若年脳嗅覚神経細胞シナプス結合性の経験依存的リモデリング

サマリー

ここでは、 ショウジョウバエ の幼若脳における触角葉シナプス糸球体の嗅覚経験依存的なリモデリングを誘導し、解析する方法について述べる。

要約

幼少期の嗅覚体験は、 ショウジョウバエ の幼若脳に劇的なシナプス糸球体リモデリングを誘発しますが、これは経験的に用量依存的で、時間的に制限され、短く明確に定義された臨界期にのみ一時的に可逆的です。脳回路シナプス接続リモデリングの方向性は、嗅覚ニューロンの応答性受容体クラスに作用する特定の匂い物質によって決定されます。一般に、各ニューロンクラスは単一の匂い受容体のみを発現し、単一の嗅覚シナプス糸球体を神経支配します。 ショウジョウバエ の遺伝子モデルでは、嗅覚糸球体の全配列が、匂い物質の応答性と行動出力によって正確にマッピングされています。酪酸エチル(EB)臭気剤は、VM7糸球体を神経支配するOr42a受容体ニューロンを活性化します。幼少期の重要な時期には、EBの経験はOr42a嗅覚ニューロンの用量依存的なシナプス除去を促進します。投与されたEB臭気物質曝露の期間を計ると、若年脳における経験依存的な回路接続性の剪定の調査が可能になります。触角葉シナプス糸球体の共焦点顕微鏡イメージングは、シナプス数と神経支配体積の定量化を提供するOr42a受容体駆動型トランスジェニックマーカーを使用して行われます。洗練された ショウジョウバエ の遺伝子ツールキットは、脳回路のリモデリングを媒介する細胞および分子メカニズムの体系的な解剖を可能にします。

概要

幼少期の幼若脳回路のリモデリングは、動物が生まれる高度に変化し、予測不可能な環境に合わせて大規模なシナプス結合性を変更する最後のチャンスです。昆虫は、最も豊富な動物群として、この進化的に保存された基本的な臨界期のリモデリングメカニズムを共有しています¹。臨界期は、感覚入力の開始とともに開き、接続性を最適化するために可逆的な回路変化を示し、安定化力がさらなる改造に抵抗すると閉じます²。昆虫は特に嗅覚情報に依存しており、明確に定義された嗅覚臨界期を示します。ショウジョウバエは、若年期の脳におけるこの経験依存性の臨界期を調査するための優れた遺伝モデルを提供します。脱皮後の最初の数日間の匂い物質の経験は、個々に同定されたシナプス糸球体^3,4の顕著な回路接続性の変化を引き起こします。リモデリングの方向は、特定の入力臭気体験によって異なります。一部の匂い物質は、閉塞後数日間(dpe⁾3,5,6,7のシナプス糸球体の体積の増加を引き起こしますが、他の匂い物質は、0-2 dpeの臨界期にシナプスの急速な排泄を引き起こし、神経支配の体積の減少をもたらします^8,9,10.具体的には、酪酸エチル(EB)の匂い体験は、この初期の重要な時期にのみ、Or42a嗅覚受容体ニューロンの用量依存的なシナプス刈り込みを促進します⁸。シナプスの除去は、臨界期内にEB臭物質の入力を調節することにより完全に可逆的ですが、臨界期の終了後に永続的になります。この嗅覚経験依存的なシナプス刈り込みは、若年脳回路リモデリングの根底にある時間制限メカニズムを解明するための貴重な実験システムを提供します。

