があります。これらの細胞は、IL-18、IL-12、IL-23、IL-1βなどの炎症性サイトカイン7を産生し、Th1/Th17細胞の免疫応答をさらに誘導し、進行性の脱髄と軸索損傷を引き起こす可能性があります。活性化期の観点からは、CD4 T細胞は、ナイーブT細胞、エフェクターT細胞、メモリーT細胞8を含む、異なる細胞サブセットおよび分化状態に発達する所定の運命を持っている。最初のCD4 T細胞は増殖し、異なる環境で異なる機能を持つさまざまなエフェクターサブセットに分化する9。ほとんどのエフェクター細胞は短命であり、少数のT細胞がメモリーT細胞に成長し、同じ抗原に再遭遇したときに迅速なエフェクター機能を示し、宿主に非常に強力で長期的な保護を提供する10,11。

現在の研究では、CD4 T細胞がEAEの発症に重要な役割を果たしていることが示唆されていますが、活性化段階と免疫効果機能に基づいて分類されたさまざまなCD4 T細胞サブセットがEAEの開始と再発にどのように寄与しているかはまだ不明です。本研究では、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55ペプチドを免疫することにより、C57BL6/JマウスにEAEモデルを確立し、CD4 T細胞の活性化期と免疫機能に着目して、EAEの開始と再発を調査しました。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、6週齢から8週齢の雌C57BL/6Jマウス計18匹を対照群(n = 6)とEAE群(n = 12)に無作為に分けました。マウスは寧夏回族自治区医科大学の実験動物センターから購入しました。マウスは、温度と湿度が制御された部屋に収容され、12時間の明暗サイクルがあり、新鮮な水と食物に自由にアクセスできました。倫理承認は、研究開始前に寧夏回族自治区医科大学の実験動物倫理委員会から取得されました。

1. C57BL/6マウスにおける再発寛解型EAEの開発

  1. 試薬の溶解
    1. 5.4 mg MOG35-55(材料表)を1.8 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液に溶解します。12.6 mgの結核菌H37RA(材料表)を秤量し、1.8 mLの完全フロイントアジュバント(CFA)溶液(材料表)に加えます。360μLの百日咳毒素(PTX; 資料表)ピペットを使用して7.2mLのPBSに(Table of Materials)。.
  2. MOG35-55およびCFAのエマルジョンの調製
    1. ステップ1.1で調製した2つの5mLシリンジを使用してMOG35-55溶液とCFA溶液をピペットし、ティーバルブで接続します。乳白色の油中水型エマルジョンが得られるまで、氷上で1時間連続的に混合します。
      注:エマルジョンは、水に落とした後、水面に分散することなく水面に浮いているときに正常に調製されます。
  3. マウス麻酔
    1. 麻酔器の蒸発器の前端にある充填シールキャップを緩めます。中央のシールネジに沿って20mLのイソフルランをゆっくりと注ぎ、充填シールキャップをロックします。ティーバルブスイッチを切り替えて、麻酔器の蒸発器からの空気の流れが麻酔誘導ボックスと通信されるようにします(材料の表)。
    2. エアポンプ電源を接続し、エアポンプスイッチをオンにし、酸素流量計の前端にある空気源バルブを回転させて調整し、出力ガス流量が400mL / minになるようにします。蒸発器を開き、誘導濃度を3%に調整し、麻酔薬が誘導ボックスを満たすのを待ちます。
    3. 約1分後、マウスを誘導ボックスに入れ、誘導ボックスを閉じて、マウスが深い眠り、筋肉の弛緩、安定した呼吸に入るのを待ちます。その後、マウスを麻酔の理想的な状態として決定することができました(材料の表)。
      注意: ティーバルブスイッチを切り替えて、マウスが完全に麻酔されるまで、麻酔器の蒸発器からの空気の流れが麻酔マスクと通信されるようにします。
  4. マウスの免疫
    1. ステップ1.2で調製したエマルジョン200μLを、マウスの背中の4つの部位、EAEグループマウスの腋窩と鼠径部12 の脊椎の両側に針を刺した1mLシリンジを使用して皮下注射します。各部位に50μLのエマルジョンを使用してください(材料表)。
  5. PTXインジェクション
    1. 尾を引っ掛けてマウスをケージから取り出し、ケージワイヤーの上に置きます。マウスの尻尾を4本目と5本目の指で持ち、そっと引き上げることで、体と手足が前に進む傾向を保ちます。マウスの頭をつかみ、中指と薬指を使用してマウスの背中の皮膚を捕らえます。
    2. ステップ1.4の免疫後0時間および48時間後に、針付き1mLシリンジを使用して、中腹部ラインの両側に沿って0.5cmの位置に腹腔内PTX200μLを注入します。
      注:MOG35-55の免疫後48時間でPTXを注入する前に、ステップ1.3で説明した手順を使用してマウスに麻酔をかける必要があります。マウスは、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで世話をする必要があります。
    3. 対照群のマウスについては、同じ方法を使用して生理食塩水で治療し、臨床スコアを毎日評価します。
      注:マウスは、次のスケール13に従ってEAEの徴候について評価されました:0 =病気の症状なし、1 =尾の完全な麻痺、2 =部分的な後肢麻痺/脱力感、3 =完全な後肢麻痺、4 =前肢と後肢の麻痺、および5 =瀕死の状態。

