方法論記事

合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム

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DOI:

10.3791/66626

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2024年4月19日

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1School of Life Sciences, Jiangsu Normal University

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この記事について

サマリー

このプロトコルは、合成細胞の構築に使用される無細胞タンパク質合成(CFPS)システムについて説明しています。主要なステージの概要と、さまざまなマイクロコンパートメントでの代表的な結果を示します。このプロトコルは、合成細胞コミュニティの多様な研究室のベストプラクティスを確立し、合成細胞開発の進歩を促進することを目的としています。

要約

無細胞タンパク質合成(CFPS)システムは、合成細胞のボトムアップアセンブリを促進するために広く採用されています。セントラルドグマの中核となる機械のホストとして機能し、多様な人工細胞模倣システムの統合と組み立てに最適なシャーシとして立っています。合成細胞の製造に頻繁に使用されているにもかかわらず、特定のアプリケーション向けにカスタマイズされた堅牢なCFPSシステムを確立することは、依然として重要な課題です。この手法論文では、合成細胞の構築に日常的に採用されているCFPSシステムの包括的なプロトコルを紹介します。このプロトコールには、細胞抽出物、テンプレート調製、蛍光レポータータンパク質を利用したルーチン発現の最適化など、CFPSシステムの準備における主要な段階が含まれます。さらに、CFPSシステムを単分子膜液滴、ダブルエマルジョンベシクル、担持脂質二重膜の上にあるチャンバーなど、さまざまなマイクロコンパートメント内にカプセル化することにより、代表的な結果を示します。最後に、これらのCFPSシステムを異なる環境で成功裏に組み立てるために必要な重要な手順と条件を解明します。私たちのアプローチにより、拡大を続ける合成細胞コミュニティのさまざまな研究所間で優れた作業慣行が確立され、合成細胞開発の進歩が加速することを期待しています。

概要

合成細胞または人工細胞の合成は、学際的研究の非常に著名な分野として浮上しており、合成生物学、化学、生物物理学の領域全体の科学者から大きな関心を集めています。これらの科学者は、最小の生細胞1,2,3を構築するという共通の目標によって団結しています。この分野の急速な成長は、組換えDNA操作4、生体模倣材料5、無細胞タンパク質合成(CFPS)法7を含むコンパートメント化のための微細加工技術6などの重要な技術の大幅な進歩と歩調を合わせています。CFPSシステムは、転写と翻訳に不可欠な細胞機構を包含し、多機能人工細胞の開発と統合のための基本的なフレームワークを提供します。

CFPS技術は合成細胞のアセンブルに頻繁に使用されますが、さまざまな合成細胞システムのアセンブル化のための堅牢でカスタマイズされたCFPSシステムの開発は依然として複雑な課題です。現在、原核生物と真核生物の両方のモデル生物8に由来する多数のCFPSシステムが利用可能であり、それぞれが合成細胞合成の特定のアプリケーションに特化したものである。CFPSシステムは、転写と翻訳における中心的な役割を超えて、その主要なコンポーネントと関連する準備手順が異なります。細胞抽出物、RNAポリメラーゼ、テンプレート調製方法、バッファー組成の違いなど、これらのバリエーションは、主に、タンパク質収量を最大化するためにシステムを集中的に最適化した研究グループが追求する明確な開発軌道によるものです。

CFPSシステムのさまざまなコンポーネントの中で、細胞抽出物は転写と翻訳のための重要な酵素プールであり、したがってCFPSパフォーマンスの重要な決定要因です9。大腸菌(大腸菌)ベースのCFPSは、最もよく理解されている原核生物としての地位により、最も一般的に利用されているシステムです。さらに、上田氏の研究グループは、個別に精製されたタンパク質とリボソームからなる完全再構成CFPSシステム「PURE10」を開発しており、特に明確なバックグラウンドを必要とするアプリケーションに適しています。今日、大腸菌ベースのCFPSシステムでさえ、特にextracのソース株11と調製方法12,13、RNAポリメラーゼ14,15、エネルギー源16,17、および緩衝システム18,19の点で多様化しています。最も頻繁に使用される株には、A1920、JM10921、BL21 (DE3)22、Rossetta223などのK12およびB株の派生株と、それらの遺伝子組換え株が含まれます。