ここでは、初期の臨界期にOr42a受容体嗅覚ニューロンのEB経験依存性シナプス刈り込みを誘導および分析するために使用される詳細なプロトコルを紹介します。我々は、触角葉VM7糸球体におけるOr42aシナプス終末が、膜つながれたmCD8::GFPマーカーをトランスジェネニック的に駆動することによって特異的に標識できることを示し、これは、Or42aプロモーター(Or42a-mCD8::GFP)¹¹に直接融合するか、またはGal4/UASバイナリ発現システム(Or42a-Gal4 driving UAS-mCD8::GFP)¹²を使用する。個々のOr42aニューロンシナプスは、蛍光タグの配列に融合したシナプス前活性ゾーンマーカーの標的トランスジェニック発現(例えば、Bruchpilot::RFP)⁸または超微細構造シナプス解析のための電子密度シグナル(例えば、miniSOG-mCherry)⁸を用いて、同様に標識することができる。Or42aシナプス終末は、レーザー走査型共焦点顕微鏡と透過型電子顕微鏡を組み合わせてイメージングできます。Or42aシナプス糸球体の剪定はEBの用量依存的であり、時限臭気体験の濃度にスケーリングすることを示しています。ビヒクルとして使用される鉱物油に溶解するEB臭気物質の割合は、発生段階の動物における臭気物質曝露の時間時間と同様に、さまざまです。最後に、VM7神経支配蛍光の強度と体積を測定することにより、シナプス糸球体の剪定の程度を分析するために使用される方法を示します。シナプス数は、標識されたシナプス点をカウントし、透過型電子顕微鏡⁸を用いてシナプス超微細構造パラメータを測定することによっても定量化することができる。全体として、ここに示すプロトコルは、若年臨界期にショウジョウバエの嗅覚回路シナプス接続の剪定を媒介する細胞および分子メカニズムの両方の体系的な解剖を可能にする強力なアプローチです。この研究で説明した一般的な臭気曝露の設定は、他の臭気を使用した以前の研究で利用され、他の糸球体^3,7を分析しました。

プロトコル

1.臭気物質への曝露

1. 細い絵筆を使用して、40〜50匹の発達段階の動物をファレートダークサペ(25°Cでの蛹化後90 + h)として、標準的なコーンミール糖蜜食品を含む25 mm x 95 mmのポリスチレン ショウジョ ウバエバイアルに選別します(図1A)。
2. ショウジョウバエのバイアルの端に細かいステンレス鋼の金網を置き、ハエを封じ込めると同時に、良好な空気の流れを確保します。ワイヤーメッシュキャップをテープで留めた透明フィルムでショウジョウバエのバイアルの側面に固定します。
3. 1.5 mLの微量遠心チューブに、1 mLの100%鉱油を入れるか(ビヒクルコントロール)、または別のチューブで鉱油中の酪酸エチル(EB)臭気物質を溶解して、所望の濃度(例:15%(150 μL)または25%(250 μL))を生成します。
4. 車両制御チューブまたは微量遠心チューブを直立させて、密閉可能な3700 mLグラスロック容器に入れます。テープを使用して、 チューブをショウジョウバエ のバイアルと一緒に臭気チャンバーの中央にしっかりと固定します(図1B)。
5. ステージングされた ショウジョウバエ の蛹バイアルを含む密封された車両制御チャンバーとEB臭気チャンバーを、加湿された(70%)温度制御された(25°C)インキュベーターに12時間/ 12時間の明暗サイクルに置きます。.
6. 臭気剤チャンバーへの曝露の4時間後に新たに閉じたハエを取り出し、20〜25匹のハエを新しくした臭気剤のあるチャンバー内の新鮮な ショウジョウバエ バイアルに迅速に移します(図1A、B)。閉じていない蛹を捨てます。
7. ハエをインキュベーター内の密閉された臭気チャンバーに合計24時間保管します。より長い臭気物質の投与のために、24時間ごとに新しく作られた臭気チャンバー内の新しい ショウジョウバエ バイアルにハエを迅速に移します。
8. 発生段階にあるハエを70%エタノールの皿に1分間浸して麻酔をかけ、即時の脳解剖および免疫細胞化学処理に備えます。