2. 組織学的染色解析

  1. ブレインコレクション
    1. ステップ1.3に従ってマウスを麻酔します。子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させ、胸を開いて心臓を完全に露出させます。耳介を切って、左心室に針付きの20mL注射器を使用して、予冷した生理食塩水でゆっくりと灌流します。
    2. 4%パラホルムアルデヒドで尾先が上を向いて体が硬くなり、肝臓が丈夫になるまでゆっくりと灌流します。頭を斬首し、頭蓋骨を切り、ピンセットを使用して脳を採取し、4%パラホルムアルデヒド溶液に24時間固定します(資料表)。
  2. パラフィン切片の調製
    1. 勾配脱水:ステップ2.1から脳組織を70%エタノールに1時間、80%エタノールに1時間、95%エタノールに1時間、無水エタノールに1時間連続して浸漬し、新鮮な無水エタノールと交換し、1時間浸漬を続けます(材料の表)。
    2. 透明性:ステップ2.2.1の脳組織をキシレンに30分間浸漬し、新鮮なキシレンと交換し、組織が透明になるまで浸漬を続けます(材料の表)。
    3. 埋め込み:ステップ2.2.2の脳組織をパラフィンに1時間埋め込み、新鮮なパラフィンと交換し、1時間埋め込み続け、離型後に6μmスライスに切断し、スライドをお湯に入れ、37°Cで乾燥させ、室温で保存します(材料表)。
    4. 脱ロウ:ステップ2.2.3の脳組織をキシレンに20分間浸漬し、新鮮なキシレンと交換し、20分間浸漬を続け、無水エタノールに5分間入れ、新鮮な無水エタノールと交換し、5分間浸漬し、75%エタノールを5分間浸し、水道水ですすいでください(材料の表)。
    5. ヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色:ステップ2.2.4の組織をヘマトキシリン溶液で3〜5分間染色し、水道水ですすいでください。組織をヘマトキシリン分化溶液で短時間処理し、水道水で十分にすすいでください。ヘマトキシリンスコットタップブルーイング溶液で組織を処理し、水道水ですすいでください。85%エタノールに5分間、95%エタノールに5分間浸漬し、ステップをエオシン色素で5分間染色します(材料表)。
    6. 脱水:ステップ2.2.5から組織を無水エタノールに連続して5分間浸漬し、新鮮な無水エタノールと交換し、5分間浸漬を続けます、新鮮な無水エタノールと交換し、5分間浸漬し、キシレンを5分間浸し、新鮮なキシレンと交換し、5分間浸漬し、中性ガムで密封します(材料の表)。
    7. 顕微鏡を用いて脳組織を観察し、画像取得・解析を行います(資料表)。