最初に、RNaseおよびプロテアーゼ活性が低下した 大腸菌 株が選択され、mRNAの安定性と新たに合成された組換えタンパク質の安定性が向上し、最終タンパク質収量が増加しました24。続いて、 大腸菌 抽出物は、上記の翻訳後修飾を達成するために、グリコシル化25、リン酸化26、および脂質化27を含む特定の翻訳後修飾を促進するように操作されました。さらに、分子シャペロン28 や化学安定剤などの一連の添加剤が組み込まれており、標的タンパク質の折り畳みを助け、CFPSシステムの多様化に貢献しています。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼは、その高い処理能力で知られており、主に転写に使用されていますが、SP629 などの他のポリメラーゼも利用されています。 大腸菌 内在性RNAポリメラーゼは、シグマ因子30を活用した遺伝子回路のプロトタイピングに適応しています。最後に、様々なエネルギー前駆体31、32、33 、および異なる塩および緩衝成分19、34、35 が、生産性を向上させるために体系的に最適化されている。

CFPSシステム自体に加えて、カプセル化方法とコンパートメント化材料も、合成細胞の組み立てを成功させるために不可欠です。CFPS反応をうまくカプセル化するために開発されたさまざまなシステムには、界面活性剤で安定化された水滴/油滴、脂質/ポリマー、およびそれらのハイブリッド単層小胞(直径50 nmから数μmの範囲)、および平面支持脂質二重膜が含まれます。しかし、CFPSシステムの複合体分子含有量により、カプセル化の成功率は特定のケース、特に小胞の形成に依存します。CFPSのカプセル化の成功率および効率を改善するために、液滴および小胞36の両方の形成を促進するための種々のマイクロ流体チップが開発されてきた。それにもかかわらず、追加のチップとデバイスを確立する必要があります。

このプロトコルは、組換えタンパク質生産に一般的に使用される宿主であるBL21(DE3)株を利用した 大腸菌 CFPSシステムを示しています。このプロトコールには、細胞抽出物の調製、テンプレートの調製、および蛍光レポータータンパク質を使用した標準発現の最適化の詳細な説明が含まれています。さらに、CFPSシステムを、単層液滴、ダブルエマルジョンベシクル、支持脂質二重層の上にあるチャンバーなど、さまざまなマイクロコンパートメント内にカプセル化することによって達成される例示的な結果を示します。最後に、これらのCFPSシステムを異なる環境状況で成功裏に確立するために不可欠な重要な手続き要素と必要条件について詳しく説明します。

プロトコル

1.抽出物の準備

  1. グリセロールストックから 大腸菌 BL21(DE3)株をLuria Bertani(LB)寒天プレートにストリークし、37°Cで少なくとも15時間インキュベートします。
  2. 調製したばかりのLBプレートから1つのコロニーをLuria Bertani(LB)培地の50 mLフラスコに接種することにより、一晩の予備培養を準備します。
  3. 5 mLのプレカルチャーを500 mLの2xYTPG培地に接種し、3 Lのバッフル付き三角フラスコに入れます。37°Cで激しく振とう(220rpmから250rpmの間)成長させ、細胞が中対数相(OD600 ~3)に達したときに細胞を収穫します。次に、細胞培養物を冷たい氷水に10分間入れ、8,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。
    注:このステップでは、2xYTPG培地中のグルコースは、特定のアプリケーション9,12では省略できます。
  4. 得られた細胞ペレットを35 mLの予冷済みS30バッファーAに再懸濁した後、8,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。 上清を捨てます。
  5. 手順1.4を2回繰り返します。
    注:セルペレットは、すぐに使用しない場合は-80°Cで保存できます。
  6. 最終ペレットをS30バッファーBに再懸濁し(例:細胞ペレット1 gあたり1.1 mLのS30バッファーBを使用)、17,000 psiのFrench Pressを1回通過して細胞を破壊します。
    1. フレンチプレスを使用するには、ユーザーマニュアルに従い、セルサスペンションをフレンチプレス金属ディスラプションチャンバーに移し、すべてのコンポーネントが組み立てられ、ディスラプションチャンバーの底部バルブが閉じていることを確認します。
    2. 組み立てたディスラプションチャンバーを油圧プラットフォームに移し、安全ロックを固定します。
    3. 油圧ポンプをオンにして、混乱を開始します。
    4. アウトレットバルブを制御して、セル懸濁液がアウトレットチューブから新しい50 mLチューブに流れ込むようにします。効率的な混乱を確保するために、流れの速度を調整します(理想的には一度に1滴ずつ)。圧力を下限の15,000psiより上に維持します。
  7. 得られたライセートを30,000 × g で4°Cで30分間遠心分離し、上清を回収します。遠心分離を一度繰り返し、上清を回収します。採取した上清に0.3容量のプレインキュベーションバッファーを加え、37°Cで80分間穏やかに振とうしながらインキュベートします。
    注:プレインキュベーションバッファーの使用は、最終収率を増加させる可能性がありますが、空のランオフ(プレインキュベーションバッファーなし)も効率を改善する可能性があることが報告されていますが、これは対応するソース株によって異なります37,38。
  8. 得られた流出混合物を 2 L の S30 バッファー C に対して 2 時間透析し、透析バッファーを 2 L の新鮮な S30 バッファー C と 1 回交換し、4 °C39 で一晩透析します。
    注:夜間透析の2番目のステップは、約3時間に短縮できます。
  9. 透析したサンプルを採取し、30,000 × g で4°Cで30分間遠心分離します。 上清と分注を適切な量に集め、液体窒素ですぐに急速凍結します。
    注:凍結サンプルは、効率を損なうことなく、少なくとも6か月から1年間-80°Cで保存できます。

