ここで使用した実験は、低分子とタンパク質標的の間の相互作用を予測および検証するために、細胞の熱シフトアッセイと組み合わせた分子ドッキングの方法を示しています。
この記事について
サマリー
要約
タンパク質は人間の生理学の基礎であり、その標的は研究や医薬品開発において非常に重要です。重要なタンパク質標的の同定と検証は、医薬品開発に不可欠なものとなっています。分子ドッキングは、特に薬物とタンパク質の標的相互作用の文脈で、タンパク質-リガンド結合を研究するために広く利用されている計算ツールです。結合の実験的検証、および薬物とその標的の結合に直接アクセスするために、細胞熱シフトアッセイ(CETSA)法が使用されます。この研究は、分子ドッキングをCETSAと統合して、薬物と重要なタンパク質標的との間の相互作用を予測および検証することを目的としていました。具体的には、分子ドッキング解析により、キサンタチンとKeap1タンパク質の相互作用とその結合様式を予測し、CETSAアッセイを用いて相互作用を検証しました。その結果、キサンタチンがKeap1タンパク質の特定のアミノ酸残基と水素結合を確立でき、Keap1タンパク質の熱安定性を低下させることが示され、キサンタチンがKeap1タンパク質と直接相互作用できることが示されました。
概要
タンパク質は生体において非常に重要な高分子であり、膜組成、細胞骨格形成、酵素活性、輸送、細胞シグナル伝達、細胞内および細胞外メカニズムへの関与など、細胞内で多様な固有の機能を持っています1,2,3。タンパク質は、主に他のタンパク質、核酸、低分子配位子、金属イオンなど、さまざまな分子との特異的な相互作用を通じて生物学的機能を示します1,4。リガンドは、生物のタンパク質に特異的に結合する低分子化合物です。タンパク質とリガンドの間の相互作用は、結合部位と呼ばれるタンパク質の特定の部位で発生し、結合ポケット5としても知られています。医薬品化学の研究では、医薬品の標的となる疾患と明らかに関連している重要なタンパク質を特定することに焦点が当てられています6。したがって、タンパク質とリガンドの間の結合部位を深く理解することは、創薬、設計、および研究を促進する上で最も重要である7,8。
分子ドッキングは、タンパク質-リガンド結合を研究するために広く使用されている計算ツールであり、タンパク質とリガンドの三次元構造を使用して、安定した複合体を形成する際の主要な結合モードと親和性を調べます9,10,11。分子ドッキング技術の応用は1970年代に始まりました。ロックとキーのペアリング原理に基づき、分子ドッキングソフトウェアのアルゴリズムを利用して、ドッキング結果を解析することで、化合物と分子標的との相互作用を判定することができます。このアプローチにより、化合物と標的分子の両方の活性結合部位を予測できます。その結果、リガンド-受容体相互作用の最適な結合構造(ここでは結合モデルと呼ばれる)の同定が容易になり、これはこれらの分子結合のメカニズムを理解するために重要である12,13,14,15。分子ドッキングは、リガンドと受容体の相互作用の貴重なコンピューターベースの予測を提供しますが、これらは予備的な発見であることに注意することが重要です。したがって、これらの相互作用を確認するためには、さらなる実験的検証が不可欠です。
細胞熱シフトアッセイ(CETSA)は、2013年にPär Nordlundの研究チームによって最初に提案され、薬物と標的タンパク質の相互作用を検証するための方法として機能します。この技術は、薬物結合によって誘導される標的タンパク質の熱安定性を特異的に試験し、分子相互作用を確認するための実用的なアプローチを提供する16,17,18。このアプローチは、リガンド結合が標的タンパク質内の熱シフトを開始するという基本原理に基づいており、細胞溶解物、無傷の生細胞、および組織19,20を含む幅広い生物学的サンプルに適用できます。CETSAは、リガンド結合によるタンパク質の熱力学的安定化を検出し、観察された表現型応答を標的化合物に結び付けることにより、無傷の細胞における低分子の直接的な標的関与をサポートします21,22。CETSAから派生したさまざまな方法論の中で、ウェスタンブロット-CESA(WB-CETSA)は古典的なアプローチと見なされています。CETSA法を用いたサンプル前処理に続いて、ウェスタンブロット分析を利用して、標的タンパク質の熱安定性の変化を検出します。これにより、細胞系内の薬物-タンパク質相互作用の正確な決定が可能になります17,23。