3. LFB染色分析

  1. ミエリン鞘コレクション:マウスの背骨を頭端から2セグメント上方へ、尾端から2セグメント下方まで切断し、脊髄を尾端まで吹き飛ばし、脊髄を4%パラホルムアルデヒド溶液で24時間固定します。
    注:ミエリン鞘はステップ2.1で同じマウスから採取され、心臓灌流のステップは2.1と同じです。
  2. パラフィン切片の脱パラフィンと再水和:ステップ3.1のスライドをキシレンに連続して20分間入れ、新鮮なキシレンと交換し、20分間浸漬を続け、無水エタノールを5分間、新鮮な無水エタノールと交換し、5分間浸漬し、75%アルコールを5分間浸し、水道水で洗浄します。
  3. 速乾性青色染色:ルキゾール速乾性青色染色溶液Aを60°Cのオーブンに入れ、30分間予熱します。ステップ3.2のスライドを溶液Aに入れ、スライスが乾燥しないようにプラスチックメンブレンで1時間覆った後、スライドを取り出して水道水ですばやく洗います。
  4. 背景の分化:ステップ3.3のスライドをルキソール速粘液Bに2秒間(染料が熱い間)、直接ルキソール速粘青色染色液Cに浸して分化し、ミエリン鞘が青くなり、背景がほぼ無色になるまで水で洗浄します。
  5. エオシン対比染色:ステップ3.4のスライドを65°Cのオーブンに入れて乾燥させます。完了したら、オーブンから取り出して冷まします。スライドを95%エタノールとエオシンの対比染色に1分間入れます。
  6. 脱水とシーリング:ステップ3.5のスライドを無水エタノール5分に連続して入れ、新鮮な無水エタノールと交換し、5分間浸漬を続け、再び新鮮な無水エタノールと交換し、5分間浸漬を続け、キシレン5分、新鮮なキシレンと交換し、5分間浸漬します。サンプルを洗浄して乾燥させ、中性ガムで密封します。
  7. 顕微鏡検査:正立型光学顕微鏡(Table of Materials)を使用して画像を収集し、分析します。

4. フローサイトメトリー解析

  1. マウスの腹腔を開きます。ピンセットを使用して脾臓を抽出し、はさみを使用して氷の上でPBSで1.5〜2.5cmの小片にミンチします。2.5 mLシリンジピストンを使用して、2%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI-1640 10 mLで脾臓を粉砕し、70 μmのセルストレーナーに押し込んでシングルセル懸濁液を得ます(材料表)。
    注:脾臓は、ステップ2.1で同じマウスから採取しました。
  2. ステップ4.1で得られた懸濁液を15 mLチューブに移し、5 mLの赤血球溶解バッファーを氷上で10分間溶解します。2% FBSを含むRPMI-1640で洗浄し、350 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、2% FBSを含むRPMI-1640で細胞を再懸濁します。
  3. 自動セルカウンター(Table of Materials)で細胞をカウントし、濃度を1 x 106 細胞/mLに調整します。
  4. 100 μL の細胞懸濁液を 1.5 mL チューブにピペットで移し、1 μL の抗マウス CD16/32 抗体14 (0.5 mg/mL) と 30 分間インキュベートして、非特異的染色をブロックします。RPMI-1640で洗浄し、350 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。2% FBSを含むRPMI-1640の100 μLに細胞を再懸濁します。
  5. Teff細胞15 のCD45(Alexa Fluor 700)、CD3(FITC)、CD4(APC)、およびCD69(BV674)に特異的な抗体で30分間、各抗体につき2 μLで染色します。Tem細胞16 のCD45(Alexa Fluor 700)、CD3(FITC)、CD4(APC)、CD44(BV421)、およびCD62L(PE)に特異的な抗体で30分間、各抗体につき2 μLで染色します。RPMI-1640で洗浄し、350 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄して細胞を350 μLのPBSに再懸濁します。フローサイトメーターと関連ソフトウェア(Table of Materials)を使用して細胞比率を解析します。

