方法論記事

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

2.4K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/66580

⸱

2024年5月24日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

この記事について

サマリー

このプロトコルは、一次マウスT細胞の単離および特定の環境条件下でのT細胞遊走のタイムラプス顕微鏡法を定量的分析とともに提供します。

要約

適応免疫応答は、病原体や異物に応答して血液、リンパ液、組織を通過するT細胞の能力に依存しています。T細胞の遊走は、ケモカイン、ケモカイン受容体、接着分子など、環境や局所免疫細胞からの多くのシグナル入力の調整を必要とする複雑なプロセスです。さらに、T細胞の運動性は、周囲のダイナミックな環境手がかりの影響を受け、活性化状態、転写状況、接着分子の発現などを変化させる可能性があります。 In vivoでは、これらの一見絡み合った要因の複雑さが、T細胞の遊走に寄与する個々のシグナルを区別することを困難にしています。このプロトコルは、T細胞の単離からコンピュータ支援分析までの一連の方法を提供し、非常に特殊な環境条件下でのT細胞の遊走をリアルタイムで評価します。これらの条件は、移動を制御するメカニズムの解明に役立ち、T細胞動態の理解を深め、動物実験では達成が困難な強力なメカニズムの証拠を提供する可能性があります。細胞遊走に影響を与える分子間相互作用をより深く理解することは、より優れた治療法を開発するために重要です。

概要

T細胞は、適応的な抗原特異的免疫応答の主要なエフェクターです。集団レベルでは、T細胞は不均一であり、異なる特殊機能を持つ細胞サブセットで構成されています。重要なことに、CD8+ T細胞は免疫系の主要な細胞溶解エフェクターであり、感染した細胞や機能不全の細胞を直接排除します1。

成熟したCD8+ T細胞は組織内に存在し、抗原を求めて血液やリンパ管を循環します。感染中、T細胞は血液または組織中に抗原を提示され、脾臓または最も近いドレナージリンパ節に迅速に排出されて、生産的な免疫応答を開始します。いずれの場合も、T細胞は活性化され、クローン性増殖を起こし、リンパ系を離れて血液に入ります(まだそこにない場合)。この過程で、細胞内シグナル伝達は、リンパホーミング受容体のダウンレギュレーションと、組織特異的な移動に不可欠な多数のインテグリンおよびケモカイン受容体のアップレギュレーションをもたらします2。最終的に、T細胞の感染部位への直接的な移動は、インテグリンとケモカインのシグナル伝達を含む環境シグナルの収束によって駆動されます。

ケモカインは、大きく分けて2つのクラスに分類できます:(1)分化、生存、および基礎機能に不可欠な恒常性シグナルと、(2)走化性に必要なCXCL9、CXCL10、CCL3などの炎症シグナル。一般に、ケモカインは、インテグリン発現1を活性化するだけでなく、走化性と呼ばれる方向性移動を促進するシグナル勾配を作り出します。走化性は細かく制御され、感度が高く、T細胞は特定の方向や場所に導く可能性のある勾配の小さな変化に応答することができます。

これらのT細胞関連因子に加えて、遊走は細胞外マトリックス(ECM)の組成と密度によっても影響を受けます。ECMは、コラーゲンやプロテオグリカンなどのタンパク質の密集したネットワークで構成されており、T細胞上の接着性インテグリン受容体の足場となっています。インテグリンは、膜貫通型タンパク質の多様なファミリーであり、それぞれが高度に特殊化された結合ドメインと下流のシグナル伝達効果を持っています。T細胞の表面にインテグリン受容体が動的に発現することで、T細胞の変化する環境に迅速に適応することができます3。重要なことは、インテグリンはECMと細胞内細胞骨格アクチンネットワークを結合し、これらが連携してT細胞の移動に必要な推進力を生成することです。