キサンタチンは、植物から単離された生理活性化合物です キサンチウムL.は、鼻副鼻腔炎や関節炎などの病気を治療するために伝統的な漢方薬で使用されてきた抗炎症などの特性を持っています24,25。ケルチ様ECH関連タンパク質1(Keap1)は、Cullin3ベースのCullin-RING E3ユビキチンリガーゼマルチサブユニットタンパク質複合体の構成要素であり、細胞内酸化還元状態を調節することによって炎症反応の強度と持続時間に影響を与える細胞内酸化還元恒常性の重要な調節因子である26。本研究では、まず分子ドッキングを利用してキサンタチン(低分子)とKeap1タンパク質の相互作用を調べ、それらの結合様式を予測することを目指しました。その後、CETSA法を採用して、キサンタチンがKeap1タンパク質の熱安定性に与える影響を評価することにより、この相互作用を検証しました。
プロトコル
1. キサンタチンとKeapの構造のダウンロード1
- PubChemデータベース(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)を開き、キサンタチン(低分子)を入力し、[検索 ]を押して [最初の結果]をクリックします。 Download をクリックし、2D structureの下の Save をクリックして、コンパウンドを.sdf形式で保存します。
- タンパク質の結晶構造をダウンロードしてください。
- UniProtデータベース(https://www.uniprot.org/)を開き、Keap1と入力して[検索]をクリックします。左側の列の[一般的な生物]の下にある [人間 ]をクリックし、右側の列の [Q14145という名前の最初のエントリ ]をクリックします。
- 左の列の関数の下にある Structure をクリックし、PDB ID:2FLUのストラクチャを探して、 RCSB-PDBをクリックします。 Download Files をクリックし、 PDB Format を選択して、Keap1タンパク質の結晶構造をダウンロードします。
2. 分子ドッキング
- デスクトップに molecular docking という名前の新しいフォルダーを作成し、ダウンロードした xanthatin (低分子) と Keap1 (タンパク質) の構造をこのフォルダーに保存します。
注: フォルダー名とパスは英語である必要があります。 - Maestroソフトウェアを開き、[ ファイル]をクリックし、[ 作業ディレクトリの変更]を選択し、[ デスクトップ]をクリックし、新しく作成した分子ドッキングフォルダーをダブルクリックして選択し、[ オプションの選択]をクリックします。
- 低分子プロセッシング
- File and import structures optionsをクリックし、Desktopをクリックし、molecular docking folderをダブルクリックし、xanthatin Structure Fileをクリックし、Openをクリックしてsmall moleculeファイルをインポートします。
- ソフトウェアの右上隅にある [タスク ]をクリックし、[ LigPrep ]オプションを選択します。ワークスペースの構造を使用します。残りのパラメーターはデフォルトのパラメーターであり、[ 実行 ] をクリックして低分子処理を実行します。
- タンパク質構造処理
- Fileおよび Import Structures オプションをクリックし、 Desktopをクリックして、 Molecular Docking フォルダをダブルクリックします。 Keap1 Protein Structure ファイルをクリックし、 Open をクリックしてタンパク質構造ファイルをインポートします。
- ソフトウェアの右上隅にある タスク をクリックし、 タンパク質調製ウィザード オプションを選択します。 Het グループから 5 Å を超える水を削除する前に ボックスをチェックし、pH を 7.4+/-0.0 に入力します。 「前処理」をクリックし、「 リファイン」をクリックしてから、「 最適化」>「ウォーターを除去する」>「最小化」をクリックします。
- 前のタスクが完了したら、次のタスクをクリックします。 「タスク 」をクリックして「 サイトマップ 」オプションを選択し、すべてのパラメーターにデフォルト設定を使用して、「 実行」をクリックします。
- ファイルおよびインポート構造オプションをクリックし、デスクトップをクリックして、分子ドッキングフォルダーをダブルクリックし、sitemap_1という名前のフォルダーを開きます。Sitemap_1_out.maegz という名前の最初のファイルをクリックし、[開く] をクリックします。
- ドットをダブルクリックしてワークスペース内のsitemap_1_proteinを選択し、 Sitemap_1_site_1 をクリックして選択します 。 タスク をクリックし、 レセプターグリッド生成 オプションを選択します。
注:サイトマップによって予測されたタンパク質部位は、スコアリングに従ってランク付けされ、最初にスコアリングが最も高い部位になります。 - 受容体の下の エントリ オプションを選択し、残りのパラメーターは変更しません。タンパク質構造の 小さな白いボール をクリックして、デフォルトサイズのドッキングボックスを生成し、ジョブ名をグライドgrid_2FLUに変更します。 [実行] をクリックします。