5. サイトメトリービーズアレイによるサイトカインの解析

  1. サイトメトリービーズアレイ(Table of Materials)を使用して、マウスの脳におけるIL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、腫瘍壊死因子(TNF)-αおよびIFN-γを測定するために、以下に説明する方法。
  2. ステップ2.1で説明したようにマウスの脳を採取します。
  3. 総タンパク質の抽出:50 mgの脳組織(対照群の3つの脳、ピーク段階のEAE群、およびRR段階)を切断して重量を量ります。1.5 mLチューブに脳を入れ、PMSF、プロテアーゼ阻害剤、およびホスファターゼ阻害剤を含む500 μLの溶解バッファーを加えます。
  4. 脳を約1mm3の小片に切り、超音波ホモジナイザーで400W、5秒オン、5秒オフで抽出します。5回繰り返します。チューブを氷上に10分間置き、12000 x g で5分間遠心分離し、上清を回収します(材料表)。
  5. マウスTh1/Th2/Th17サイトカインスタンダードを下記のように調製します。
    1. 凍結乾燥マウスTh1/Th2/Th17スタンダードのバイアルを開きます。標準試料を15 mLの円錐形ポリプロピレンチューブに移します。チューブトップに標準としてラベルを付けます。
    2. 標準試料を 2.0 mL のアッセイ希釈液で再構成します。再構成した標準試料を室温で15分間平衡化します。再構成したタンパク質をピペッティングで穏やかに混合します。
    3. 12 mm x 75 mmチューブにラベルを貼り、希釈の順番に並べます:1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256。各標識チューブにアッセイ希釈液300μLをピペットで入れます。
    4. 段階希釈を行う:トップスタンダードの300μLを1:2希釈チューブに移し、ピペッティングで完全に混合します。1:2チューブから1:4チューブに300μLを移し、1:256チューブまで移して段階希釈を続けます。0 pg/mLネガティブコントロールとして機能するアッセイ希釈液のみを含む12 mm x 75 mmチューブを準備します。
      注:ピペッティングで十分に混合します。マイクロビーズ上の抗体結合が脱落するのを防ぐためにボルテックスしないでください。
    5. マウスTh1/Th2/Th17サイトカインキャプチャービーズを混合するには、各グループ(コントロールグループ、ピークステージのEAEグループ、RRステージ)に3つのサンプルを含む標準を含む19本のチューブを実験用に調製します。捕獲ビーズ懸濁液を5秒間激しくボルテックスしてから混合します。各キャプチャービーズ190 μLを1つのチューブに添加し、混合キャプチャービーズとして標識します。ビーズ混合物を徹底的にボルテックスします。
      注:抗体標識ビーズは、時間の経過とともに懸濁液から沈降します。ビーズ懸濁液を採取する前に、バイアルをボルテックスする必要があります。
    6. アッセイを行うには、ミックスキャプチャビーズをボルテックスします。50 μLのビーズをすべてのアッセイチューブに加えます。 表1に示すように、50 μLのマウスTh1/Th2/Th17サイトカイン標準希釈液をコントロールチューブに加えます。
    7. マウスTh1/Th2/Th17 PE検出試薬50 μLをすべてのアッセイチューブに加えます。アッセイチューブを室温で2時間インキュベートし、光から保護します。各アッセイチューブに1 mLの洗浄バッファーを加え、200 x g で5分間遠心分離します。各アッセイチューブから上清を吸引し、慎重に廃棄します。
    8. 各アッセイチューブに300 μLの洗浄バッファーを加えて、ビーズペレットを再懸濁します。FCAP Arrayソフトウェア(Table of Materials)を用いてマウスTh1/Th2/Th17サイトカインデータを解析します。