2. T7 RNAポリメラーゼ

  1. pAR1219プラスミドをBL21(DE3)スター 大腸菌 コンピテントセルに形質転換します40。
  2. 10 mLの一晩培養液を1 LのLB培地(100 μg/mLアンピシリンを含む)に接種します。OD600 が0.6〜0.8に達するまで、細胞を37°Cで増殖させます。
  3. 導入を開始するには、最終濃度1 mM IPTGを添加します。細胞をさらに5時間誘導し、8,000 × g で4°Cで15分間遠心分離して回収します。 細胞ペレットを-80°Cで最大数週間保存します。
  4. 細胞ペレットを30 mLのT7バッファーAに再懸濁し、15,000 psiのFrench Pressを1回通過して細胞を破壊します。細胞破片を20,000 × g で4°Cで30分間遠心分離して除去します。
  5. 前のステップから上清に硫酸ストレプトマイシンを一滴ずつ加え、最終濃度4%(w / v)に達します。.氷上で短時間インキュベートした後、20,000 × g で4°Cで30分間遠心分離します。
  6. 上清を 0.45 μm のフィルターメンブレンでろ過し、ろ過したサンプルを、10 カラム容量の T7 バッファー B であらかじめ平衡化した強陰イオン交換カラム (カラム容量 40 mL) に自動液体クロマトグラフシステムを介してロードします。
  7. ロードしたカラムを50カラム容量のT7バッファーBで洗浄し、サンプルを10カラム容量の低塩(50 mM NaCl)および高塩(500 mM)T7バッファーC混合物で溶出し、~3 mL/minの流速で50〜500 mMのNaClの線形濃度勾配を確立します41。
  8. ピーク画分を採取し、SDS-PAGEで解析します。
    注:T7ポリメラーゼは~100 kDaで優勢なバンドを示しますが、SDS-PAGEゲル上には依然としてかなりの量の不純物が現れます。
  9. T7ポリメラーゼを含む画分をプールし、T7バッファーCの2Lに対して一晩透析します。
  10. グリセロールを添加して最終濃度10%に到達し、得られた混合物を限外濾過42により最終濃度3〜4mg / mLまで濃縮します。
    注:濃縮プロセス中に沈殿物が現れた場合は、すぐに停止し、遠心分離によって沈殿物を除去してください。
  11. グリセロール濃度を50%に調整します。分注し、液体窒素でサンプルを急速凍結します。-80°Cで長期間保存してください。
    注:少量のアリコートは、効率を損なうことなく、-20°Cで少なくとも1か月間保存することもできます。

3. バッファーの調製

  1. 表1に示されているように、使用の前日にバッファーを準備します。

4. テンプレートの設計と準備

  1. 目的の遺伝子をT7プロモーターベースのベクターにクローニングするか、目的の遺伝子を含む線状PCR産物を生成します。
    注: 設計原則については、ディスカッションのセクションを参照してください。
  2. プラスミド抽出キットを使用して、一晩培養したプラスミドを調製します。
    注:イソプロパノール沈殿ステップとそれに続く70%エタノールによる洗浄手順を含むプラスミドキットを選択することをお勧めします。
  3. 乾燥させたDNAを少量の超純水に溶解し、微量分光光度計で測定した濃度を200 μg/mLから500 μg/mLにします。
  4. オプション:線状PCR産物からタンパク質を直接発現します。
    注:この場合、PCR精製ステップが必要です。