2. 脳の解剖

1. バイアルにビヒクルコントロール(100%鉱油のみ)またはEB曝露(%EB)のラベルを付けてマークし、脳の解剖とその後の処理の全期間にわたってこれらの指定を維持します。各遺伝子型/臭気条件に対して10〜20匹の動物を処理します。
2. 鉗子を使用して、麻酔をかけた1匹のハエを、作りたてのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)¹³の小さな皿に移します。フライをPBSに浸し、フライを完全に沈めた状態で完全な脳の解剖を続けます。
3. 両手に細かい(#5)鋭利な鉗子を持ち、フライの腹側を上にして置き、一方の鉗子で上部胸部をつかみ、もう一方の鉗子で頭を吻の下につかみます。脳に侵入しないように注意してください。
4. 両手で反対方向にそっと引っ張って、頭を体の他の部分から取り外します。頭は胸部から簡単に外れるはずです。分離されたヘッドを解剖のために残します(図1C)。
5. 以前に胸部をつかむために使用した鉗子を、吻の反対側の下にスライドさせます。外骨格のキューティクルを反対方向にそっと引っ張り始め、目の間で引き裂かれて脳が現れます。
6. 引っ張ると、脳の視葉が外骨格とともに分離することがあります。これを防ぐには、外骨格のキューティクルを取り外す際に、2つの鉗子でゆっくりと着実に引っ張ります(図1C、中央)。
7. 頭から外骨格キューティクルを引き続き取り外します。外骨格のすべての部分が取り外されていることを確認します。脂肪体や突出している気管など、脳に付着している組織をすべて取り除きます。
8. 固着を防ぐため、P20ピペットチップをPBS + 0.2% Triton-X 100(PBST)ですすいでください。解剖直後に、キャップ付きチューブ内の固定溶液(4%パラホルムアルデヒド(PFA)+ 4%スクロース)に脳を移します(図1C、D)。

3. 脳免疫細胞化学

1. 脳を室温(RT)で30分間固定し、エンドオーバーエンド回転させます。脳をチューブに入れたまま、ピペットで取り外し、危険な固定剤を適切に廃棄してください。固定脳をPBSで3回すばやく洗浄します(図1D)。
2. 脳は、回転後にチューブのキャップに詰まっていることがよくあります。すべての移送で常に危険である脳の偶発的な損失を防ぐために、液体をピペッティングする際に解剖顕微鏡を使用してください。
3. 抗体標識の準備として、PBST + 1%ウシ血清アルブミン(BSA)+ 0.5%正常ヤギ血清(NGS)でRTで固定脳を1時間ブロックし、端から端まで一定の回転を行います(図1D)。
4. ブロックを取り外し、選択した一次抗体をPBST + 0.2% BSA + 0.1% NGSで適切に希釈して脳をインキュベートします。脳を一晩(14-16時間)4°Cで一定回転させてインキュベートします。
   注:使用した抗体の例:ラット抗CadN(希釈1:50)¹⁴ でシナプス糸球体を標識し、ニワトリ抗GFP(1:1000)⁸ でOr42a-mCD8::GFPを標識(図1D)します。
5. 一次抗体をピペットで取り出します。PBSTで脳を3回、20分間それぞれ洗浄します。PBSTで0.2% BSA + 0.1% NGSで希釈した二次抗体で脳を2時間、室温で一定回転させてインキュベートします。
   注:あるいは、脳を4°Cで一晩(14〜16時間)インキュベートします。 PBSTで抗体を0.2%BSA + 0.1%NGSで希釈します。ここで使用した二次抗体:488種類のヤギ抗ニワトリ抗体(1:250)および546種類のヤギ抗ラット抗体(1:250)。
6. 二次抗体をピペットで取り出します。PBSTで脳を3回、20分間それぞれ洗浄します。最後に、PBSで脳を20分間洗浄します(図1D)。
7. ガラス顕微鏡スライド(75 mm x 25 mm)を準備するには、両面粘着テープの薄いストリップを2枚~25 mm離してスライドに追加します。これにより、脳が押しつぶされないようにするためのスペーサーが提供されます。
8. 脳をマウントするための2つのテープストリップの間に10~15μLの封入剤をピペットで固定します。P20ピペットチップをPBSTで事前にすすぎた状態で、標識した脳を顕微鏡スライドに移します(図1E)。
9. 脳が移されたら、細い絵筆を使用して脳を整列させ、触角葉が上を向いていることを確認します。触角ローブを含むアーチ型のこぶがある側を探します。
10. 脳の向きが適切になったら、ガラスのカバースリップ(No.1.5H)で覆い、カバースリップがテープに固定されていることを確認します。次に、カバーガラスの側面に追加の封入剤を充填します(図1E)。
11. カバーガラスの端を透明なマニキュアで密封します。スライドを完全に乾かしてから、後でイメージングするために冷蔵庫に保管します。