  

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

クリニカルスコア評価
図1に示すように、対照群のマウスは臨床症状を示さなかった。MOG35-55を免疫したEAE群のマウスは、免疫後約12日で尾部麻痺を示しました。16日目までに、症状は完全な後肢麻痺(ピークステージ、ピークとして定義)に達しました。その後、徐々に症状が治まっていきました。マウスの臨床症状は25日目頃に悪化し、約30日目(再発期、RRと定義)で完全な後肢麻痺に達しました。注目すべきは、症状が前回よりも長く持続し、古典的な再発寛解の特徴が発達したことです。再発寛解型EAEマウスの主な症状は、疾患の進行中に発生、寛解、および再発のさまざまな段階を経験し、一定の周期性と変動があります。

組織学的解析
対照群のマウスは、炎症細胞の浸潤なしに、均等に分布し、明確に定義された血管を持つ無傷の脳組織構造を示しました。(図 2A)。EAE群マウスのピーク段階では、脳内に炎症細胞の顕著な浸潤が観察され(図2B)、血管の周囲にカフ状の変化が形成されました(赤矢印で示しています)。同様に、RR期のEAEグループマウスでは、炎症細胞の明らかな浸潤が見られ(図2C)、血管の周囲に優勢な凝集が見られました(赤矢印で示しています)。

LFB染色分析
対照群では、脊髄白質のミエリン鞘が青色に見え、その構造が無傷で密集していることを示しています(図3A)。EAEグループのピーク段階では、脊髄の白質は水色または白色を示しました。構造は緩く不連続であるように見え、赤い矢印で示された液胞変性が顕著に存在していました(図3B)。EAEモデル群のRR段階では、脊髄の白質ミエリンの広範な欠損が観察されました。構造は緩んでいるように見え、かなりの数の液胞変性が観察されました(赤い矢印で示されています。 図3C)。

フローサイトメトリーアッセイ
図4A、Bに示す結果は、対照群と比較して、ピークステージでのEAEマウスのCD4+CD69+ Teff細胞の割合の有意な増加を示しました(P < 0.0001)。さらに、これらの細胞の割合もRR期に増加しましたが、その差は統計的に有意ではありませんでした(P > 0.05)。図4C、Dは、対照群と比較して、EAEマウスのCD4+CD44+CD62L-Tem細胞の割合がピーク段階とRR段階の両方で顕著に増加したことを明らかにしました(P < 0.0001)。

サイトメトリービーズアレイによるサイトカイン測定
図5に示す結果は、対照群と比較した場合、IL-4(P < 0.0001)、IL-6(P < 0.001)、IFN-γ(P < 0.0001)、およびTNF-α(P < 0.0001)のレベルがピーク段階でEAEグループで有意に上昇したことを示しています。IL-17Aの発現も増加しましたが、その差は統計的に有意ではありませんでした(P > 0.05)。また、IL-2のレベルは、EAEマウスのピーク期に変化を示さなかった(P > 0.05)。ただし、RR段階では大幅に増加しました(P < 0.01)。さらに、RR期のTNF-α(P < 0.001)とIL-17A(P < 0.01)の発現は、対照群で観察されたものよりも有意に高かった。逆に、EAE群におけるIL-10の発現は、ピーク段階とRR段階の両方で、対照群の発現よりも有意に低かった(P < 0.0001)。