- 分子ドッキング
- タスクをクリックし、リガンドドッキングオプションを選択します。ファイルから Receptor Grid As を選択し、Browseをクリックします。[デスクトップ]をクリックし、[分子ドッキング]フォルダをダブルクリックし、[glide-grid_2FLU]をダブルクリックします file、[Glide-grid_2FLU.zip file]をクリックして、[開く]をクリックします。
- ファイルからのリガンドを使用をクリックして>デスクトップ>参照します。分子ドッキングフォルダーをダブルクリックし、ligprep_1ファイルをダブルクリックし、Ligprep_1-out.maegz ファイルをクリックしてから、開くをクリックします。
- [設定] をクリックし、[精度] を [XP] (追加精度) オプションとして選択し、ジョブ名を「glide-dock_XP_2FLU」に変更して、[実行] をクリックします。
- ドッキング結果の表示
- ファイルおよびインポート構造オプションをクリックし、デスクトップをクリックして、Molecular Dockingフォルダーをダブルクリックします。glide-dock_XP_2FLU ファイルをダブルクリックし、glide-dock_XP_1_pv.maegz ファイルをクリックして [開く] をクリックします。
- ドットをダブルクリックしてワークスペースでリガンドを選択し、クリックしてsitemap_1_proteinを選択します。 「表」をクリックし、右端にスライドして、「ドッキングスコア」の下にスコアを表示します。
- 2D結果の可視化
- ドットをダブルクリックしてワークスペース内のリガンドを選択し、クリックしてsitemap_1_proteinも選択します。 [リガンド相互作用] > [表示 ] をクリックし、[ LID 凡例 ] ボックスをオンにします。
- [ファイル] をクリックし、[スクリーンショットの保存] を選択し、幅に「6000」と入力し、[背景の透明化] のチェックボックスをオフにして [OK] をクリックします。デスクトップをクリックし、ファイルに2D-xanthatin-2FLUという名前を付けて、画像を保存します。
- 3D結果の可視化
- ドットをダブルクリックしてワークスペース内のリガンドを選択し、クリックしてsitemap_1_proteinも選択します。
- [クイック選択] の [L ] をクリックして低分子を選択し、[ スタイル] をクリックします。スタイルの 2行目 をクリックして低分子結合のサイズを変更し、色原子をクリックして低分子の色を変更します。
- 図の中の小分子を選択し、マウスの右ボタンをクリックして「 選択範囲を展開」を選択し、「4 Å」を選択します。[ スタイルでラベルを適用] をクリックして、ラベルを表示します。
- スタイルの2行目をクリックしてアミノ酸結合のサイズを変更し、 色原子 をクリックしてアミノ酸の色を変更します。
- [次へ] > [反転] をクリックし、Control キーを押しながら [スタイル] の下の最初の目の位置をクリックすると、ラベル付きのアミノ酸のみが表示されます。
- 「リボンのスタイル」>をクリックしてタンパク質をリボンスタイルとして表示し、リボンの下の「リボンを編集」をクリックしてリボンの色を変更します。
- 画面の右下隅にある [インタラクショントグル ]をクリックし、マウスの右ボタンをクリックして、コンタクト/クラッシュのチェックを外します。
- タスクでmeasureを検索し、 Distanceを選択し、画面上の黄色の点線(水素結合)で結ばれた2つの原子をクリックして、水素結合の長さを測定します。
- マウスのホイールを押したままにしてタンパク質を回転させ、タンパク質を画面の中央に調整し、各アミノ酸ラベルが表示されるようにします。
- [ワークスペース] > [名前を付けて画像を保存] をクリックし、デスクトップをクリックします。初期設定で画像を 600dpi として保存し、ファイル名を 3D-xanthatin-2FLU にし、ファイルタイプとして tiff 形式を選択して、画像を保存します。
3. 細胞培養とCETSAサンプル調製
- 細胞培養
- 5 x 106 RAW264.7 細胞/mLを100 mm培養皿に加え、10% FBSおよび1%抗生物質-抗真菌溶液を含む6 mLのDMEM培地と、37°C、湿度95%、および5%CO2でインキュベートします。3つの皿を準備し、細胞が80%の密度に達したら実験を行います。
- CETSAサンプル調製
