透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

サマリー

このプロトコールは、透過型電子顕微鏡用のレチナールオルガノイドサンプルの最適化された精巧な調製手順を提供します。成熟した網膜オルガノイドのシナプス分析を含むアプリケーションに適しています。

要約

レチナールオルガノイド(RO)は、特定の条件下で人工多能性幹細胞(iPSC)から分化したヒトの網膜の特徴を模倣した三次元培養システムです。ROにおけるSynapseの発生と成熟は、免疫細胞化学的および機能的に研究されています。しかし、シナプス接触超微細構造の直接的な証拠は限られており、特殊なリボンシナプスと従来の化学シナプスの両方が含まれています。透過型電子顕微鏡(TEM)は、高解像度で、ヒトや様々な種における網膜の発達とシナプスの成熟を解明する立派な歴史を特徴としています。これは、ROのシナプス構造を探索するための強力なツールであり、ROの研究分野で広く使用されています。したがって、ナノスケールでのROシナプス接触の構造をよりよく探索し、高品質の顕微鏡的証拠を得るために、RO TEMサンプル調製の簡単で再現性のある方法を開発しました。このホワイトペーパーでは、プロトコル、使用した試薬、およびRO固定調製、固定後、埋め込み、視覚化などの詳細な手順について説明します。

概要

ヒトや哺乳類の重要な視覚感覚器官である網膜は、ニューロン体細胞を収容する3つの核層^{と、従来の}シナプスと特殊なリボンシナプス^2,3を含むシナプス結合1によって形成される2つのフジツ状層を特徴とする明確な積層構造を示しています。リボンシナプスは、小胞のインパルスを段階的に伝達する上で重要な役割を果たします^2,3。視覚プロセスには、さまざまなレベルのニューロンとシナプスにわたる電気光学信号の伝達が含まれ、最終的には視覚野^{に到達します4,5}。

レチナールオルガノイド(RO)は、人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する三次元(3D)培養システムであり、in vitroで網膜組織の生理学的状態を模倣しています^1,6,7。このアプローチは、網膜疾患の研究⁸、薬物スクリーニング⁹、網膜色素変性症¹⁰や緑内障¹¹などの不可逆的な網膜変性疾患の潜在的な治療法として役立つことが期待されています。強力なin vitro光学伝導システムとして、RO内のシナプスは効果的なシグナル変換と伝達を促進する重要な構造です⁵。

ROの発生は、その形態学的形質および分子^{発現プロファイル6,12}に応じて、大きく3つの段階に分けることができる。ステージ1(D21-D60付近)のROは、網膜の神経前駆細胞、多くの網膜神経節細胞(RGC)、および少数のスターバーストアマクリン細胞(SAC)で構成され、ヒト胎児の発育の最初のエポックに対応します。ステージ2(D50-D150付近)では、ROは一部の光受容体前駆体、介在ニューロン、および移行期を表すシナプス形成関連遺伝子を発現します。光受容体は、ヒト胎児の発育の第3段階に対応するステージ3のRO(D100-D150の後頃)で成熟します^6,12,13。注目すべきは、ステージ1およびステージ2のROと比較して、ステージ3のROは、リボンシナプス¹⁴の存在を含む、シナプスが成熟した明確なラメラ構造¹²を有する。さらに、最近の研究では、成熟したシナプスが光信号の透過性に存在することが確認されており、それらが機能的であることが示されています¹³。したがって、ステージ3のROは、シナプス構造を調査するために選択されることがよくあります。

免疫組織化学は、さまざまな分子タンパク質の発現の研究に広く応用されています。しかし、光学顕微鏡の限界は、一度に限られた数の特定の細胞や分子しか観察できないため、細胞とその周辺環境との関係を包括的に解析することができません。透過型電子顕微鏡(TEM)は、0.1〜0.2 nmの限られた分解能で、光学顕微鏡を¹⁵倍~10〜20倍上回る高解像度を特徴としています。光学顕微鏡の欠点を補うもので、ヒト^16,17や種^々の種18,19,20,21における網膜の発達とシナプスの成熟を解明するために用いられている。TEMは、シナプス前成分とシナプス後成分^18,20を直接区別することを可能にし、さらにはリボン^2,3、小胞²²、ミトコンドリア²³などの細胞内構造の包括的な観察も可能にする。したがって、TEMは、シナプスの種類を特定し、ナノスケールでROのシナプス接触の超微細構造を探索するために不可欠なツールです。