figure-results-1
図1:クリニカルスコア評価。 臨床スコアは毎日評価され、マウスはMOG35-55によって免疫された古典的な再発寛解型EAEを発症したことを示しています。(A)EAEマウスの症状進行の図。(B)平均臨床スコアによるEAEマウスの評価。データは平均±SEM、n = 6で表されます。データは、統計的に有意な差を評価するために、事後比較を伴う一元配置分散分析を使用して分析されました。* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、**** P < 0.0001。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:脳H&E染色の顕微鏡マップ(A)対照群のマウス脳。(B)ピークステージのEAEマウス脳。EAE群マウスでは、炎症細胞がピークステージで脳内に浸潤し、血管周囲に分布してカフ状変化を形成しました(赤矢印)。(C)RR期のEAEマウス脳。RR期のEAE群マウスの炎症細胞は血管の周りに凝集しています(赤矢印)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:ミエリン鞘LFB染色の顕微鏡マップ(A)対照群のマウスのミエリン鞘。(B)ピークステージのEAEマウスミエリン鞘。脊髄の白質は水色または白色で、構造は緩んで不連続であり、多数の液胞変性が現れました(赤矢印)。(C)RR期のEAEマウスミエリン鞘。脊髄の白質ミエリンは大きく失われ、構造は緩み、多数の液胞変性が現れました(赤矢印)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:MOG35-55による免疫は、EAEマウスのピークステージとRRステージの両方でCD4 TeffおよびTem細胞の割合のアップレギュレーションを誘導しました。(B)CD4+CD69+ Teff細胞の割合。(C)CD44+CD62L+細胞の免疫染色(CD4 T細胞上のゲート)を示す例示的なフロープロット。(D)CD44 + CD62L + Tm細胞の割合。データは平均±SEMとして表され、n = 5です。データは、統計的に有意な差を評価するために、事後比較を伴う一元配置分散分析を使用して分析されました。* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、**** P < 0.0001。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図5:サイトメトリービーズアレイによって分析されたマウス脳のサイトカインレベル。 データは平均±SEMとして表され、n = 3です。データは、統計的に有意な差を評価するために、事後比較を伴う一元配置分散分析を使用して分析されました。* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、**** P < 0.0001。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

チューブラベル濃度(pg/mL)サイトカイン標準希釈
10 (ネガティブコントロール)標準希釈液なし(Assay Diluentのみ)
2201:256
3401:128
4801:64
51561:32
6312.61:16
76251:8
812501:4
925001:2
105000トップスタンダード

表1:コントロールチューブへのサイトカイン標準希釈液のリスト。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSは、CNSの中で最も蔓延している自己免疫性脱髄疾患であり、世界中で何百万人もの人々が罹患しています17。EAEは、MS18の臨床病理学的特徴をシミュレートするための典型的な動物モデルです。研究によると、MSの個人は、CNSの軸索とニューロンの変性により、認知障害やその他の障害を経験することが示されています19,20,21。EAEモデルのピーク期とRR期では、マウスの尾部と後肢に麻痺が見られました。さらに、炎症細胞がCNSに浸潤することが観察され、さまざまな程度のミエリン鞘の喪失につながっています。これらの結果は、この実験でEAEモデルが成功裏に確立されたことを示しています。

MOG35-55とCFAの乳化プロセスは、均質化プロセス中の発熱によるMOG35-55の劣化を防ぐために、氷上で行う必要があります。PTXは、血管透過性を高めるために腹腔内に投与され、T細胞が血液脳関門を容易に通過し、ニューロン22を囲むミエリン鞘に到達することを可能にする。特に注意が必要なのは、マウスが麻痺し、自分で食べたり飲んだりすることができなくなった場合、ケージに餌や水のトレイを設けたり、手動で餌を与えたりして、過度の喉の渇きや空腹を防ぐことが重要であるということです。