4. 共焦点イメージング

1. イメージングの前に、すべての脳スライドを遺伝子型と経験条件の両方に盲検化し、後でデコードするためにスライドにコード化されたラベルをマークします。
2. 63倍の油浸対物レンズを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用します。ここに示されているすべての画像でZeiss 510 META顕微鏡を使用しています(図1F)。
3. 使用する蛍光色素に適したレーザーラインを使用してください。ここでは、触角葉シナプス糸球体とOr42a嗅覚ニューロンイメージングにArgon 488およびHeNe 543レーザーを使用します(図2)。
4. 両方のチャンネルの最適なゲインとオフセットを決定し、理想的には両方のチャンネルのゲインを750<750とオフセット≈0に保ちます。これは、バックグラウンドを制限しながら、信号対雑音比を最適にするために行われます。
5. イメージングを脳の中心に配置します。イメージングすると、VM7糸球体は、解剖中に食道を切除した後、脳の中央に残された穴に近接して存在します(図2A)。
   注:VM7糸球体は常に食道の開口部の近くにあります。ただし、正確な位置とサイズは、脳の解剖と取り付けの違いによってわずかに異なるため、イメージング時にはこの点を考慮に入れてください。
6. イメージング解像度と光学スライスの厚さを選択します。ここでは、1024 x 1024の解像度で、Zスタックスライスの厚さが0.37μmのものが使用されます。
7. 触角ローブを通して共焦点Zスタック投影全体を取り、VM7糸球体のOr42aニューロン神経支配全体を確実に捕捉します。

5. シナプス測定

1. 遺伝子型/条件盲検画像をフィジー(1.54f)にロードします。[ Image (画像)] > [Color (カラー)] > [Split Channels (分割チャネル)] をクリックして、レーザーラインチャネルを分割します。
2. Or42a嗅覚チャネルでは、Zスタック全体をスクロールしてOr42a神経支配を含むスライスを特定し、蛍光の開始位置と終了位置を特定します。
3. Or42a ニューロン神経支配を含むスライスのみを含む合計スライス投影を作成するには 、[Image > Stacks] > [Z Project] >の [Sum Slices] をクリックし、 目的の範囲を入力します。
4. フィジーでは、トップバーの Lasso(なげなわ )ツールをクリックして、VM7糸球体のOr42aニューロン神経支配の輪郭をトレースし、各脳側糸球体を独立して治療します(図3)。
5. 円周にZスタックスライスの数と各スライスの厚さを掛けて、VM7シナプス糸球体神経支配ボリュームを求めます。シナプス数を定量化するために、find maxima ツールを find maxima stacks マクロと共に使用して、アウトライン化された領域 ^8,15 のシナプス プンクタをカウントできます。

結果

図1 は、嗅覚経験依存性の臨界期匂い物質曝露と脳イメージング法のワークフローを示しています。このプロトコールは、脱皮直前のファレートダークサナギの年齢マッチングから始まります(図1A)。蛹を4時間匂いチャンバーに入れ、次に新たに閉じた成体をビヒクルコントロールまたは投与されたEB臭気チャンバーのいずれかで新鮮なバイアルに入れます(図1B)。通常、臭気物質に24時間さらしますが、任意の期間も可能です。匂い物質への曝露後、脳の解剖は、胸部から頭部を切除し、次に細い鉗子でキューティクル外骨格を切除することから始まります(図1C)。分離された脳は、イメージングを妨げる可能性のある関連組織をすべて取り除き、すぐにPBSの4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースに固定します。脳組織の良好な完全性のためには、30分の短い固定で十分です。免疫細胞化学プロトコールは、1時間のブロック(BSA、NGSなど)から始まり、一次抗体(抗GFP、-CadNなど)で一晩インキュベートし、その後、二次抗体で2時間の短時間のインキュベーションを行います(図1D)。標識された脳は、触角葉の最適なイメージングのために、脳の背側表面を上にして、密封されたカバーガラスの下のスライドガラスに取り付けられます(図1E)。すべてのサンプルは、後でデコードするためにスライドにコード化された指定をマークすることにより、遺伝子型と経験条件の両方を知らされていないことに注意してください。63倍の油浸対物レンズを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して、脳の中枢触角葉を画像化します(図1F)。使用する蛍光色素に最適なレーザーライン(Argon 488やHeNe 543など)を選択し、周囲の糸球体のコンテキストでVM7のOr42a嗅覚ニューロン神経支配を画像化します。