サンプル調製は、高品質の電子顕微鏡写真を取得するために非常に重要であることに注意することが重要です。いくつかの研究では、RO12,13,24に対してEMを実施しましたが、詳細な手順は不明です。電子顕微鏡の画像品質は、ROの固定と試薬の透過の影響に大きく依存するため、調製時にはさまざまな重要な要素を考慮する必要があります。したがって、ROのシナプス接触をよりよく調べるために、ROの固定、埋め込み、および観察部位の同定の操作点を示す再現性の良い方法を提示します。

プロトコル

1. iPS細胞からのROの取得²⁵

注:ROは、以前に報告された手順を変更することにより、iPSCから導き出されました。

1. 細菌性プロテアーゼを用いて~90%のコンフルエンスでiPS細胞を解離します( 材料の表を参照)。コロニーを細かく刻み、セルリフターでこすり落とします。
2. 採取後、細胞のクラスターを0.25 mLの氷冷マトリゲルに再懸濁します。37°Cで20分間インキュベートした後、固化したゲルをDMEM/F12培地(0.5% N2サプリメント、1% B27サプリメント、0.1 mM β-メルカプトエタノール、0.2 mM L-グルタミン代替品、100 U/mLペニシリン、100 mg/mLストレプトマイシン)で散らします。この時間を微分の 0 日目と定義します。
3. 5日間の浮遊培養後、細胞はグループ化して細胞嚢胞を形成します。これらの細胞嚢胞を100mmのシャーレに移し、そこで接着して成長させます。
4. 15日目に、細菌プロテアーゼを使用して接着細胞を解離し、DMEM/F12培地(2%B27サプリメント、0.1 mM非必須アミノ酸)で培養します。
5. 21日目に、培地を20 mLの血清含有培地(DMEM/F12培地、8%FBS、2%B27サプリメント、100 mMタウリン、および2 mM L-グルタミン代替品)と交換し、毎週培地を交換します。

2. ROの前方固定

1. 培養したROの1つ(~D180、直径約1~2mmのサイズが最適)をペトリ皿から1.5mLの微量遠心チューブにピペットで静かに移動させ、ROに関する関連情報をマークします。
   注:ROが大きすぎる場合は、ROを半分に切るか、固定剤が入った皿の顕微鏡下でかみそりで構造の悪い組織を切り取ります。
2. ピペットで1.5 mLの微量遠心チューブから培地を取り出します。0.1 M リン酸緩衝液(PB)、pH 7.4 で希釈した 2% パラホルムアルデヒド-2% グルタルアルデヒド固定液 1.5 mL を加え、室温(RT)で 4 時間固定します。微量遠心チューブは4°Cで一晩保管してください。
   注:この手順は1週間一時停止できますが、できるだけ早く再開することをお勧めします。ROを長時間放置すると、細胞の自己消化を引き起こし、ROの超微細構造が破壊される可能性があります。ROは壊れやすいため、回転、振動、反転、または過酷な操作は避けてください。

3. ROの固定後

1. 2%パラホルムアルデヒド-2%グルタルアルデヒド固定液を取り出し、0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 mLでpH 7.4で10 x 3分間洗浄します。洗浄プロセス中にROを1.5 mL微量遠心チューブに静かに懸濁し、完全にすすぎます。固定日を追加するごとに、洗浄回数を2回増やして、残留固定剤をできるだけ取り除きます。
2. ピペットを使用して残っているPBSをすべて取り除き、組織ブロックが水没するまで~150μLの1%オスミン酸(OsO4)と交換します。微量遠心チューブを暗い箱に入れて光から保護し、室温で1時間浸潤します。
   注:OsO4は強力な酸化剤であり、ドラフトで取り扱う必要があります。