フローサイトメトリーを用いて、CD4+CD69+ Teff細胞とCD4+CD44+CD62L-Tem細胞の割合を解析しました。EAEマウスの脾臓におけるCD4+CD69+ Teff細胞の割合は、ピークステージで著しく上昇しました。さらに、再発期の対照群よりも高かったが、この差は統計的有意性には達しなかった。一方、CD4+CD44+CD62L-Tem細胞の割合は、EAEマウスではピーク期、RR期ともに対照群に比べて有意に高かった。このことから、EAEの開始には、ピーク期のCD4+CD69+ Teff細胞とCD4+CD44+CD62L-Tem細胞の両方が関与している可能性があり、RR期はCD4+CD44+CD62L-Tem細胞が主に優勢である可能性が示唆されました。CD69は、リンパ球の活性化中に発現する最も初期の膜表面分子です。それは、T細胞の接着および遊走を調節する上で重要な役割を果たし、それにより免疫細胞が体内の感染または炎症部位を特定し、局在化するのを助ける23。休眠T細胞はCD69を発現しないが、抗CD3/TCR活性化因子によって刺激され活性化されると、誘導的に発現することができる24。エフェクター段階の後、T細胞のかなりの部分がアポトーシスを起こします。これは、T細胞がそれ以上分化できないためです。この数の減少は、主に、抗原刺激中に産生されるIL-2を含む生存促進性サイトカインの欠如によって引き起こされます。さらに、これらのサイトカインに対する受容体のダウンレギュレーションは、このクローン性収縮現象にさらに寄与している25。さらに、適応免疫応答による感染性病原体のクリアランスは、T細胞のクローン性収縮をもたらし、最終的には、病原体26に再感染した場合に宿主に対する免疫応答を提供する長寿命記憶細胞が少なくなる。本研究では、CD4+CD69+ T細胞の割合はピーク時には顕著に上昇したが、RR段階では減少したことから、CD4 Teff細胞は一定期間生存できず、最終的にはアポトーシスを起こすことができ、抗原特異的T細胞のごく一部のみが長寿命のメモリーT細胞に成長することが示された。Tem細胞はCD62Lの発現が低いです。しかし、それらは、炎症組織への移動を促進するいくつかのケモカイン受容体と接着分子を発現することができます。抗原再活性化後、増殖速度は比較的遅いが、サイトカインは急速に放出され、エフェクター機能を開始する27。本研究では、エマルジョンから放出され、再び免疫系を攻撃したマウスの抗原は、Tem細胞を再活性化し、IL-6やIFN-γなどの多数のサイトカインを放出することができ、その結果、EAEマウスの再発につながる可能性があります。

自己免疫疾患(MSを含む)に関連する主要な炎症誘発性CD4 T細胞集団は、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、およびIL-17を分泌するTh17細胞です。Th1細胞関連IFN-γは、オリゴデンドロサイトに直接的な有害な影響を及ぼし、患者のCNSニューロンに損傷を与える可能性があることが実証されている28。研究により、MS患者の脳病変におけるTh17細胞およびIL-17 mRNAのレベルの上昇が観察されています。これは、MS患者がそうでない個人と比較した場合に観察されています29。IL-10およびTGF-β30の産生を特徴とする制御性細胞は、免疫抑制効果を持ち、自己成分に対する免疫系の耐性を維持する上で重要な役割を果たし、それによって体が免疫恒常性を維持することを可能にします。ここでは、ピークステージでEAEグループにおけるIL-4、IL-6、IFN-γ、およびTNF-α発現の有意なアップレギュレーションが観察されました。さらに、IL-17Aの発現も増加しましたが、有意性はありませんでした。対照的に、RR期のTNF-αとIL-17Aの発現レベルは、対照群と比較して有意に高かった。このことから、EAEのピークステージはTh17細胞ではなくTh1細胞によって主に駆動されるのに対し、EAEのRRステージはTh1細胞とTh17細胞の両方によって開始されたことが示唆されます。EAE群におけるIL-10のピーク時およびRR期における発現が対照群の発現よりも著しく低かったことは注目に値し、EAEの病理学的進行中にTreg細胞の免疫抑制機能が妨げられたことを示唆しています。