- 古い培地を吸引し、室温に温めたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)2mLを各皿に加え、2回洗浄します。
- 細胞の各皿に2mLのPBSを加え、細胞を混合し、細胞を2本の1.5mL微量遠心チューブに集めます。377 x g で室温で3分間遠心分離します。
- 上清を捨て、1%ブロードスペクトラムプロテアーゼ阻害剤混合物を含む2mLのPBSで細胞を再懸濁します。それぞれに1 mLの細胞懸濁液を入れた個々の微量遠心チューブに分けます。
- 微量遠心チューブを液体窒素で白色固になるまで凍結し、すぐに37°Cの水浴で解凍し、3回繰り返します。12,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。
- 100 μMのキサンタチンと同量のDMSOを入れた2本の微量遠心チューブを取り、各チューブに450 μLの遠心分離した上清を加え、37°Cで30分間インキュベートします。
- 2本の微量遠心チューブから上清を14本のPCRチューブに60μL/チューブの容量で加え、DMSOおよびキサンタチン基について、各温度で2本のPCRチューブを使用して、さまざまな温度(45°C、48°C、51°C、54°C、57°C、60°C、63°C)でチューブを同時に加熱します。 それぞれ。
- 非加熱群の場合、2本の微量遠心チューブのそれぞれから上清を採取し、14本のPCRチューブ(DMSO群に7本、キサンタチン群に7本)をそれぞれ60 μLの容量で添加します。ここではサンプルを加熱しないでください。
- 加熱されたグループのためにチューブを室温で冷却します。すべてのチューブ(加熱および非加熱)を12,000 x g で10分間、4°Cで遠心分離し、各チューブから48 μLの上清を新しい1.5 mL微量遠心チューブに取り出します。12 μLのSDS-PAGEタンパク質ローディングバッファーを各チューブに加え、ボルテックスでよく混合し、100°Cの水浴で5分間加熱します。
注:調製したCETSAサンプルは、-80°Cで保存し、1週間以内にウェスタンブロットでテストする必要があります。
4. ウェスタンブロット
- SDS-PAGEゲルの調製
- 長ガラス板と短ガラス板を超純水ですすいでください。プレートをclに置きますampスロット、次に透明なボードの上に置きます。超純水を加え、10分間リークチェックします。
- 8mLの下部ゲル溶液と8mLの下部ゲル緩衝液を円錐フラスコに加え、穏やかに振って混合します。ゲル溶液に160μLの凝固促進剤を加え、よく混ぜます。
注意: 接着剤の下層の体積は、clを超えてはなりませんampスロット。 - プレートから超純水を排出し、濾紙で拭き取って乾かします。調製した下部ゲル溶液を加える。イソプロピルアルコール2mLを加え、固まるまで20分待ちます。
- 上部ゲル溶液2mLと上部ゲル緩衝液2mLを円錐形フラスコに入れ、フラスコを静かに振って混合します。
- ゲル層からイソプロピルアルコールを取り除き、余分なイソプロピルアルコールを濾紙で拭き取ります。
- 混合した上部ゲル溶液に40μLの凝固剤プロモーターを加え、よく混合し、長いガラスプレートと短いガラスプレートの間に加え、1.5mmの15穴コームを挿入し、20分間待ちます。
注意: コームは、コームと溶液の間に気泡がないように、上層に対して垂直に挿入する必要があります。
- 電気泳動
- ビーカーに超純水1Lを加え、SDS-PAGE流速バッファーパウダーを1袋加え、ガラス棒でよく撹拌し、調製したゲルを電気泳動装置に加える。ユニットを箱に入れ、コームを引き出します。
- マーカーとCETSAサンプルを室温、ボルテックス、スピンダウンで解凍します。所定の順序に従って、最初のウェルに2.5μLのマーカーを、残りの各ウェルに20μLのCETSAサンプルを加えます。
注:CETSAサンプルは、ステップ3.2.6で説明した温度処理に従って、45°Cから63°Cまで連続して添加しました。最初にDMSO基を追加し、次にキサンタチン基を追加しました(図1)。 - 残りの電気泳動溶液を電気泳動ユニットに追加し、蓋を閉め、電極を正極から正極、負極から負極に挿入します。
- 電源スイッチをONにし、電圧スイッチを80Vに調整して電気泳動を開始します。
- メンブレンへの転写
- 超純水850mL、無水エタノール100mL、急速転写緩衝液50mLをビーカーに加え、よく撹拌する。発泡スチロールボード、プラスチックナイフ、ピンセット、トレイ、メンブレン転写装置を準備します。
- ゲルのサイズに合わせてPVDFメンブレンを切断し、印をつけ、メタノールに30秒間浸して活性化します。
- 転写液をトレイに注ぎ、転写クランプを配置して開き、スポンジパッドと転写ろ紙を3層置きます。