4. 汚れと脱水症状

注意: このステップから環境を乾燥させるには、除湿機をオンにする必要があります。

1. ピペットを使用してOsO4を除去し、0.01 M PBS(pH 7.4)で10分×3分洗浄した後、脱イオン水で10分×3分洗浄します。
   注意: ROを完全にすすぐために、ROを一時停止することをお勧めします。OsO4を専用の廃棄ボトルに吸引します。
2. 最後の脱イオン水洗浄を取り外し、酢酸ウランのチューブあたり~150μL(組織ブロックの完全な浸透を確保)と交換し、RTで1〜2時間染色します。
3. 酢酸ウランを取り出し、ドラフト内の50%アセトン1mLと交換し、10分間脱水します。次に、70%、80%、90%、100%、および100%アセトンを使用して、ROの勾配脱水に連続して使用します。各脱水症状は10分間続きます。
   注意: 空気や湿気への暴露を防ぐために、交換ごとにROを浸すために液体を残しておきます。また、アセトンは揮発性であるため、できるだけ早く運転してください。酢酸ウランを専用の廃棄ボトルに吸引します。

5. 潜入

1. アセトンを捨て、アセトンとEpon-812樹脂からなる混合物を1:1の比率で~150μL加えます。37°Cのオーブンに1時間置きます。
2. 上記の混合物を取り除き、アセトンとEpon-812樹脂からなる混合物と1:4の比率で交換します。37°Cのオーブンに一晩入れます。
3. ROを~500 μLの純粋なエポキシ樹脂が入った新しいチューブに慎重に移し、45°Cのオーブンに1時間置きます。

6. 埋め込み

1. 50 mLの遠心分離チューブに30-50 mLの純粋なエポキシ樹脂を、事前に製造元の指示に従って試薬キットを混合して調製します。純粋なエポキシ樹脂を逆さまにして30分間ゆっくりと回転させ、ミキサーによって導入される気泡を減らします。その後、37°Cのオーブンに20分間置きます。埋め込み金型の溝に2/3体積の純エポキシ樹脂を追加します。
2. つまようじを使用して、純粋なエポキシ樹脂を装備した埋め込み型にROをピッキングします。
3. 溝がわずかに突き出たり膨らんだりするまで、純粋なエポキシ樹脂で溝を埋めます。
4. 埋め込み金型の両端にあるROの位置を調整して、方向性のある埋め込みを行います。埋め込み型を45°Cオーブンに1〜2時間置き、次に65°Cオーブンに48〜72時間入れます。

7.セミシンポジショニング

1. 埋め込みブロックの長い方の4つの側面の端から組織の周りの余分なエポキシ樹脂を研磨して、台形の面を形成します。埋め込みブロックをサンプル取り付けスタンドに取り付け、Lドライバーでボルトをねじ込みます。次に、ナイフスタンドにガラスナイフを取り付け、ナットを手動で締めます。
2. 目的の領域が露出するまで、余分な樹脂を切り取ります。
3. ガラスナイフのトラフに水を入れます。セミシンミクロトームを用いてセミシンスライスを1μmの厚さにカットし、針付きの顕微鏡スライド上に置きます。
4. 1%トルイジンブルー50μLを加えて半薄スライスを染色し、加熱プレート上で95°Cで1分間インキュベートします。蒸留水で2分間すすぎます。通常の20倍の光学顕微鏡を使用して、切片の構造を観察します。

8. 極薄切片化

1. 手順7.1の説明に従って、埋め込みブロックとガラスナイフを取り付けます。ナイフとティッシュブロックの間の距離、シンクの液面、スライス速度を調整します。厚さ70~100nmの極薄切片を極薄ミクロトームでカットし、支持フィルムで銅メッシュ(200メッシュ)にスライスをすくい取ります。
2. 超薄切片を3%クエン酸鉛で15分間染色し、デュアル染色手順でコントラストを高めます。

9. TEMによるROのイメージング

1. ソフトウェアを起動します( 資料の表を参照)。
2. メモリモードボタンをクリックして、各極薄セクションを大まかにマークします。
3. シナプス構造を検索します。
   1. 低倍率でROの積層構造を区別します。
   2. 電子密度が深い核構造を示す外側の核層(ONL)を見つけます。その後、多数の小胞が蓄積する光受容体の末端に移動します。単一のシナプスリボンを持つロッド端子と、複数のシナプスリボンを持つコーン端子を検索します。
   3. 内側のプレキシフォーム層(IPL)に移動し、小さなリボンで同様の構造を探します。
4. 顕微鏡画像をキャプチャします。
   1. [スタート]をクリックし、対応する倍率を入力します。
   2. 画像を保存します。