結論として、私たちの研究は、MOG35-55ペプチドによる免疫を通じてマウスの再発寛解型EAEモデルの確立に成功したことを示唆しています。活性期の観点からは、EAEのピーク期はCD4+CD69+ Teff細胞とCD4+CD44+CD62L-Tem細胞によって開始されたと考えられ、EAE RR期の再発は主にCD4+CD44+CD62L-Tem細胞が優勢であると考えられます。免疫効果機能の観点から見ると、EAEのピークステージは主にTh17細胞ではなく、Th1細胞によって開始されました。しかし、EAEのRR期はTh1細胞とTh17細胞によって開始されました。Treg細胞の免疫抑制機能は、EAEの病理学的過程において阻害されました。それにもかかわらず、Th1/Th17細胞の活性化とTreg細胞の抑制の根底にある分子メカニズムについては、さらなる研究が必要です。

開示事項

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著者は何も開示していません。

謝辞

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この研究は、寧夏回族自治区自然科学財団(2022AAC03601および2023AAC02087)および寧夏医科大学研究財団(XM2019052)の支援を受けました。寧夏医科大学の医学科学技術研究センターの支援に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
麻酔器エバポレーターNorvap20-17368
 IsofluraneSigma-Aldrich(上海)トレーディング Co.Ltd。
70 μmセルストレーナーXIYAN(株)15-1070
Alexa Fluor 700 抗マウス CD45 抗体Biolegend103128
APC 抗マウス CD4 抗体Biolegend100616
自動セルカウンター江蘇省 JIMBIO technology Co., LtdJIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) マウス Th1/Th2/Th17 CBA キットBD Biosciences560485
Biotin抗マウスCD16/32抗体バイオレジェン101303
ブリリアントバイオレット510抗マウスCD69抗体バイオレジェンド104532
BV786ラット抗マウスCD62L(MEL-14)BDファーミンゲン563109
カラム組織&細胞蛋白質抽出キットShanghai Epizyme Biomedical Technology Co., LtdPC201Plus
Complete Freund's AdjuvantSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. 
脱水機DIAPATHドナテッロ
使い捨て滅菌シリンジ(1mL)Yikang Group210820
使い捨て滅菌注射器(2.5mL)Yikang Group210820
使い捨て滅菌注射器(5mL)Yikang Group210820
染色機DIAPATHGiotto
埋め込み機武漢Junjie電子有限公司JB-P5
エタノールSCRC100092683
胎児ウシ血清プロセルライフサイエンス&テクノロジー株式会社FSP500
FITC ハムスター アンチマウス CD3e(145-2C11)BD Pharmingen553062
フローサイトメーターBecton,Dickinson and CompanyFACSCelesta
Flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo softwareBD Biosciences10.8.1
Frozen platformWuhan Junjie Electronics Co.,株式会社 JB-L5
スライドガラスServicebioG6004
HE色素溶液セットServicebioG1003
ヘマトキシリン・エオシン溶液ServicebioG1002
高速冷蔵遠心分離機サーモフィッシャー・サイエンティフィックモガフーゴ8R
イメージングシステムニコンDS-U3
ルクソールファストブルー染色キットServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
結核菌 H37RABD Pharmingen231141
Myelin oligodendrocyte 糖タンパク質 (MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
中性ガムSCRC10004160
オーガナイザーKEDEEKD-P
オーブンラボテリーGFL-230
病理学スライサーライカRM2016
百日咳毒素 百日咳菌Sigma-Aldrich (上海) トレーディング Co.Ltd.P7208
リン酸緩衝生理食塩水ServicebioG4202
ピペット0.5-10 μLDLAB サイエンティフィック7010101004
ピペット 100-1000 μLDLAB サイエンティフィック7010101014
ピペット 20-200 μLDLAB Scientific7010101009
RPMI-1640プロセル ライフサイエンス&テクノロジー株式会社
ティーバルブ広東Kanghua医療有限公司A06
ティッシュスプレッダー浙江Kehua楽器有限公司KD-P
直立光学顕微鏡ニコンニコンエクリプスE100
キシレンSCRC10023418
792632ドSLCH4887 百日咳 PM150110

参考文献

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