要約すると、遊走パターンは免疫細胞の表現型または環境シグナルによって異なります。これらの複雑な生物学的プロセスは、T細胞、周囲の細胞、および局所的な感染組織の表面上のサイトカイン、ケモカイン、インテグリンの発現によって厳密に制御されています。 インビボでは、これらの遊走メカニズムは複雑であり、いくつかの相加的なシグナル4から生じる可能性がある。この複雑さにより、一見連動しているように見える変数間に因果関係を確立することは不可能な場合があります。これを克服するために、特定のケモカインシグナルに対する応答やT細胞インテグリンとECM結合タンパク質との間の相互作用など、T細胞遊走の特定の側面を研究するためのいくつかの in vitro アプローチがあります。このプロトコルは、2次元空間での in vitro 遊走アッセイと特定のT細胞遊走を分析するための計算解析ツールを使用して、マウスCD8+ T細胞を単離および活性化する方法に対応します。これらの方法は、文献に記載されている他のいくつかの細胞移動アッセイのように、高度な材料やデバイスを必要としないため、ユーザーにとって有利です。これらの方法で生成された細胞遊走データは、免疫応答の証拠を簡便な方法で提供できるため、in vivoでのさらなる情報に基づいた調査が可能になります。

プロトコル

動物のプロトコルは、ロチェスター大学の動物資源に関する大学委員会によって承認されました。この研究のマウスは、ロチェスター大学の動物施設の病原体のない空間で飼育されました。本研究では、6-12週齢の雄/雌C57BL/6マウス(15-30g)を用いた。マウス組織の単離は、手を覆う手袋と鼻と口を覆うフェイスマスクを装着したベンチトップ、またはバイオセーフティキャビネット内で行うことができます。すべての細胞培養とプレート調製は、バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. CD8+ T細胞の精製と活性化

