光生体調節増強を用いたハイドロゲル中での脂肪由来幹細胞の三次元細胞培養

サマリー

ここでは、脂肪由来幹細胞(ADSC)培養のための3次元(3D)細胞培養フレームワークとしてのハイドロゲルの使用と、3D培養環境内でのADSCの増殖を促進するための光生体調節(PBM)の導入を実証するプロトコルを紹介します。

要約

脂肪由来幹細胞(ADSC)は、幹細胞に似た多能性間葉系の特徴を持ち、多様な細胞分化能を持ち、遊走・増殖の促進・炎症緩和などの能力を有することから、再生医療に利用されています。しかし、ADSCは、主に好ましくない炎症状態のために、創傷内での生存と生着に課題に直面することがよくあります。この問題に対処するために、創傷におけるADSCの生存率を維持し、創傷治癒プロセスを促進するハイドロゲルが開発されました。ここでは、3D細胞培養フレームワーク内でのADSC増殖と細胞毒性に対する光生体調節(PBM)の相乗効果を評価することを目的としていました。不死化ADSCを10μLのハイドロゲルに2.5×10³ 細胞の密度で播種し、525nmおよび825nmのダイオードを用いて5J/^cm2 および10J/^cm2の流暢さで照射した。形態学的変化、細胞毒性、および増殖は、PBM曝露後24時間および10日後に評価されました。ADSCは丸みを帯びた形態を示し、個々の細胞またはスフェロイド凝集体としてゲル全体に分散していました。重要なことは、PBMと3D培養フレームワークの両方が細胞に細胞傷害性の影響を示さなかったのに対し、PBMはADSCの増殖速度を有意に高めたことです。結論として、この研究は、ADSC培養に適した3D環境としてのハイドロゲルの使用を実証し、特に3D細胞培養に関連する増殖速度の遅さに対処する重要な増強戦略としてPBMを導入します。

概要

ADSCは、自己複製して複数の細胞系統に分化する能力を持つ間葉系多能性前駆細胞です。これらの細胞は、脂肪吸^引法中に脂肪組織の間質血管分画(SVF)から採取することができる1。ADSCは、豊富で、採取に対する侵襲性が低く、入手が容易で、特性が良好であるため、再生医療に使用するのに理想的な幹細胞タイプとして浮上しています²。幹細胞治療は、細胞の遊走、増殖、血管新生を刺激し、創傷内の炎症を軽減することにより、創傷治癒の道筋を提供します^3,4。ADSCの再生能力の約80%は、セクレトーム⁵を介したパラクリンシグナル伝達に起因しています。以前は、損傷した組織に幹細胞または成長因子を直接局所的に注入すると、in vivo修復メカニズムが十分に低下する可能性があることが示唆されていました^6,7,8。しかし、このアプローチは、生存率の低下や、^{炎症環境の結果として}損傷した組織内の幹細胞生着の減少など、いくつかの課題に直面していました9。さらに、理由の1つは、移植された細胞の生存と機能をサポートするための細胞外マトリックスの欠如であった¹⁰。これらの課題を克服するために、現在、幹細胞の生存率と機能をサポートする生体材料担体の開発に重点が置かれています。

3次元(3D)細胞培養は、in vitroでの細胞間および細胞とマトリックス間の相互作用を強化して、in vivo環境によりよく類似した環境を提供する¹¹。ハイドロゲルは、幹細胞培養のための3D環境を提供する生体材料担体のクラスとして広く研究されてきました。これらの構造は、水と架橋^{ポリマー12}からなる。ADSCをハイドロゲルに封入しても^、細胞の生存率を維持しながら、培養中の細胞に細胞毒性の影響はほとんどありません6。3Dで培養された幹細胞は、幹細胞性の保持力を高め、分化能を向上させることを示している¹³。同様に、ハイドロゲルを播種したADSCは、動物モデルにおいて生存率の向上と創傷閉鎖の促進を示した¹⁴。さらに、ヒドロゲルのカプセル化は、創傷におけるADSCの生着および保持を有意に増加させる^15,16。TrueGel3Dは、ポリビニルアルコールまたはデキストランのいずれかのポリマーを、架橋剤(シクロデキストリンまたはポリエチレングリコール)で固化させたものです¹⁷。ゲルは、細胞外マトリックスを効果的に模倣しながら、実験を妨害したり、ゲルの患者への移植中に免疫反応を引き起こしたりする可能性のある動物性製品を一切含まない合成ハイドロゲルである¹⁸。ゲルは、組成と個々の成分を変更することにより、完全にカスタマイズ可能です。異なる幹細胞を収容し、ゲル¹⁹の硬さを調整することにより、いくつかの細胞タイプの分化をサポートすることができる。結合部位は、ペプチド²⁰の添加によって作成することができる。ゲルはメタロプロテアーゼの分泌によって分解され、細胞遊走を可能にする²¹。最後に、それは明確であり、イメージング技術を可能にします。