結果

iPS細胞の分化による3次元ROの確立は、網膜疾患のメカニズムや幹細胞補充療法の研究に強力なツールを提供します。他の研究者は、ROのシナプス結合を機能的および免疫細胞化学的に実証していますが、従来のシナプスとリボンシナプスの直接的な証拠は非常に限られています。ここでは、TEMによってROの2種類のシナプスの超微細構造を調査する方法を紹介します。180日間の培養後、ROを固定、染色、包埋、および極薄スライスしました。TEM観察の結果、OPLに分布する視細胞の軸索終末にリボンシナプスが認められ(図1 、 図2)、それが明らかになった。TEM下では、桿体のリボンがシナプス陥入の周囲に広がり、水平な細胞を持つ馬蹄形のプロファイルを形成します(図1)。通常、ロッドにはリボンが 1 つしかありませんが、コーンには複数のリボンがあります (図 2)。さらに、IPLのアマクリン細胞間に古典的な化学シナプスが観察されました(図3)。TEM下では、化学シナプスはシナプス前、シナプス間隙、シナプス後という3つの部分で構成されています。シナプス前部分とシナプス後部分に対応する細胞膜は、他の部分よりもわずかに厚く、2つの膜の間の狭い隙間をシナプス間隙と呼びます。シナプス前膜部位の細胞質には多くのシナプス小胞があります。この研究は、iPS細胞に由来する3D ROに完全なシナプス結合が存在することを確認しています。ただし、ステップ間のすすぎが不完全であると、サンプル調製の過程で黒い粒子が沈殿することになることに注意してください(図4)。

図1:ROのロッドリボンシナプスのTEM画像(A、B)ロッドと水平セルは馬蹄形のプロファイルを形成します。ROのOPLの各ロッドスフェルールに単一のリボン(矢印)が観察され、多数の小胞に囲まれていました。スケールバー = 0.2 μm。略語:ROs =網膜オルガノイド;HC = 水平セル;OPL =外側のプレキシフォーム層。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ROのコーンリボンシナプスのTEM画像。 3つのリボンシナプス(矢じり)は、ROのOPLの円錐形椎弓根で明らかでした。スケールバー = 0.2 μm。略語:TEM =透過型電子顕微鏡;ROs = 網膜オルガノイド;OPL =外側のプレキシフォーム層。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ROの化学シナプスのTEM画像。 従来の化学シナプスが、ROのIPL層のアマクリン細胞間で観察されました。化学シナプスは、シナプス前、シナプス間隙、シナプスの3つの部分で構成されています。シナプス前膜部位の細胞質には多くのシナプス小胞があります。矢印はシナプス伝達の方向を示し、1つのAC1プロセスから別のAC2プロファイルへの多数の小胞の移動を示します。スケールバー = 0.2 μm。略語:TEM =透過型電子顕微鏡;ROs = 網膜オルガノイド;IPL =内側のプレキシフォーム層;AC=アマクリン細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:サンプル調製の過程で発生する可能性のある問題の例。 ステップ間のすすぎが不完全であるため、円錐形の茎には黒い粒子(円)がたくさんあります。矢印:リボンシナプス。スケールバー = 0.2 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この記事では、TEMによってROの従来のシナプス超微細構造とリボンシナプスの超微細構造を観察するための詳細なプロトコルを紹介しました。このプロトコルは、前述の網膜調製方法に基づいており、いくつかの変更が加えられています²⁰。サンプル処理の成功率とTEM顕微鏡写真の品質を向上させるためには、以下のポイントを考慮してください。まず、ROはiPS細胞から発生し、血管系^6,26とグリア細胞²⁶を欠く細胞塊を形成することを認識することが重要です。この不在は、in vivo 網膜と比較して組織のコンパクトさを低下させる可能性があります。したがって、Rosの構造と完全性を維持するためには、Rosを優しく扱うことが重要です。チューブの壁に沿って液体を追加して、乱れを最小限に抑えます。