  1. 材料の準備
    1. CD8+ T細胞のネガティブセレクションの場合:抗CD4抗体と抗MHCII抗体をそれぞれ産生するハイブリドーマ細胞株GK1.5およびM5/114抗体の上清からネガティブセレクション培地を調製します。上清を1:1の比率で混合し、ろ過し、将来の使用のために4°Cで保存します(各抗体>0.5μg/総細胞数100万個)。あるいは、市販のCD8+ T細胞単離キットも入手可能です。
    2. T細胞の活性化:500 μLのCD3(10 μg/mL)およびCD28(16 μg/mL)抗体を1x DPBS(カルシウムおよびマグネシウムなし)に添加し、非組織培養(TC)処理した24ウェルプレートに添加し、プレートが結合することを確認します。
      注:抗体とタンパク質は、通常のTC処理されたものよりも非TC処理された培養プレート/ディッシュをよりよくコーティングするため、非TC処理された培養プレートはT細胞の生成に使用されます。
  2. 70 μmの細胞ストレーナーをディッシュに入れて10 cmの培養ディッシュ(または同等品)を調製し、2 mLのR9培地をフィルター(R9培地:RPMI 1640xに10% FBS、1%抗生物質-抗真菌薬、20 mM HEPESバッファー、1% MEM非必須アミノ酸、50 μM β-メルカプトエタノール)を分注します。
  3. 実験デザインによって決定された適切な遺伝的背景、性別、年齢、および体重を持つマウスを入手してください。
  4. CO2 を使用してマウスを安楽死させ、その後子宮頸部脱臼を行うか、地元の動物の世話と使用プロトコルによって定義され、施設によって承認された適切な安楽死戦略を使用します。
  5. マウスを仰臥位に置き、4本の手足すべてを体に対して垂直に伸ばし、マウス解剖Tピンまたは同等のものを使用してフットパッドを解剖ボードに固定します。マウスの外科的解剖ハサミで腹側下腹部の皮膚層から表面的な中央切開を行い、あご(~8cm)までまっすぐに切り込みます。皮膚を腹膜の内壁から分離して、リンパ節を露出させます。皮膚を幹から垂直に伸ばし、固定します5。
    1. 鈍い鉗子(または標準的なマウス外科解剖キットの推奨タイプ)を使用して、頸椎、軸、上腕、および鼠径リンパ節を両側に穏やかに切除します。ステップ1.2で調製したセルストレーナに移します。
    2. 腹膜を開き、脾臓を取り出します。ステップ1.2で調製したセルストレーナに移します。
    3. マウスの死骸は適切なバイオハザードレセプタクルに廃棄します。
  6. ステップ1.2から2mLのR9培地を含む70μmセルストレーナー上で機械的破壊することにより、組織破壊ツールを時計回りと反時計回りに繰り返し半回転させて、二次リンパ組織の単一細胞懸濁液を調製します。
    注:ルアーロックシリンジのプランジャーエンド(3 mLまたは10 mL)は、組織の粉砕と均質化に適しています。代替材料は、ユーザーの裁量で使用することができます。
  7. 細胞、シリンジエンド、ストレーナー、および培養皿を7 mLの培地で洗浄し、ストレーナーが直立したままであることを確認して、単一細胞懸濁液に存在する可能性のある大きな組織片または細胞凝集体が移動するのを防ぎます。
  8. 細胞懸濁液を15mLのコニカルチューブに移します。
  9. 細胞を室温(20°C)で270 x gで5分間ペレット化し、上清をデカントします。
  10. 500 μLのライジングバッファーを1分間加えて、赤血球を除去します。9.5 mLのR9培地で希釈し、270 x g(20°C)で5分間遠心します。上清をデカントします。
  11. ペレットを、抗MHCIIおよび抗CD4を含む、以前に調製したネガティブセレクション培地10mLに再懸濁します(ステップ1.1.1)。室温(20°C)で30分間岩を動かします。
  12. 細胞を270 x g で5分間ペレット化し、上清をデカントします。R9培地10mLで3回洗浄します。
  13. 同時に、15 mLのコニカルチューブで、200 μLのヒツジ抗ラットIgGビーズを7 mLの培地で洗浄します。チューブを磁石の上に置き、媒体を取り除き、洗浄手順を2回繰り返します。ビーズを7 mLのR9培地に再懸濁します。
  14. 細胞を270 x g(20°C)で5分間ペレット化し、上清をデカントした後、ステップ1.13のビーズ懸濁液7 mLにペレットを再懸濁します。室温(20°C)で45分間岩を振る。
  15. 磁気ビーズの枯渇によりCD8+ T細胞を濃縮します。コニカルチューブを蓋をせずに磁石に直接3分間置き、抗体/ビーズ結合細胞を除去します。CD8+ 細胞は保持する必要があります。チューブを磁石に入れたまま、血清学的ピペットまたは同等のものを使用して細胞懸濁液を回収し、新しい15 mLチューブに移します。270 x g(20°C)で5分間遠心分離し、培地で3回洗浄します。
  16. プレコートされた活性化プレート(ステップ1.1.2)を1x DPBSで2回洗浄し、プレートの底面を直接ピペッティングせずに洗浄します。
  17. オプション:生リンパ球/死リンパ球の分離を行い、死細胞を除去します。
    1. 細胞を15mLのコニカルチューブに移します。細胞懸濁液の底に2 mLのリンパ球分離培地を穏やかに加えます。900 x g で10分間(室温)、低加減速で遠心分離します。
      注:生細胞は、培地と分離培地(中央の白色層)の界面で分離します。死んだ細胞はチューブの底でペレット状になり、最後に廃棄される場合があります。
    2. 生きたリンパ球を含む中間層を新しいチューブに移し、室温で5分間270 x g で遠心分離します。上清をデカントします。
  18. ペレットを10 U/mL組換えマウスIL-2を含む12 mLの培地に再懸濁します。TC処理をしていない24ウェルプレートで1ウェルあたり1 mLをプレート化し、37°Cに一晩移します。