- 電気泳動を停止し、電気泳動ボックスの蓋を開けます。電気泳動装置を取り、電気泳動溶液を注ぎ、プレートを取り外します。プレートをフォームボードの上に置き、プラスチックナイフでそっとこじ開け、ゲルをカットしてタンパク質マーカーと標的タンパク質をはっきりと視覚化します。
- マーカーの片側をピンセットで持ち、膜貫通液が入ったトレイで洗い、ろ紙の上に平らに置きます。活性化したPVDFメンブレンを転写液に浸し、標識面をピンセットで保持し、ゲルを下向きに覆います。
注:PVDF膜のマーク付き側は前面であり、配置プロセス中に気泡が発生しないことに注意してください。 - 転写濾紙を2層、スポンジパッドを1層、PVDF膜に置き、転写クリップを覆ってクランプし、転写タンクに入れます。
注:転送クリップの黒色から転送スロットの黒色。 - 残りの膜貫通溶液を膜貫通カセットに加え、蓋で覆い、陽性から陽性、陰性から陰性にします。
- 電流を400mAに、時間を30分に調整し、Runを押して、室温で膜の移送を開始します。
- ブロッキング
- ガラスバイアルに2Lの超純水を加え、TBSパウダーの小袋を加え、次に2mLのTweenを加えてTBST溶液を作ります。BSA粉末を秤量してTBSTを含む5%BSA溶液を調製し、6mLのBSA溶液をインキュベーションボックスに加えます。
- メンブレンの転写を停止してから、転写クリップを開きます。PVDFメンブレンのマーカー側をクランプし、インキュベーションボックスに入れます。インキュベーションボックスをシェーカーに置き、室温で1.5時間ブロックします。
- 一次抗体のインキュベーション
- 一次抗体を5% BSA溶液で1:1000に調製し(詳細は 表 を参照)、インキュベーターボックスでBSA溶液をリサイクルし、6 mLの一次抗体をインキュベーションボックスに加えます。インキュベーションボックスをアイスパックの入ったフォームボックスに入れ、シェーカーに一晩置いておきます。
- 二次抗体のインキュベーション
- 翌日、一次抗体をインキュベーションボックスに集め、TBST溶液6mLを加え、シェーカーに乗せて5分間洗浄します。
- 洗浄したTBST溶液を注ぎ、洗浄のために新鮮なものを加えます。5回繰り返し、5%BSA溶液で1:5000の二次抗体を調製します。
- TBST溶液を注ぎ、6 mLの二次抗体をインキュベーションボックスに加えます。インキュベーションボックスをシェーカーに置き、室温で1.5時間インキュベートします。
- 二次抗体を採取し(詳細は 表 を参照)、6 mLのTBST溶液を加え、シェーカーに置き、5分間洗浄します。洗浄したTBST溶液を注ぎ、洗浄のために新鮮なものを加えます。5回繰り返します。
- ストリップの露出
- 最後の洗浄の終わりにTBST溶液を保持します。化学発光試薬AとBを等量取り、振とうし、よく混ぜます。溶液を光から保護します。
- ゲルイメージングシステムを開き、[ Samples]をクリックしてキャリブレーションを確認し、キャリブレーションが完了するのを待ってから、[ Marker]をクリックしてキャリブレーションを確認します。
- ピンセットでストリップのマーカー側を拾い上げ、化学発光試薬溶液に完全に浸します。マーカーの片側をクランプしてストリップを下向きにしてイメージャーに置き、イメージャーの蓋を閉じて [露出]をクリックし、露光時間を1秒に設定します。
注:開発者はストリップを完全に覆う必要があり、開発は暗い環境で行う必要があります。 - [保存] をクリックし、画像に名前を付けて、.tif ファイルとして保存します。ウェスタンブロットの光学濃度を解析します。DMSO群の各温度のグレー値を45°Cのグレー値と比較し、キサンタチン群の各温度のグレー値を45°Cのキサンタチンのグレー値と比較した。
結果
分子ドッキング解析により、キサンタチンとKeap1タンパク質の相互作用が予測されました。 図2 は、キサンタチンとKeap1タンパク質のアミノ酸残基Gly-367およびVal-606との間の水素結合の形成を示しており、水素結合長はGly-367では2.17 Å、Val-606では2.13 Åです。さらに、計算された-5.69 kcal/molのドッキングスコアは、キサンタチンとKeap1タンパク質の間の良好な結合親和性を意味します。
CETSA法は、キサンタチン結合がKeap1タンパク質の熱安定性をシフトさせ、キサンタチンとKeap1タンパク質の相互作用を確認することを示しました21。 図3 は、キサンタチンがDMSO基と比較して、48°Cから57°Cの温度範囲内でKeap1タンパク質の熱安定性を著しく変化させることを示しています。サンプル負荷量を均等にするために、まず、実験を行った細胞接種の密度は一貫していました。第二に、DMSO群とキサンタチン群の細胞サンプルを細胞培養皿でよく混合した後、2本の微量遠心チューブに均等に分配することで、細胞サンプルの量が一定になり、各PCRチューブに添加した上清の量は60μL、最後にウェスタンブロットにアップロードされた各サンプルの容量は20μLでした。 これにより、加熱されたサンプルに均等な負荷がかかりました。約51°Cからのサンプルでのタンパク質分解は、主にタンパク質構造の変化と高温による化学反応の加速によるものです。上記の結果は、キサンタチンがKeap1タンパク質に直接結合できることを示しています。