VM7糸球体におけるOr42aニューロン神経支配のZスタック投影全体を捉えるためには、最適なゲイン、オフセット、イメージング解像度、光学スライスの厚さを選択することが重要です。比較するすべての遺伝子型と経験条件は、同じ顕微鏡設定で画像化されます。ZスタックはImageJソフトウェアを使用して処理され、主に神経支配ボリューム^7,14によって評価される経験依存の変化があります。体積計測値を計算するには、2つの方法があります。1つは、ImageJのなげなわ関数を使用してスライスごとに神経支配領域を計算し、次に各値に各スライスの厚さ(μm)^8,9を掛けます。もう 1 つは、合計スライス Z 投影を使用し、Z スタック スライスの数にスライスの厚さを掛けて平均ボリュームを決定します。どちらの方法でも一貫した結果が得られます。体積測定に加えて、VM7糸球体¹⁶の最大強度投影により蛍光強度も評価できます。すべてのピクセルの加重合計は、ImageJ 合計スライス最大投影によって評価され、各強度レベルのピクセル番号を合計して全体の強度 ^8,9 を計算します。背景は、同じサイズの糸球体外領域を定量化することで差し引くことができます。この減算法は、各脳サンプルのさまざまなレベルのバックグラウンド抗体標識を考慮し、神経支配蛍光強度値のより代表的な定量を生成するため、より時間がかかりますが、より正確です。強度測定は、Zスタック内の18〜30個の光学スライス(0.37μm/スライス)の一般的な範囲で行われ、各脳¹⁶について平均化される。ほぼすべての場合において、神経支配蛍光強度と体積の測定により、一貫した結果が得られます。

すべての測定方法において、代表的な結果は揺るぎないままです。初期のEB臭気物質の経験は、Or42aニューロン神経支配の大幅な喪失をもたらします。VM7糸球体は、正確にマッピングされた他の触角葉嗅覚糸球体(図2A)の中でサイズ、形状、位置によって、また、抗神経カドヘリン(CadN;図 2B)。臭気物質のビヒクル制御(鉱油)に時間ばく露すると、未治療の正常な動物と区別がつかないほどのOr42aニューロン神経支配が起こります。それでも、脱落後最初の数日間のEB臭物質の経験(dpe)は、シナプス糸球体の剪定を引き起こします(図2C)。この剪定メカニズムは、短い初期の^{重要な時期8,10}に完全に限定されています。現在、私たちは通常、24時間の匂い物質曝露を使用して、VM7糸球体のシナプス剪定と、その結果としてのショウジョウバエの幼若脳の神経支配量の減少を評価しています。臭気ビヒクル制御(鉱油)への24時間の曝露(0-1 dpe)は、両脳半球触角ローブ(図2D

ディスカッション

ここで紹介する匂い物質曝露と脳イメージングプロトコルは、幼少期の重要な時期に経験に依存する嗅覚ニューロンのシナプス糸球体の剪定を確実に誘導し、定量化するために使用できます。この治療パラダイムを利用して嗅覚回路のリモデリングを探求する以前の研究では、排泄^3,4,5の2^日目に臭気物質への曝露が開始されました。対照的に、成虫の脱皮前にファレートの蛹で臭気物質への曝露を開始し、リモデリングの大部分が脱落後最初の24時間以内に起こることを発見しました^8,9。したがって、この臭気物質曝露プロトコルの重要なステップは、脱皮前に段階的な暗い蛹を臭気室に入れることです(図1)。これは、蛹の臭気物質への曝露自体のためではなく、成虫の脱皮直後に臭気物質への曝露を確保するためのものです。私たちは、狭い時間的ウィンドウ内で年齢を同期させ、匂い物質の曝露時間の違いを避けるために、ステージングの4時間後に閉鎖された幼若の成人を選択しました。この初期の経験間隔は、EBの嗅覚馴染みが排泄後わずか2日で閉じることを示す最近の研究と一致しています¹⁰。しかし、臨界期(0-1日と1-2日など)における臭気物質曝露タイミングの違いの結果は、十分に特徴付けられていません。Or42a嗅覚ニューロンは、触角葉のVM7糸球体を選択的に神経支配し、これは正確な糸球体マップと標的神経支配標識に基づいて容易に識別されます(例:Or42a-mCD8::GFP;図 2)。臨界期のEB臭気物質曝露は、Or42aプロモーターの発現またはレポーターレベルを変化させません⁸。時限臭気物質への曝露は、Or42a受容体ニューロンからの連続的なシナプス除去と軸索神経支配の喪失を引き起こします。この剪定は、幼少期の臨界期(0-2 dpe)内では完全に可逆的ですが、匂い物質環境の変化が神経支配を変えなくなる成人の成熟度(7-9 dpe)では可逆的ではありません。この感覚体験依存的なメカニズムの厳密な時間的制限は、この分野での主要な未解決の問題です。成熟時に臨界期のような可塑性を再開するために多くの試みがなされています。ここで示すプロトコルは、調査のための強力な手段です。