2. 活性化したCD8+ T細胞のリフティング

  1. 標準的な卓上型光学顕微鏡で、4倍または10倍の対物レンズを使用して細胞を可視化します。
    注:活性化T細胞は、不活化T細胞と比較して大きく丸く、または細長く見え、ウェル全体に細胞の密集したクラスターを持つ必要があります。
  2. 活性化細胞を持ち上げるには、1 mLピペットで細胞を破壊し、プレートの端でよく混合するようにします。細胞を新しい15 mLコニカルチューブに移します。
    注:活性化細胞はより粘着性があり、より激しいピペッティングが必要です。
  3. ウェルを1 mLのR9培地で洗浄し、残っている細胞をすべて取り除きます。必要に応じて、もう一度繰り返します。細胞を270 x g (20°C)で5分間遠心分離します。上清を捨てます。
  4. ステップ1.17-1.18のように、生リンパ球/死リンパ球分離を行い、死細胞を除去します。
  5. 非TC6ウェルプレートにIL-2を入れたR9培地で3〜4日ごとに生細胞/死細胞を除去してT細胞を維持します。
    注:T細胞は、おそらくT細胞とT細胞の接触またはそれらの活性化を助けるT細胞由来の可溶性因子のために、初期の活性化中に小さな寸法のウェルでよりよく増殖します。急速なT細胞の増殖により、培養後24〜48時間以内に培地が黄色になります。この時点で、細胞を持ち上げ、細胞に十分な新鮮培地(通常、ウェルあたり5 mL)を供給できる新鮮な培地(コーティングされていない非TCの6ウェルプレート)に移します。枯渇した培地は、黄色のミディアムカラーの変化が示されたとき、または3〜4日ごとに新鮮なものと交換してください。

3.ガラス皿の準備

  1. ガラス細胞遊走チャンバーまたはプレートを300 μL/cm2 Protein A(0.1 mg/mL)で4°Cで一晩コーティングし、1x DPBSで2回洗浄して皿に分注し、デカンテーションしてから次のステップに進みます。
  2. 移行チャンバーまたはプレートに300 μL/cm2 組換えマウスICAM-1またはVCAM-1 Fcキメラ(0.1-2.75 mg/mL)を組換えマウスケモカイン(0.1-10 μg/mL)とともに室温で2-3時間コーティングします。フィブロネクチン、マウスコラーゲンIV、マウスE-カドヘリンなどの他のインテグリンリガンドは、チャンバーを2.5-10 μg/mLで一晩、4°Cで直接コーティングするようにレンダリングされます。
    1. チャンバーを1x DPBSで2回洗浄し、皿に分注し、細胞を追加する直前にデカントします。
      注:T細胞は、活性化、分化、感作、およびプライミングの状態に応じて、異なる濃度のインテグリンリガンドおよびケモカインで異なる方法で移動することができます。複数の異なる濃度での細胞移動を評価することが強く推奨されます。
  3. T細胞をがん細胞などの他の細胞と共培養する場合は、イメージング開始の24時間前に接着細胞をガラスコーティングプレートに播種して、がん細胞のT細胞の死滅をリアルタイムで測定します。

4. 細胞の調製

  1. オプション:T細胞および接着細胞を、1x DPBS中の1x DPBS中1 x 107 細胞あたり1 μg/mLで選択したセルトラッカー色素で、37°C、またはメーカーのプロトコールに従って染色します。
  2. 血球計算盤または同等のものを使用して細胞をカウントします。
  3. 37°Cチャンバーで1-5 g/Lグルコースを補充したLeibovitzのL-15培地に1 x 105 CD8+ T細胞(または所望の量)をプレートします。
    注:L-15培地は、CO2-重炭酸ナトリウムシステムなしで使用するために配合されています。遊離塩基性アミノ酸、リン酸緩衝液、およびガラクトースを使用して緩衝され、pHレベルを維持します。
  4. オプション: インテグリン・ブロッキングを実行します。
    1. インテグリンに対するブロッキング抗体(1-10 μg/mL、抗マウスCD11a(M17/4)、抗マウスCD18(M18/2)、抗マウスVLA-4(9C10))でT細胞を10分間プレインキュベートし、同じ抗体の存在下でクロールします。

5. タイムラプス顕微鏡

  1. ビデオ顕微鏡検査を行います。
  2. T細胞については、明視野および蛍光画像を10〜60秒ごとに10〜60分間、または所望の取得設定で取得します。
    注:T細胞の遊走は温度に敏感であり、マウスT細胞の遊走に最適な温度は37°Cです。 このプロトコルが使用する温度制御システムは、密閉された断熱された顕微鏡デッキと付属の加熱システムで構成されています。イメージングチャンバーはイメージングデッキ上にあります。このチャンバーの周囲には蒸留水で満たされた井戸があり、イメージング中に一定の熱と湿度を確保します。マイクロウェルはイメージングチャンバーの中央に配置されています。