5. Mg2+ およびK+ の最適化

  1. 表2に示すMg2+濃度スクリーニング、または表3に示すK+濃度スクリーニング用のマスターミックスを調製します。
  2. マスターミックスを個々のマイクロフュージチューブまたはV字型の96ウェルプレートに移します。
  3. 正確な量のMg2+ またはK+ ストック溶液を個々のマイクロフュージチューブまたはV字型96ウェルプレートにピペットで移し、超純水でCFPS反応を完了します。反応を少なくとも2時間インキュベートします。
    注意: V字型の96ウェルプレートを使用する場合は、蒸発を防ぐためにプレートをプラスチックカバーで密封してください。
  4. 反応混合物2 μLを取り出し、黒色の96ウェルプレートに移し、プレートリーダーによる蛍光測定を行います。
    注:蛍光板リーダーは、 励起/発光:485/528、ゲイン:50、読み取り高さ:7.00mmのセットアップで使用します。ただし、精製された蛍光タンパク質を使用して特定の検量線を生成するには、プレートリーダーを調整する必要があります。

6. カプセル化

  1. 液滴
    1. 界面活性剤含有フッ素油(HFE7500中の2%PFPE-PEG)または脂質を鉱物油に溶解して脂質-鉱物油溶液を調製します(手順6.2.1参照)
    2. 表4の対応する試薬2〜18を組み合わせて、CFPS反応液の総容量100μLを調製します。1.5 mLチューブにあらかじめ調製した油500 μLにCFPS反応を加え、チューブラック50xでチューブを激しくこすり、微細な(油中水型)液滴を形成します。チューブを30°Cでインキュベートして反応を行います。
      注:単純なマイクロ流体チップは、均質な液滴を生成するためにも使用できます43。
  2. 巨大単層小胞(GUV)
    1. 脂質-鉱物油溶液の調製
      1. 4 mLガラスバイアルに57 μLのクロロホルムを加え、次に25 mg/mL 1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロール-3-ホスホコリン(POPC)脂質18 μLを加えてクロロホルム脂質溶液を形成し、最終濃度8 mMを達成します(同様の最終濃度の他の脂質を使用してください)。
        注:この混合ステップは、異なる脂質の均質な混合を確保するためのものでした。
      2. アルゴン流下でクロロホルムを15分間蒸発させた後、さらに真空下で1時間蒸発させます。
      3. 得られた乾燥脂質を1,500 μLの鉱物油に溶解し、最終濃度400 μMに達します。
    2. 界面脂質層の形成
      1. 1.5 mLチューブに500 μLの外部溶液( 表5を参照)を加え、外部溶液の上に250 μLの脂質-鉱物油溶液をゆっくりと重ねます。室温で30分間インキュベートし、安定した界面脂質層を形成します。
    3. 内部溶液の調製
      1. 表6のすべての試薬を混合してプレインナー溶液を形成し、使用するまで氷上に保ちます。表4にリストされている試薬16-18として、T7RNAP、S30抽出物、およびDNAテンプレートをプレインナー溶液に添加することにより、インナー溶液を完成させます。
        注:カプセル化されたスクロース濃度を250mM以上に増加させると、無細胞翻訳が阻害される可能性があります44。
    4. GUVのフォーメーション
      1. 500 μLの脂質鉱物油が入った1.5 mLの新しいチューブに50 μLの内液を加え、ピペットですばやく上下させ、激しくボルテックスします。
      2. チューブを氷上に10分間放置し、ステップ6.2.2の1.5mLチューブの油相の上部に20μLのエマルジョン混合物をゆっくりと加えます。
      3. 800 × g で遠心分離(100 × g から1000 × gの範囲の遠心分離速度を使用)で4°Cで10分間遠心分離し、チューブの底でGUVが形成されるのを観察します。
        注:より速い比遠心分離速度を使用することができます。しかし、遠心分離速度は、形成されたGUV45のサイズに影響を与える可能性があると考えることができます。
      4. 上部油相を取り外します。
      5. チューブの底に30μLのGUVを慎重に吸引します。回収したGUVを30°Cでインキュベートします。
        注:最適なインキュベーション温度は、タンパク質によって異なります。
      6. 共焦点レーザー走査型顕微鏡(LSM)を使用して、蛍光タンパク質の発現をモニターします。
  3. サポートされている脂質二重層(SLB)
    1. SLBチャンバーの準備
      1. Piranha-clean 24 x 24 mm #1.5 coverslipsは、各カバースライドの中央に7滴の硫酸と2滴の50%過酸化水素を加えて洗浄します。反応物をカバースリップ上で少なくとも45分間インキュベートします。超純水で十分にすすいでください。
      2. 洗浄したカバースリップにカットした0.5mLのマイクロチューブを、紫外線ランプ(365nm)で硬化させた光学接着剤を用いて10分間取り付け、リコンスティテューションチャンバーを組み立ててリコンスティテューションチャンバーを作製します。
    2. SLBフォーメーション
      1. 80 mol% 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホコリン(DOPC)、19.95 mol% 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホ-L-セリン(DOPS)、および0.05 mol% Atto488-DOPE(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン= DOPE)を溶解し、クロロホルムに混合し、穏やかな窒素流で乾燥させ、1時間真空にして溶媒を完全に除去します。
      2. 乾燥した脂質フィルムをSLBバッファーAで再水和すると、最終脂質濃度が4 mg/mLになります。
      3. 得られたサンプルをボルテックスし、透明になるまで超音波処理します。
      4. 4 mg/mLのSUVを130 μLのSLBバッファーAで希釈し、75 μLの懸濁液を予め形成された反応チャンバーに移し、37°Cのヒートブロック上で1分間インキュベートします。150 μLのSLBバッファーAを反応チャンバーに加え、さらに2分間インキュベートします。
      5. CFPS反応のために0.4%(w/v)BSAを含むS30バッファーCにバッファーを交換する前に、2 mLのSLBバッファーB(MgCl2を含まないSLBバッファーA)でチャンバーを洗浄し、形成されたSLBが乾燥するのを防ぐためにチャンバー内に100 μLのバッファーを残します。
      6. 残留したS30バッファーCを取り出し、CFPS反応混合物をSLBチャンバーに慎重に加えます。チャンバーを30°Cでインキュベートし、共焦点レーザー走査型顕微鏡で発現をモニターします。