PBMは、細胞内の発色団を刺激するために使用される低侵襲で簡単に実行できる低レベルレーザー療法です。波長が異なれば、細胞に異なる効果がもたらされる²²。赤色から近赤外の範囲の光は、電子伝達系を通るフラックスを増強することにより、アデノシン三リン酸(ATP)および活性酸素種(ROS)産生の増加を刺激する²³。青と緑の範囲の光は、光依存性イオンチャネルを刺激し、カルシウムやマグネシウムなどの陽イオンの細胞内への非特異的流入を可能にし、分化を促進することが知られている²⁴。正味の効果は、遊走、増殖、分化などの下流の細胞プロセスを引き起こす因子の転写を刺激する二次メッセンジャーの生成である²⁵。PBMは、細胞を有害な環境、例えば損傷した組織に移植する前に、細胞が増殖または分化するように前もって調整するために用いることができる²⁶。ADSCの移植前および移植後のPBM(630 nmおよび810 nm)曝露は、糖尿病ラットモデルにおいて、in vivoでのこれらの細胞の生存率および機能を有意に向上させた²⁷。再生医療では、組織を効果的に修復するために十分な数の細胞が必要です²⁸。3D細胞培養では、ADSCは2次元^{細胞培養と比較して}増殖速度が遅いことがわかっている6。しかし、PBMは、生存率、増殖、遊走、および分化を促進することにより、ADSCの3D細胞培養プロセスを強化するために使用できます^29,30。

プロトコル

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、およびソフトウェアに関する詳細については、 材料表 を参照してください。プロトコルを 図1にまとめました。

1. 2次元(2D)細胞培養

注:不死化ADSC(1 x10⁶ 細胞)は、1 mLの細胞凍結培地を含む凍結保存バイアル内の液体窒素中で-195.8°Cで保存されます。

1. 2D細胞回収培地および2D培養フラスコの調製
   1. 39 mLの基礎培地を50 mLの遠心チューブに移します
   2. 20%ウシ胎児血清(FBS;10 mL)と抗生物質(1 mL)(0.5 mLペニシリン-ストレプトマイシンおよび0.5 mLアムホテリシンB)で基礎培地を濃縮します。.
   3. 6 mLの細胞回収培地をフラスコに移してT75フラスコをプレコンディショニングし、37°C、5%_CO2、湿度85%で45分間インキュベートします(これは、時間を節約するために細胞回収ステップの実行中に行うことができます)。
      注:使用前に培地全体を37°Cに温め、4°Cで最大1週間保管してください。
2. 2D細胞回収
   1. 液体窒素貯蔵タンクからクライオバイアルを取り出し、37°Cの水浴中でバイアルを完全に解凍するまで急速に解凍します。
   2. 1006 x g の遠心分離機でクライオバイアルを5分間(20°C)回転させ、その後上清を除去します。
   3. 予熱した細胞回収培地1 mLを使用して、ペレット化した細胞を再懸濁します。
   4. 浮遊細胞をプレコンディショニングフラスコ(最終容量7 mL)に均等に分配し、37°C、5%_CO2、湿度85%でインキュベートします。
   5. 24時間後、細胞回収培地を廃棄して交換します。
   6. フラスコが細胞と合流するまで、2〜3日ごとに培地を交換します。
3. 単一細胞懸濁液中の2D培養フラスコの回収と細胞数
   1. インキュベーターから2D培養フラスコを取り出し、培地を適切な廃液容器に廃棄します。
   2. 10 mLのリンス溶液をフラスコに移して細胞をすすぎ、老廃物やタンパク質の蓄積を取り除きます。その後、すすぎ液を捨てます。
   3. 培養フラスコに6 mLの剥離液を加え、細胞を剥離します。フラスコを37°C、5%_CO2、湿度85%で2分間インキュベートします。
      注:フラスコを顕微鏡で観察し、すべての細胞が剥離していることを確認します。そうでない場合は、フラスコをそっとたたき、さらに1分間インキュベートします。

1. 2. 
      
2. 9. 
      

1. 4. 
      
      
      
      
2. 2. 
      

1. 6. 
      

1. 
   
2. 5. 
      
3. 1. 
      
   7. 
      