6. ソフトウェア支援によるT細胞遊走の解析

  1. Volocityソフトウェアを使用して、T細胞の遊走を評価します。
    1. Volocityを開き、新しい画像シーケンスを作成します。
    2. すべてのタイムラプスビデオ顕微鏡ムービーを選択して、Volocityの青い領域に移動します。
    3. コントラスト強調ツールを使用して、研究者の希望の設定に明るさとコントラストを調整します。
    4. 画像サイズを確認してください:20倍の場合は0.325μm、10倍の場合は0.65μm。
    5. シーケンス:タイムポイントを設定します(例:15秒ごとに20分間画像を撮影する場合は81枚の画像、1分あたり4枚)。
    6. [測定]タブですべてのタイムポイントのチェックを外します。
    7. 強度を使用してオブジェクトを見つけます-バーをスライドさせて、ピークのちょうど右側にくるようにします。
    8. サイズでオブジェクトを除外する:直径10μm未満で100μmを超えるすべての細胞は、細胞の破片または非細胞粒子を除外します。記録時間の 20% 未満で遊走している T 細胞を除外します (これは、各研究者の定義によって異なります)。
    9. 静的オブジェクトを無視する (チェックボックス)。
    10. [分割されたトラクトを自動的に結合] (チェック ボックス)。
    11. 最短経路を20μm以下に設定します。
    12. セル移動のトラックは、同じセルの位置を経時的に結ぶ線です。各フレームのセグメンテーションによって個々のオブジェクトが検出された場所を検出し、フレーム間でオブジェクトが一致していることを確認して、トラッキング アルゴリズムがトラッキングしていることを確認します。
    13. 新しいプロトコルを保存するには 、[Measurements] > [Save Protocol] > [Name New Protocol] を選択します。
    14. 測定タブですべてのタイムポイントの測定をクリックします。
    15. トラックを高いものから低いものへとタイムスパンで並べ替えます。
    16. 調査員が定義した良好なトラックを持つすべてのセルのトラックID番号を記録します。自動セルトラッキングの後、誤って識別されたトラックや壊れたトラックを除外するために、各セルトラックを手動で評価する必要があります。不良トラックのセルを除外します。
    17. ファイルをカンマ区切りのテキストとしてエクスポートし、目的の分析ソフトウェアにデータを転送します。
      注:基本パラメータ:速度(μm / min)、変位(正味移動、μm)、トラック長(合計パス長、μm)、および蛇行指数(MI;正味変位/トラック長。MI = 1 は、完全に直線的な直線トラックを示します)。
  2. Image J を使用して手動追跡を実行します。
    1. プラグインを開き、 トラッキング と 手動トラッキングを選択します。時間間隔、x/yキャリブレーション(ピクセルサイズ)、zキャリブレーション(手動トラッキングモード)などのパラメータを設定します。個々のセルの追跡を開始するには、[ トラックの追加] をクリックし、最初の時点で 1 つのセルを選択し、すべての時点までセルを続けます。次に、[ トラックの終了]をクリックします。対象のすべてのセルに対してこれを繰り返します。
      注:細胞追跡用の別のツールであるTrackmateは、ImageJプラグイン を介して 利用できる自動追跡ソフトウェアです。

結果

T細胞の活性化の確認は、フローサイトメトリーによって達成でき、マウスT細胞における活性化の標準的なマーカーであるCD69およびCD44の発現増加を探します6。さらに、T細胞集団の純度は、CD3+ CD8+ T細胞のフローサイトメトリーによって決定できます。この方法では、>90%のCD8+ T細胞集団が得られます。