結果

細胞抽出物とT7 RNAポリメラーゼの新しいバッチごとに、Mg2+ とK+ の両方の濃度の基本的なスクリーニングを実施して、CFPSシステムの最適な性能を確保することをお勧めします。スーパーフォルダーGFPの蛍光は、 図1A、Bに示すように、さまざまな条件下でのCFPSシステムの全体的な収量の指標として役立ちます。さらに、異なるコンパートメント間でのCFPSシステムの並行収率比較を 図1Cに示し、スクロース46の影響によりGUVがわずかに減少するものの、カプセル化されたCFPSシステムで一貫した性能を示しています。さらに、CFPS反応は、液滴(図2)、GUV(図3)、およびSLB上(図4)にカプセル化されることに成功しました。

図2A は、油溶液が乱流になったときに明らかなエマルジョン液滴の形成を強調しています。緑色/赤色蛍光タンパク質(GFPおよびmCherry)の発現は、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて捕捉しました。 図3 は、単純なエマルジョン転写プロセスによるGUV内のCFPS反応のカプセル化の成功を示しています。赤いチャネルは、標識された脂質を示しました。緑のチャンネルはスーパーフォルダGFPの表現を示しました。黄色のチャンネルは不活性な蛍光色素を表していました。 図4A は、CFPS反応を堆積させることができるSLBチャンバーを示しています。このチャンバー内では、ガラスカバーガラスの上にSLBを形成し、CFPS反応混合物を予め形成されたSLBの上に配置することで、共焦点レーザー走査型顕微鏡によるイメージングを可能にしました。 図4Bに示すように、SLBは標識脂質(緑色)で可視化され、mCherryと融合した発現した低分子GTPアーゼCdc42はマゼンタで示されています。mCherry-Cdc42の in-situ 発現は、可逆的なメンブレンターゲティングプロセスとともに、顕微鏡下で観察できました。しかし、利用されたCFPSシステムは、最近の出版物47で詳述されているように、プレニル化機械によって補完された。