結果

ハイドロゲルの形態を評価し、細胞密度を目視検査するために、逆顕微鏡を使用しました(図2)。ADSCは、播種およびPBM曝露後24時間で丸みを帯びた形態を保持しました。細胞は、単一細胞として、またはブドウのようなクラスターとしてゲル全体に散在していました。形態は3D培養で10日後も変化しなかった。実験群と対照群の間、または異なる実験群間で形態に決定的な違いは認められなかった。

PBM曝露およびハイドロゲルを用いた3D培養の細胞毒性効果を評価するために、LDH漏出を測定しました(図3)。24時間または10日後に実験群と対照群の間に有意差はなく、PBM曝露およびハイドロゲル培養は細胞に有害な影響を及ぼさなかったことが示された。

細胞増殖速度は、ADSCのATP含量を測定することによって測定されました(図4)。PBM曝露は、対照群と比較して、すべての実験群で増殖率の増加をもたらした。PBM曝露後24時間で、525 nmの波長が最も高い増殖速度を刺激しました。しかし、10日目の時点では、825nmの波長は525nmの波長と比較して優れた増殖速度を示しました。 10日間の培養期間の終わりに、825 nm、10 J/^cm2 グループは最も高い増殖速度を示しました。

図1:プロトコルの概要 96ウェルプレートでのハイドロゲルの調製、PBM曝露、およびPBM曝露後24時間および10日での形態および生化学的アッセイの測定を強調する要約されたプロトコル。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:シード後のADSCの自己集約 細胞は円形から楕円形の形態を保持し、播種およびPBM曝露の(A)24時間および(B)10日後にブドウのようなクラスター外観を有する単一細胞または凝集体としてハイドロゲル中に分布した。10日間のインキュベーション後に決定的な変化は観察されませんでした。.対照(1および4)を用いて、5 J/cm² (2)および10 J/cm² (5)で525 nm、または5 J/cm² (3)および10 J/cm² (6)で825 nm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:ハイドロゲル中の525 nmおよび825 nmダイオード(5 J / cm² および10 J / cm²)を使用した、PBM曝露後24時間および10日間の細胞毒性の測定としての細胞LDH漏出。 実験対照と比較して細胞毒性の有意な増加は観察されませんでした。.ポジティブコントロールは完全な細胞死を代表していました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:ハイドロゲル中の525 nmおよび825 nmダイオード(5 J/cm² および10 J/cm²)を使用した、PBM曝露後24時間および10日間の増殖の測定値としての細胞ATP。 PBM曝露は、すべての実験群において、両方の時点および両方の流暢さにおいて増殖率の増加を刺激した。有意差(P < 0.001)は***で示されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

コンポーネント	ウェルあたりの容量(μL)
SLO-デキストランポリマー(30 mmol/L)	0.7
細胞懸濁液	2
バッファ	0.8
水	5.5
架橋剤	1
総ボリューム	10

表1:ハイドロゲル(10 μL)試薬量。

レーザーパラメータ	グリーン(G)	近赤外(NIR)
光源	ダイオードレーザー	ダイオードレーザー
波長(nm)	525	825
電力出力(mW)	553	515
電力密度(mW/cm2)	57.48	53.53

表2:レーザーパラメータ。

ディスカッション

ADSCは、創傷治癒を助けるさまざまなプロセスを刺激するため、再生医療に使用するのに理想的な細胞タイプです^3,4。しかし、生存率の低さや^損傷部位での細胞の生着効果のなさなど、回避しなければならないいくつかの課題があります9。不死化細胞は、初代細胞と比較してより多くの世代にわたって継代することができ、収穫する必要がなく、十分に特徴付けられており、一貫した結果を保証する均質な集団であるため、市販の細胞株として使用されました³¹。この研究の目的は、3D細胞培養を使用して、ADSCの増殖と細胞毒性に対するPBMの増強の可能性を決定することでした。30 μL のハイドロゲルに関するメーカーのプロトコルは、コスト³² を節約するために 10 μL に適合されています。しかし、この減容積により、ゲルの調製と取り扱いがより困難になりました。