T細胞の遊走は、再現性があり、研究者のニーズに合わせて調整可能なソフトウェア支援の細胞追跡プログラムを使用して評価できます。実験効果を決定するために使用されるいくつかの基本的なパラメータには、細胞速度(細胞の移動速度を決定するための特定の時間あたりの移動長)、変位(移動距離、開始点から終点までの直線、細胞の移動距離を決定するため)、追跡長(移動距離、細胞が移動する距離を決定するための移動経路の全長)、 蛇行指数(MIは0から1の間にあり、移動の直線性を決定し、1 =直線)。これらのパラメータは、CXCL12でコーティングされたICAM-1ガラスに沿って這うナイーブCD8+ T細胞と活性化CD8+ T細胞の遊走性の違いを評価するために使用されます(図1)。ナイーブと比較して、活性化CD8+ T細胞では平均速度、変位、および蛇行指数の増加が観察され、活性化T細胞の遊走能力が増加していることを示しています。同様に、これらの方法では、さまざまなケモカインが細胞移動パターンに与える影響を解明できます。例えば、活性化されたCD8+ T細胞は、CXCL12の存在下では遊走の増加を示しますが、CCL2またはCCL22の存在下では遊走の増加は示されず、遊走は用量依存的に飽和濃度まで増加します(図2)。さらに、ソフトウェア支援型細胞追跡により、個々の細胞遊走の特性評価が可能になり、T細胞の挙動に対する個々のリガンドの影響を理解できます。代表的なセルトラックを 図3に示します。

まとめると、これらのデータは、(1)個々の細胞ベースで細胞遊走を追跡できること、および(2)活性化状態および異なるケモカインおよび接着分子の存在下でのCD8+ T細胞の遊走の違いを区別できることを確認することにより、現在の方法の有効性を裏付けています。このアッセイは、複雑なシグナル伝達メカニズムを解剖し、特定のシグナルの生物学的寄与に細胞タイプ特異的な方法でさらに対処できる焦点 を絞ったin vivo 実験に情報を提供する上で重要なステップです。

figure-results-1
図1:ナイーブおよび活性化CD8+ T細胞の遊走に関するin vitroアッセイ。ナイーブまたはCD3/CD28活性化マウスCD8+ T細胞をICAM-1とCXCL12で10分間遊走させました。細胞移動の速度、変位、および蛇行指数は、タイムラプス顕微鏡とVolocityを使用して分析されました。各グループには 36 個の個別の T 細胞があります (平均 ± SEM)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:活性化CD8+ T細胞のケモカイン依存性遊走に関するin vitroアッセイ。CD3/CD28活性化マウスCD8+ T細胞は、ICAM-1と示されたケモカインで遊走させられました。視野内で50μm以上を20分間這った細胞数の割合(全体に占める割合)を求めた。1つのアッセイで>10個の細胞を解析しました(SEM±グループ平均あたりn = 3アッセイ)。対応のないt検定、*p< 0.05、対照と比較。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:ICAM-1とCXCL12上の活性化CD8+ T細胞の遊走性トラックを20分間観察。 色付きの各線は、各 T セルの移動トラックを、セルのポイントから反対の方向に示します。この特定のアッセイでは、38個の細胞のうち24個が有意な長さ(少なくとも私たちの定義による細胞幅の距離)で移動しました。T細胞は異なる距離の長さで移動し、各細胞が異なる活性化またはプライミングの状態にあったことを示しています。すべての移動細胞は、表面が均一にコーティングされた条件下で異なる方向に移動しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

in vivoでの収束シグナルの生物学的影響を理解することは困難であり、解釈は容易ではありません。本明細書に提示するプロトコルは、高度に定義された生物学的に関連性のある条件でのT細胞遊走を理解するための合理的な方法を提供する。これらの条件は、研究者の裁量に基づいて指定することができ、プロトコルは、さまざまなT細胞集団、活性化状態、および細胞表現型のニーズに合わせて変更することができます。さらに、多くのリガンドおよび受容体は、これらの定義された抗体ブロッキング7,8およびリガンド被覆ガラス処置8,9,10を通じて調べることができる。この技術は、遺伝子操作された免疫細胞を開発するための重要なプラットフォームでもあった11,12。