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図1:CFPSシステムの最適化と比較。 CFPSシステムの(A)Mg2+ 濃度および(B)K+ 濃度のバルクでのスクリーニング。(C)異なるコンパートメントでのタンパク質発現収量を示す棒グラフ。スーパーフォルダーGFPの蛍光を使用して、プレートリーダーまたは共焦点レーザー走査型顕微鏡で測定したCFPSシステムの収率を決定しました。略語:CFPS =無細胞タンパク質合成;GFP = 緑色蛍光タンパク質;sfGFP = スーパーフォルダGFP;GUV =巨大な単層小胞;SLB = 担持脂質二重層。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:液滴中での無細胞タンパク質合成 (A)界面活性剤で安定化された油中水滴中のカプセル化されたCFPS反応の写真。(B)共焦点レーザー走査型顕微鏡で可視化された液滴に封入された(C)mCherryおよび(D)スーパーフォルダーGFPのCFPSの明視野および(C,D)蛍光画像。スーパーフォルダ GFP は緑色で示されます。mCherryはマゼンタで表示されます。スケールバー = 20 μm。略語:CFPS =無細胞タンパク質合成;GFP = 緑色蛍光タンパク質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:GUVにおける無細胞タンパク質合成 (A)GUVにおけるカプセル化されたCFPS反応の写真。(B-D)POPC GUV内にカプセル化されたCFPSの蛍光像で、スーパーフォルダGFPを発現しています。(B)脂質二重層は、0.05%標識されたAtto647N-DOPE脂質で標識され、赤色で示され、(C)不活性色素は黄色で示され、(D)スーパーフォルダーGFPは緑色で示されました。スケールバー = 20 μm。略語:CFPS =無細胞タンパク質合成;GFP = 緑色蛍光タンパク質;GUV =巨大な単層小胞;POPC = 1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロール-3-ホスホコリン;DOPE = 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:SLB上の低分子GTPaseタンパク質-Cdc42の無細胞タンパク質合成 (A)共焦点レーザー走査型顕微鏡で可視化された、SLB上のCdc42の膜ターゲティングとRhoGDI依存性膜抽出の再構成の概略図。プレニル化機構は、プレンリトランスフェラーゼ濃縮抽出物を介して実施されましたが、これについては他の場所で詳しく説明しています。47. (B) SLBの上の反応混合物のプレニル化前およびプレニル化後の直交図。(C,D)(C)メンブレンターゲティングおよび(D)メンブレン抽出中のメンブレン(ピンク)および溶液中(黒)のmCherry-Cdc42強度の時系列。スケールバー = 10 μm. (A-D) は Kai et al.47 から採用されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: バッファーの一覧。 注:使用直前にβ-メルカプトエタノールとDTTを添加してください。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:Mg2+濃度スクリーニングのピペッティングスキーム。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3:K+濃度スクリーニングのためのピペッティングスキーム。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表4:内部溶液の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表5:外部溶液の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表6:プリインナー溶液の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この原稿では、油中水滴、GUV、SLBなど、合成細胞プラットフォーム全体のさまざまなマイクロコンパートメントで使用するために設計された改変無細胞タンパク質合成(CFPS)システムの概要を説明しています。私たちは、タンパク質中心の合成細胞システムを構築するためのソース抽出物として、標準的な大腸菌組換えタンパク質発現宿主株であるBL21(DE3)を利用しました。このアプローチにより、異なるコンパートメント間で約 0.5 mg/mL のタンパク質が得られました。他のカスタマイズされた抽出源株を使用することもできますが、これらのシステムは主に特定の種類のタンパク質または代謝活性に最適化されており、一般的なタンパク質発現には最適ではない可能性があります。近年の定量的質量分析の進歩により、細胞溶解物48,49のプロテオミクス解析に関するパイロット研究が、特にさまざまな調製条件下で可能になりました。

これらの研究から知見を得ているにもかかわらず、これらの同定されたタンパク質因子とCFPSシステムの全体的な性能との間に定量的な相関関係を確立することは依然として困難です。このギャップは、特定の抽出物のバッチの性能を定量的に評価する方法について、未解決の問題を残していました。さらに、報告された異なるソース株の系統的かつ並行的な比較はありませんでした。この研究では、2xYPTG培地を利用してバイオマス生産を促進しましたが、これは転写に内在性RNAポリメラーゼを利用する場合に2xYPTに移行することが推奨される戦略です。T7ポリメラーゼを抽出物調製手順に統合できるという提案にもかかわらず45、我々は、高いバッチ間のばらつきを減らすために、S30抽出物とT7 RNAポリメラーゼの別々の調製プロトコルを選択した。

標的タンパク質の産生は、中枢的な転写/翻訳プロセスに本質的に関連しています。適切なテンプレートデザインと純度は、無細胞発現を成功させるために重要です。プラスミドテンプレートに加えて、PCRによって生成された直鎖二本鎖DNAも使用できるため、スクリーニングやハイスループットアプリケーションに適しています。大腸菌のin vivo発現のための従来のテンプレートデザインとは異なり、大腸菌の無細胞系のテンプレートデザインは、発現誘導を考慮することなく簡素化されます。無細胞発現テンプレートの唯一の重要な要素は、T7制御配列です。しかし、場合によっては、標的遺伝子の5'配列が、対応する転写されたmRNAによって形成される二次構造に応じて、翻訳開始に影響を与える可能性があります。リボソーム結合部位が転写されたmRNAの安定なステムループ内に位置している場合、翻訳開始が大幅に妨げられ、全体的な発現が低下する可能性があります。同様に、連続した希少コドンは発現を妨げる可能性があるため、in vivo研究と同様に最適化する必要があります。これは、コドン最適化50およびmRNA二次構造予測51専用のオープンソースサーバーを通じて達成することができる。