重要なのは、プロトコルステップ4で組織の徹底的な脱水を確保し、脱水ステップを開始する前に脱湿機のスイッチを入れて部屋の湿度を下げることです。アセトンを交換するときは、迅速に操作し、組織を沈めるために液体を残して、RO組織構造の深刻な破壊を防ぎます。脱水されていない組織は、高EM高度で急激に収縮し、組織中の水が包埋剤の浸透を妨げます。

ROは透明な球体として存在するため、半薄のスライスを切断するときは正しい方向を確認して、無傷のラメラ構造を取得します。最後に、ステージ3(D100-D150以降)のROは成熟していると考えられ、一体型シナプス¹²を有しており、その結果、リボンシナプスや化学シナプスを含むシナプス接触の調査は、これらのROで行うことが推奨される。

ROシナプスの超微細構造証明は先行研究で限定的に提供されてきたが、ROサンプル調製の完全な手順や様々なタイプのシナプス構造の同定についての詳細はない12,13,24。Capowskiらは、さまざまなhPSCラインによって異なるステージで誘導されるROの特性を調査するために、さまざまな手法を使用し、円錐茎に小胞を含んだリボンシナプスの存在を示す電子顕微鏡写真を含め、さまざまなhPSCラインによって誘導されたステージ3のROが成熟し、機能的であることを明らかにしました¹²。TEMと2光子イメージングを用いて、Cowanらは成熟ROにおける機能的なリボンシナプス構造の形成を確認した¹³が、シナプスの種類(錐体または桿体シナプス)は示されなかった。しかし、いくつかのバッチの顕微鏡写真の結果では、リボンシナプスの膜構造が理想的な明瞭さとコントラストで示されており、このことは、私たちの方法が実現可能で再現性が高いことを示しています。さらに、シナプスの種類は、その異なる形態学的特性に応じて特定されました:円錐シナプスは通常大きく、いくつかのリボンを持っていますが、桿体シナプスは通常小さく、1つのリボンしか示していません。化学シナプスでは、シナプス前構造に小胞が蓄積し、シナプス間隙の電子密度が増強されます。

ROのシナプス接触の超微細構造的完全性は、ROの機能にとって不可欠です。TEMを使用してこれらの接触を調査することは、in vitroでの網膜の病因の研究、ROでの薬物スクリーニングの実施、ROの分化技術の評価など、さまざまな分野で幅広く大きな利点を提供します。2D TEMイメージングでは、ROの超微細構造の特定の側面のみが観察可能であり、シナプスの全体構造を立体的に解析することは困難です。さらに、分化の有界性は、細胞^13,26のずれに寄与し、観察プロセスをさらに複雑にする。したがって、ボリュームEMと3D再構成を組み合わせることで、将来的にはこれらの欠点を克服できる可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100 mmペトリ皿	コーニング	430167
アセトン	電子顕微鏡 科学	10000
B27 サプリメント	Gibco	A3582801
セルリフター	サンタクルス	sc-395251
銅グリッド	北京 Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
デジタル顕微鏡写真ソフト	株式会社ガタン		ソフトウェア
ディスパーゼ	StemCell Technologies	#07913	細菌プロテアーゼ
DMEM/F12培地	Gibco	#11320033
埋め込み型	北京中京慶科技有限公司
Epon-812 樹脂	電子顕微鏡 Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co., Ltd.	RC01001-A
クエン酸鉛	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-グルタミン代替品
マトリゲル	コーニング	356234
顕微鏡スライド	CITOTEST	80312-3161
N2 supplement	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	シグマ	71650	PB/PBS
NaH2PO4·H2O	Sigma	71507	PB/PBSの成分
非必須アミノ酸	Sigma	#M7145
光学顕微鏡	ラボ 双眼生物顕微鏡	Xsz-107bnii
OsO4	sub>TED PELLA	4008-160501
オーブン	ブルーパード	BPG9040A
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡 Science	157-8
Penicillin-Streptomycin	Gibco	#15140-122
Semi/ultrathin microtome	Reichert-Jung	396649
Taurine	Sigma	#T0625
Toluidine blue	Sangon Biotech	E670105-0100
透過型電子顕微鏡	日立	H-7500
酢酸ウラニル	テッドペラ	CA96049
-メルカプトエタノール	Σ	444203