図1:ウェスタンブロットのロード順序。 温度は左から順に45°C、48°C、51°C、54°C、57°C、60°C、63°Cでした。 最初の車線はマーカーで追加されました。各温度には2つのレーンが使用されました。最初のレーンはDMSOグループで、2番目のレーンはキサンタチングループでした。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:キサンタチンとKeap1(PDB:2FLU)タンパク質の相互作用。(A) キサンタチンのKeap1への結合の2D表現。 (B) キサンタチンとKeap1タンパク質の3D可視化。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:Keap1タンパク質の熱安定性に対するキサンタチンの影響。(A)Keap1の熱安定性に対するキサンタチンの影響は、CETSAによって検出されました。(B)Keap1の光学濃度は、45°Cで得られたものに正規化されました。 データは平均値±SDで表され、統計解析は一元配置分散分析(一元配置分散分析)によって行われました。n = 3 です。*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001、p < 0.0001。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
疾患標的の同定と医薬品の発見および開発は密接に関連しています27。特定の標的を正確に標的とすることにより、特定の疾患をより効果的に治療すると同時に、薬物に関連する副作用を最小限に抑えるための薬剤候補を開発することができます28,29。最も一般的に使用される標的はタンパク質標的である30。しかし、細胞内のタンパク質の多様性が広範囲にわたるため、特別なタンパク質標的の同定は大きな課題となる30,31。この論文では、分子ドッキングとCETSAを組み合わせて、タンパク質標的を特定して検証するアプローチを採用しました。その結果、キサンタチンとKeap1タンパク質の直接的な相互作用が明らかになりました。コンピュータ技術と生物学的実験の統合は、他の薬物およびタンパク質標的の調査にも採用され、薬物と標的との間の直接的な相互作用の存在を確認することができる。予測と検証を組み合わせたこのアプローチは、時間と経済コストの両方を効果的に削減します。さらに、実験装置や材料が入手しやすく、操作工程も複雑ではありません。最後に、CETSAサンプルは、ウェスタンブロット法による調製と試験が容易で、サンプルの再現性を保証します。
私たちの経験では、実験手順中に特別な注意を必要とするいくつかの重要な側面があります。まず、分子ドッキング前のタンパク質構造を選択する際には、X線分析で分解したタンパク質の結晶構造を選択することが不可欠です。第二に、細胞密度と凍結/融解時間はCETSA実験の重要な要素です。対数増殖期の細胞は、増殖状態が安定しており、実験結果への影響が最小限であるため、CETSA実験用に選択する必要があります。細胞の凍結と融解を繰り返す間は、液体窒素を使用して白色の固体になるまで凍結し、その後室温で直ちに解凍してから、その後の凍結サイクルでタイミングを適切に制御する必要があります。最後に、タンパク質の分解を防ぐために、CETSAサンプルを調製した後、ウェスタンブロット実験を速やかに完了する必要があります。
分子ドッキングとCETSAは、どちらも医薬品開発の分野で重要な役割を果たす確立された技術です。分子ドッキングは、化合物とその標的との間の分子レベルの相互作用を予測するのに役立ち、潜在的な結合モードに関する貴重な洞察を提供します10,11。対照的に、CETSAは、タンパク質の熱安定性に対する薬物の影響を評価することに焦点を当てており、薬物とタンパク質の相互作用を検証するためのツールとして機能します17。CETSAは検証のための比較的簡単な方法ですが、薬物-タンパク質複合体の熱シフトの研究にウェスタンブロットを使用するという低スループットの方法であり、これだけに頼るべきではありません。さらに、CETSAのステップは複雑であり、操作中のステップエラーは結果に大きな影響を与える可能性があります。さらに、CETSA法は、タンパク質標的への化合物の特異的結合部位および結合様式を決定することができず、結合が共有結合であるか非共有結合であるかを示すことができない17,18,23。熱シフトアッセイ以外にも、pH依存性タンパク質沈殿(pHDPP)などの他の種類のエネルギーアッセイも、リガンド-タンパク質相互作用の研究に使用することができます32。さらに、熱プロテオームプロファイリングは、リガンド-タンパク質相互作用を明らかにするためのエネルギーベースの方法であり、プロテオミクスとCETSA33を組み合わせることで、タンパク質-薬物相互作用のハイスループットで大規模な分析を可能にします。