緩衝系については、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼを添加したアセテート緩衝液をエネルギー再生源として実験装置に使用しました。この設定により、クレアチンリン酸を用いたクレアチンキナーゼによるシングルステップエネルギー再生反応に起因する、中程度の発現レベルと比較的速い速度論が得られました。一部の研究者は、グルタミン酸緩衝系に移行し、それが細胞環境により類似していることを理由に52、現在のプロトコルではタンパク質発現収量に大きな差は観察されなかった。しかし、最近のプロテオミクス分析では、抽出物処理法と組み合わせた異なるバッファーシステムが最終発現収量に影響を与える可能性があることが示されました19。エネルギー前駆体に関しては、費用対効果と発現収率の向上を達成するために、多数の研究グループによって多様な基質が研究されてきました53,54。提示されたCFPSシステムの文脈では、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼが意図的に選択されました。この選択は、シングルステップ反応によって達成可能なエネルギー再生の効率と、抽出物から受け継がれた内因性酵素との干渉がないことによって動機付けられました。その結果、この構成により、さまざまなマイクロコンパートメント環境に適した、単純でありながら堅牢なシステムが確立されます。

示された結果に示されているように、我々は、セミフッ素化油によって安定化された油中水滴、エマルジョン転写によって形成されたGUV、および支持脂質二重層の上の3つの異なるマイクロコンパートメントでタンパク質発現の成功を示しました。さまざまなマイクロコンパートメント間でのタンパク質発現の多様性は、合成細胞構築のための当社のCFPSシステムの堅牢性を浮き彫りにしています。これらのカプセル化方法の中で、エマルジョン液滴技術は、攪拌またはボルテックスのみを必要とするCFPSシステムをカプセル化するための非常に簡単なアプローチでした。しかし、これらの液滴は水の界面が不安定であるために不安定になる傾向があり、この制限は油相に脂質や界面活性剤を追加することで対処できます。液滴は油中水滴の安定性に優れていますが、細胞膜で隔てられた2つの水性コンパートメントからなる天然の細胞環境を完全には再現していません。液滴の代わりに、1ミクロンを超えるサイズの巨大な単層小胞(GUV)が確立され、細胞をより密接に模倣しました。CFPSシステムは、これらの小胞の脂質二重層内にカプセル化され、多様な合成細胞システム55のための転写および翻訳機械を提供した。

エマルジョントランスファーは、ダブルエマルジョンとも呼ばれ、その穏やかな調製プロセスと無溶媒法と比較して比較的高いカプセル化効率により、CFPS反応をカプセル化するための典型的な手法として際立っています。しかし、ダブルエマルジョン小胞の生成は、単純な遠心分離ステップからマイクロ流体支援エマルジョン移送の使用まで範囲に及ぶことができ、各方法は、他の場所で要約されているように、それに関連する長所と短所を有する36。CFPSシステムをGUVにうまく封入するには、浸透圧を調整し、油水界面を横切るための適切な力を加える必要があります。ここで説明するエマルジョン転写法は最も簡単で、特定の実験装置を必要としませんが、生成されたGUVの効率と均質性はバッチごとに異なる可能性があります。さらに、全てのエマルジョン移送方法は、形成された二重層界面の内腔内の残留油を処理しなければならず、追加の油除去ステップ56が必要であり、これは動力学的プロジェクトにおいて課題をもたらす可能性がある。

最後に、支持脂質二重膜(SLB)上でのCFPSの発現が成功したことを示し、脂質生体膜環境に近い場所でタンパク質合成を必要とするプロジェクトに貴重なアプローチを提供します。提示されたCFPSシステムの利用を通じて、細胞の極性に重要な中心タンパク質分子であるCdc4247の可逆的膜ターゲティングプロセスの特性評価におけるその成功した応用を実証しました。要約すると、さまざまなマイクロコンパートメントで観察される一貫した培地発現収量と固有の堅牢性は、多様な合成細胞システムの構築におけるこのCFPSシステムの可能性を浮き彫りにしています。この機能は、さまざまなタンパク質中心モデルを含むようにさらに拡張することができ、最終的には最小細胞の実現に向けて前進します。

開示事項

著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる可能性のある既知の競合する金銭的利益や個人的な関係がないことを宣言します。