プロトコールの重要なステップには、二次リンパ組織の単離、T細胞の活性化、ガラスイメージング皿のコーティング、およびデータ解析が含まれます。経験の浅い目には、組織に埋め込まれたリンパ節の識別と抽出が難しい場合があります。これは練習で克服できます。T細胞を単離して精製すると、活性化ステップにより細胞が粘着性になり、適切に持ち上げないと収量が低下する可能性があります。これは、ウェルを寛大かつ慎重に洗うことで回避できます。ガラス皿は、目的のリガンドで適切にコーティングし、細胞を添加する前に洗浄する必要があります。これにより、細胞が接着するための堅牢なタンパク質層が利用可能になると同時に、過剰な試薬が生物学を混乱させないようにすることができます。生理的pHおよび塩濃度におけるプロテインA-ガラス表面結合およびFc-プロテインA結合は、緩衝液を穏やかに注いでデカンテーションするときに洗い流されるのを防ぐのに十分な強度があります。培地に残留するタンパク質は、もし存在していても毒性を引き起こさないが、結合していないリガンドが高濃度にある場合、結合したリガンドとの細胞相互作用を乱す可能性がある。コーティングされたガラスを数回すすぐことで、この可能性を排除します。最後に、研究者が細胞の挙動や形態の微妙な違いさえも検出できる、ユーザーフレンドリーな商用および非商用のソフトウェアが多数存在します。ソフトウェアが犯す可能性のあるエラーを排除するために、分析結果を手動で安心させることの重要性は、いくら強調してもしすぎることはありません。

T細胞の精製と活性化の方法は、研究者のニーズに合わせて変更でき、in vivo観察を再現するための適切な細胞状態と表現型を得ることができます。様々な細胞型および状態を用いて、感染および免疫応答の異なるメカニズムに対処することができる7,8,9,10,11,13、これには、ナイーブT細胞およびメモリーT細胞の挙動、ならびに組織特異的条件におけるプライミングおよびリクルートメントなどの記憶応答の様々な側面への対処が含まれる14.この方法は、細胞間接触時間と持続時間7,9、抗原提示9,13、標的細胞死滅6など、細胞相互作用をさらに理解するために、異なる細胞タイプとの共培養に使用することができます。追加のレポーターとラベルを使用して、細胞内構造7、顆粒15、アポトーシス6などを評価することができます。

このプロトコールは、単純化された高度に定義された条件での観察に基づいて、追加の in vivo 実験を導くための優れたツールです。細胞の運動性の in vitro 評価は非常に還元的ですが、複雑な生物学的活性を分解するための重要なステップです。これらの実験の結果により、研究者は、より生理学的に関連性があり、的を絞った方法で in vivo 研究に取り組むことができます。

この方法の単純さは、その主要な制限も表しています。in vivo活性を代表するものですが、すべての結果は、例えば生体内多光子顕微鏡などを使用してさらに確認することができます。本明細書に記載の方法は、顕微鏡システムに統合された、またはスコープの対物レンズに別々に設置されたデジタルカメラを備えた明視野顕微鏡および/または落射蛍光顕微鏡を備えた研究室で完全に利用可能な最も単純な方法の1つです。一方、in vitro免疫細胞遊走の高度な解析には、より多くの選択肢があります。まず、免疫細胞はしばしば生体系のケモカイン勾配によって駆動されます。ケモカイン勾配下での免疫細胞の挙動の解析は、いくつかの方法で達成できます。簡単な方法の 1 つは、特別に設計されたスライドを使用することです (資料の表を参照)。このチャネリングウェルシステムは、底部がインテグリンリガンドでコーティングされている場合、静的なケモカイングラジエント下での免疫細胞の遊走の分析が可能になります。免疫細胞走化性のための他の簡単なアッセイには、ケモカインを放出するマイクロピペットチップへの細胞移動の経時顕微鏡法16、アガロースアッセイ17の下、およびジグモンドチャンバー18が含まれる。制御されたケモカイン勾配下でのより洗練された移行アッセイには、マイクロ流体勾配発生器を備えたカスタマイズされたスライドが必要です19,20。第二に、免疫細胞は、異なるメカニズムを使用して独自の物理的条件で移動することができ、時にはインテグリン依存性のリガンドへの接着を使用せずに移動することができます。一次元でのin vitro遊走アッセイは、インテグリンリガンドコーティングの有無にかかわらず行うことができ、毛細血管21,22における免疫細胞の運動性を再現する。別の選択肢は、細胞25,26の間質移動の根底にあるメカニズムを調査するための、三次元空間23,24での細胞移動アッセイである。全体として、動的細胞移動イベントを研究するためのシンプルで再現性があり、信頼性の高い方法の概要を説明しました。

開示事項

著者らは、すべての研究と原稿の準備は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で行われたことを宣言します。