さらに、局在表面プラズモン共鳴(LSPR)は、さらなる定性的および定量的分析を提供することができる34,35。薬物とその標的との相互作用の存在を判定するだけでなく、これらの分子間相互作用の親和性パラメータや速度論パラメータを測定し、より包括的な理解を提供します。
熱シフトアッセイを超えて、pH依存性タンパク質沈殿(pHDPP)は、リガンド-タンパク質相互作用の研究にも使用できます32。分子ドッキングは、低分子と生体分子の間の相互作用を予測するための物理力学ベースのシミュレーション手法です。この手法は、低分子の立体配座と配向を最適化し、低分子と生体分子との間に最良の相補性を生じさせることで、結合を実現することを目的としています。ターゲット予測は、人工知能技術を利用して、低分子と生体分子の間の結合部位を予測します。この2つのアプローチには、メソッドの適用と予測精度に大きな違いがあります。メソッドアプリケーション:分子ドッキングは、主に医薬品の設計と最適化に使用され、新しい創薬の理論的基礎を提供します。より高度な人工知能の助けを借りて、ターゲット予測は、創薬の効率を向上させるために、ハイスループットスクリーニングとリード化合物の迅速な発見にもっと頻繁に適用されます。予測精度:分子ドッキングは物理シミュレーションに基づいているため、予測精度は高くなりますが、計算コストも比較的高くなります。ターゲット予測は計算コストが低くなりますが、予測精度はトレーニング データの量とモデルの選択に依存します。
開示事項
著者らは何も開示していない。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学基金会(82004031)と四川省科学技術プログラム(2022NSFSC1303)の支援を受けました。成都中医薬大学漢方薬学革新研究所のJiayi Sun氏には、ウェスタンブロットの支援に心から感謝いたします。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.45 μ;m ポリフッ化ビニリデン膜 | ミリポア | PR05509 | |
| 無水エタノール | Chron 化学薬 | 64-17-5 | |
| ウシ血清アルブミン | BioFroxx | 4240GR100 | |
| 広域スペクトル プロテアーゼ阻害剤混合物 | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| 強化された化学発光試薬 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH 抗体 | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| ゲルイメージング装置 | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| 高速凍結遠心分離機 | ベックマン・コールター | アレグラ X-30R | |
| 西洋わさびペルオキシダーゼ結合アフィニピュアヤギ抗体 | プロテインテックグループ株式会社 | SA00001-2 | |
| イソプロピルアルコール | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| タンパク質ブロッティング電気泳動システム | Bio-Rad | MiniPROTEANÒテトラセル | |
| RAW264.7 セル | ビヨタイムバイオテクノロジー株式会社 | C7505 | |
| RAW264.7 細胞特異的培地 | プロセルライフサイエンス&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE タンパク質ローディングバッファー | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE ランニングバッファーパウダー | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| ウォーターバス | Memmert | WNE10 | |
| 浄水器 | Millipore | Milli-IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
参考文献
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