謝辞

M. Y.は、中国江蘇省の大学院研究実践イノベーションプログラムからの資金提供を認めています(助成金番号。KYCX22_2803)。L.K.は、中国江蘇省高等教育機関自然科学研究(助成金番号17KJB180003)、中国江蘇師範大学自然科学財団(助成金番号17XLR037)、中国江蘇省高等教育機関の優先学術プログラム開発、および中国江蘇省特任教授プログラムの支援に感謝しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)Avanti850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (ナトリウム塩)(DOPS)Avanti840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti850457P
3,5-サイクリックAMP(cAMP)Sigma-AldrichA9501
50 mLチューブEppendorfEppendorf Tubes BioBased
50%過酸化水素Sigma-Aldrich516813
AcetateSigma-AldrichA6283
寒天粉末Sigma-Aldrich05040
アラニンSigma-AldrichA4349
Amicon Stirred CellsMerckMilliporeUFSC05001
Ammonium acetate (NH4OAc)Sigma-AldrichA7262
ArgininSigma-AldrichA4474
AsparaginSigma-AldrichA0884
AspartatSigma-AldrichA5474
ATPロシュ11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
バッフル三角フラスコシュニウ250 mL, 1000mL
ウシ血清アルブミン (BSA)ロシュ10711454001
遠心分離管エッペンドルフエッペンドルフ チューブ 3810X
遠心分離機ラックエッペンドルフ0030119819
化学発光および落射蛍光イメージングシステムUvitecAlliance Q9 Advanced
ChloroformSigma-Aldrich288306
共焦点レーザー走査顕微鏡 (LSM)ZEISSLSM 780
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10283
CoverslipThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
クレアチンキナーゼ (CK)Roche10127566001
クレアチンリン酸 (CP)Sigma-Aldrich10621714001
培養皿Huanqiu90 mm
CysteinSigma-AldrichC5360
Cytidine 5'-三リン酸二ナトリウム塩(CTP)アラジンC101487
透析膜スペクトル標準RCチューブMWCO:12-14 kD
E.Z.N.A.サイクルピュアキットオメガバイオテックD6492-01
電気加熱常温耕運機Yiheng機器DHP-9602
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)バイオシャープ
蛍光板リーダーBioTekSynergy 2
フッ素化油蘇州 CChip 科学機器2%HFE7500
フォリン酸Sigma-Aldrich47612
フレンチプレスG.HeinemannHTU-DIGI-Press
グルコースSigma-AldrichG7021
グルタマットSigma-AldrichG5667
グルタミンSigma-AldrichG5792
グリセロールSigma-AldrichG5516
グリシンSigma-AldrichG7126
グアノシン 5'-三リン酸ナトリウム塩水和物(GTP)ロシュ10106399001
HEPESSigma-AldrichH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
ヒスチジンSigma-AldrichH6034
イソロイシンSigma-AldrichI5281
イソプロピル-&β;-D-チオガラクトピラノシド (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinSigma-AldrichL6914
LysinSigma-AldrichL5501
酢酸マグネシウム四水和物 (Mg(OAc)2 )Sigma-AldrichM5661
塩化マグネシウム(MgCl2)Sigma-AldrichM2670
メチオニンSigma-AldrichM8439
微量遠心分離機Eppendorf5424 R
鉱物油Sigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
Multipurpose CentrifugeEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
核酸 &タンパク質UVアッセイ測定IMPLENNanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96ウェルポリスチレンプレートSigma-AldrichP8616
PCR Thermal CyclerEppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
フェニルラニンSigma-AldrichP8740
ホスホエノールピルバット (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFSigma-AldrichPMSF-RO
ポリエチレングリコール 8000 (PEG 8000)Sigma-Aldrich89510
酢酸カリウム (KOAc)Sigma-AldrichP5708
塩化カリウム (KCl)Sigma-AldrichP9541
グルタミン酸カリウム(K-グルタミン酸)Sigma-AldrichG1501
水酸化カリウム(KOH)Sigma-Aldrich221473
ProlinSigma-AldrichP8865
ピルビン酸キナーゼ(PK)Sigma-AldrichP9136
SerinSigma-AldrichS4311
シェーカーZhichushakersZQZY-AF8
塩化ナトリウム(NaCl)Sigma-AldrichS5886
水酸化ナトリウム(NaOH)Sigma-AldrichS5881
ショ糖アラジンS112226
硫酸Sigma-Aldrich339741
シリンジフィルターJinteng0.45 μm
試験管Shuniu20 mL
TGX FastCast アクリルアミドキット, 12%Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
ThreoninSigma-AldrichT8441
Tris baseSigma-AldrichV900483
tRNARoche10109550001
トリプトンSigma-AldrichT7293
トリプトファンSigma-AldrichT8941
チロシンSigma-AldrichT8566
UTP 三ナトリウム塩 (UTP)アラジン U100365
循環水システム付き真空ポンプ鄭州 万里の長城 科学 産業および貿易 Co.LtdSHB-figure-materials-1
ValinSigma-AldrichV4638
Vortex MixersKylin-BellVortex QL-861
浄水システムMerckMillipore直接超純水(タイプ1)
酵母エキスSigma-Aldrich70161
&β;-メルカプトエタノールSigma-Aldrich444203
1100027

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