謝辞

私たちは、これらのプロトコルの開発に時間をかけて貢献してきたKim Labの過去および現在のメンバーに感謝します。代表的なデータは、P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/米国とP01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/米国によって可能になりました。この出版物は、Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Awardの助成金番号T32 GM135134によって部分的に可能になりました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 cmディッシュコーニング353003または同等の
15 mLコニカルチューブThermoFisher339650または同等の
1x DPBSGibco14190144カルシウムおよびマグネシウムなし
6ウェルプレート非TC処理Corning3736または同等の
70 & マイクロ;m細胞ストレーナーFisherScientific352350または同等の
ACK溶解バッファーThermoFisherA1049201または同等の
Allegra 6KR遠心分離機ThermoScientificsorvall 16R with tx400 3655ローターとバケットまたは同等の
ベータメルカプトエタノールSigmaM3148または同等の
CellTrace VioletThermoFisherC34571または同等の
遠心分離機ThermoScientificSorvall ST 16Rまたは同等の
コラーゲン (IV)コーニング354233または同等の
DeltaT 培養皿 .17 mm 厚ガラス 透明Bioptechs04200417C
Dynabeads 羊 抗ラット IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 マグネットThermoFisherScientific12301Dまたは同等品
Easy sep マウス T細胞単離キット幹細胞19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLまたは同等の
フィブロネクチンSigmaAldrich10838039001または同等の
フィジーhttp://fiji.sc/ウェブリンク
フィルターキューブニコンまたはオリンパス
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080または同等の
HQ CCDカメラCoolSNAPまたは同等の
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/hweblink
ImageJ自動追跡プラグインhttp://imagej.net/TrackMateweblink
ImageJ手動追跡https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlウェブリンク
L-15さまざまな材料を参照してくださいミディアムレシピ:Leibovitz'フェノールレッドを含まないL-15培地(Gibco)に1-5 g / Lグルコースを補充
リーボビッツのL-15培地、フェノールレッドなしサーモフィッシャー21083027
ルアーロック使い捨てシリンジフィッシャーサイエンティフィック14-955-459または同等の
リンパ球分離培地コーニング25-072-CIまたは同等の
M5 / 114ATCCTIB-120
MEM 非必須アミノ酸サーモフィッシャー11140050または同等の
顕微鏡加熱システムOkolabokolab.comカスタムデザインが利用可能
ミリセルEZスライドミリポアC86024
モジョソートマウス CD8+ Naïve T細胞単離キットBiolegend480043
Mouse E-cadherinR&D systems8875-EC-050または同等の
マウス手術解剖キットFisher Scientific13-820-096または同等の
NIS エレメントNikonSoftware
non-TC 24wpCorning353047または同等の
ペニシリン-ストレプトマイシンThermoFisher15140122または同等の
プロテイン AThermoFisher Scientificまたは同等の
R9各種資料を見る中程度 レシピ: RPMI 1640x 10 % FBS、1 % 抗生物質 - 抗真菌薬 (Gibco)、20 mM HEPES バッファー (Gibco)、1 % MEM 非必須アミノ酸 (Gibco)、50 μM &β;-メルカプトエタノール (Sigma-Aldrich)
組換えマウス ICAM-1 Fc キメラR&D systems796-IC-050または同等の
組換えマウス IL2Biolegend575410または同等の
RPMI 1640xThermoFisher11875093または同等の
T ピンFisher ScientificS99385または同等の
TE2000-U 顕微鏡Nikonまたは同等の
各種 組換えマウス ケモカインR&Dシステムまたは同等の
VCAM-1 Fc chimeraR&D systems643-VM-050または同等の
VolocityPerkinElmerソフトウェア
プラグイン

参考文献

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
  3. Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815(2021).
  4. Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
  5. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
  6. Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850(2023).
  7. Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
  8. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352(2015).
  9. Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
  10. Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
  11. Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231(2021).
  12. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
  13. Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
  14. Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
  15. Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239(2013).
  16. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
  17. Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
  18. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), Pt 1 606-616 (1977).
  19. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
  20. Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
  21. Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
  22. Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379(2014).
  23. Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963(2014).
  24. Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
  25. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  26. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).

再版と許可

タグ

TCD8 T
マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。