ADSCは、3D環境内で自己凝集することが示されている³³。この研究では、細胞はブドウのような外観の細胞凝集体を形成しました。しかし、単独産卵細胞も同定された。細胞脱落は、細胞がメインのスフェロイドまたは凝集体から分離し、培養環境に放出されるスフェロイドの既知の特性です。細胞の脱落は、有糸分裂中に生細胞が脱落し、遊走を可能にする細胞増殖から生じる可能性があります³⁴。或いは、脱落は、細胞死およびスフェロイドまたは凝集体形状^の喪失35、特に壊死コアの成長による非常に大きなスフェロイドにおいて生じ得る。細胞は、2D培養の紡錘体形状と比較して、3D培養では丸みを帯びた形態を採用しました。同様の研究の結果と一致して、これらの結果は、細胞が付着するための付着部位または細胞外マトリックスの欠如によるものです^6,9。さらに、細胞はゲル内で有意な移動を示さず、接着部位³⁶の必要性をさらに示唆した。接着ペプチドまたは別の細胞外マトリックスタンパク質を添加して、接着、接着、および遊走を促進することが推奨されます。この研究の限界は、Zスタッキングの代わりにADSCの3D形態を観察するために逆光学顕微鏡を使用していたことです。PBM曝露と3D培養は、曝露後24時間および10日後の両方でADSCの細胞毒性に有意な影響を及ぼさず、ハイドロゲル培養とPBMは安全であり、細胞に悪影響を及ぼさないことを示しています^6,26。3D細胞培養では、ADSCは2D細胞培養と比較して増殖速度が遅いとされています。これは、現在の研究⁶における正常対照の増殖率の低さによって裏付けられています。PBM(525 nmおよび825 nm)は、3D培養におけるADSCの増殖速度を有意に増加させました。当初、5 J/cm² と 10 J/cm² の両方のフルエンシーの緑色光 (525 nm) は、近赤外光 (825 nm) と比較して最も高い増殖率を示しました。しかし、10日時点では、近赤外光(825 nm)は、5 J/cm²と10 J/cm²の両方のフルエンシーで最も高い増殖率を示しています。同様に、PBM(525 nmおよび825 nm)は、2D培養における増殖速度を増加させることが実証されている³⁷。他の研究では、緑色光と近赤外光の相乗効果が報告されているため、波長の組み合わせグループを含めることもお勧めします。

結論として、使用されるハイドロゲルは、さまざまな用途のニーズに合わせて驚異的なカスタマイズ能力を備えた合成ヒドロゲルです。現在の研究では、ゲルが10日間にわたって培養中の細胞に細胞毒性効果を及ぼさないことが実証されています。さらに、PBMは、3D培養環境にあるにもかかわらず、ADSCの増殖速度を有意に向上させることにより、正の増強の可能性を示しました。したがって、このヒドロゲルは、創傷への移植のための可能な生体材料担体として役立つことができる。今後の研究は、動物実験を用いて創傷治癒を補助するゲルの潜在的な能力をテストすることを目的とすべきである。動物実験の結果が良好であれば、臨床応用における創傷治癒を支援するために、創傷に移植する前に、患者由来のADSCを採取し、カプセル化し、PBMで増強することが想定されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
525 nm ダイオード レーザー	南アフリカ国立レーザー	センター EN 60825-1:2007
825 nm ダイオード レーザー	南アフリカ国立レーザー	センター SN 101080908ADR-1800
96 ウェル ストリップ プレート	Sigma-Aldrich	BR782301
アムホテリシン B	Sigma-Aldrich	A2942	抗生物質 (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D 細胞生存率アッセイ	Promega	G9681	ATP 試薬、増殖アッセイキット
Corning 2 mL おねじポリプロピレン 極低温バイアル	Corning	430659	クライオバイアル
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	細胞凍結培地
CytoTox96 非放射性細胞毒性アッセイ	Promega	G1780	細胞毒性試薬
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	基礎培地 (39 mL/44 mL)
FieldMate レーザーパワーメーター	Coherent	1098297
平底 Corning 96 ウェルクリアポリスチレンプレート	Sigma-Aldrich	CLS3370
胎児ウシ血清	Biochrom	S0615	培地濃縮 (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	リンス液
Heracell 150i CO2インキュベーター	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	96ウェルプレート用プレートスピナー
Heraeus Megafuge 16R 遠心分離機	ThermoFisher	75004270
不死化ADSCS	ATCC	ASC52TelohTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Trypan Blue
Julabo TW20 ウォーターバス	Sigma-Aldrich	Z615501	培地を37°Cに温めるために使用したウォーターバス。C
Olympus CellSensエントリー	Olympus	Version 3.2 (23706)	イメージングソフトウェア:デジタル画像取得
オリンパスCKX41	オリンパス	SN9B02019	倒立型光学顕微鏡
オリンパスSC30カメラ	オリンパス	SN57000530	倒立型光学顕微鏡に取り付けられたカメラ
不透明壁のコーニング96ウェル固体ポリスチレンマイクロプレート	シグマ・アルドリッチ	CLS3912	ATP発光に不透明なウェル
ペニシリン・ストレプトマイシン	シグマ・アルドリッチ	P4333	抗生物質(0.5%;0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D –True3	シグマ-アルドリッチ	TRUE3-1KT	10 & マイクロ;L
TrueGel3D 酵素細胞回収溶液	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher - Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric Plate reader

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