ここで説明する臭気物質曝露と脳イメージングプロトコルの容易さにより、幅広いアクセシビリティと幅広い適応性が可能になります。臭気物質への曝露体験の開始、終了、および期間はすべて研究者の裁量に完全に委ねられており、臨界期の特性、リモデリングの可逆性、および臨界期のような可塑性の再開に関する的を絞った研究を可能にします。同様に、匂い体験の強さは、用量依存的なシナプス糸球体の剪定の研究のために簡単に操作できます(図3)。重要なことは、低EB濃度(例:15%EB)を使用する研究を使用して、シナプス糸球体リモデリングの速度または程度を高める可能性のある操作をテストできることです。例えば、結果は、低EBレベル(例えば、15%)でのシナプス刈り込みが、高EBレベル(例えば、25%)と区別がつかないことを示すことができる。さまざまな操作で、匂い物質のビヒクル制御の一貫した神経支配と、25% EB で発生する強力なシナプス糸球体の剪定と比較できます (図 3)。この方法の1つの制限は、臭気物質の曝露が溶解した臭気物質の揮発性に完全に依存していることです。温度や相対湿度などの変動要因は、臭気物質への曝露効果に影響を与えます⁸。また、臭気チャンバー内のハエの密度は、例えば、ハエ由来の臭気物質の生成を通じて、臭気物質の曝露に影響を与える可能性があります。バイアルあたり20〜25匹以下の密度が推奨されます。非常に強力なシナプス糸球体の剪定を誘発するために必要な匂い物質濃度は、自然界で一般的に経験されるものよりも高い可能性が高い^10,17。低匂い物質濃度でのシナプス除去をアッセイするには、はるかに高解像度のイメージング技術が必要になります。しかし、現在のプロトコルでは、さまざまな操作について一貫性のある信頼性の高い研究が可能です。

この臭気物質への曝露と脳イメージングプロトコルには計り知れない利点があります。ショウジョウバエは、広範で洗練された遺伝子ツールキットに基づく非常に有利な動物モデルであり、臨界期の嗅覚回路リモデリングにおける遺伝子と環境の相互作用の広範な研究に体系的に活用できます。ここに示す例には、Or42a-Gal4トランスジェニックドライバーライン、UAS-mCD8::GFPメンブレンマーカー、およびOr42a-mCD8::GFP直接融合が含まれます。Or42a直接融合によるシナプス糸球体の剪定とGal4/UAS間接^{標識アプローチと}の間には、区別できる違いはありません^8,9。Or42a-Gal4ドライバーは、標的となる嗅覚受容体ニューロンを操作し、VM7神経支配の経験依存性変化を視覚化する能力を提供します。一方、ダイレクトフュージョンラインは、バイナリUAS-Gal4トランスジェニックシステムを他の細胞標的操作に解放します。広範なショウジョウバエツールキットからの他の多くの変異株およびトランスジェニック系統は、シナプス刈り込みを媒介する細胞の同定、嗅覚経験情報を中継する細胞間シグナル伝達経路、標的シナプス除去に必要な細胞内機構の同定など、時間制限および経験依存性のメカニズムをテストするために使用できます。全体として、このプロトコルは、嗅覚経験依存の脳回路リモデリングを推進する多くのメカニズムの体系的な調査を可能にします。この匂い物質曝露および脳イメージングプロトコルは、重要な生理特異的な嗅覚体験の行動変化、成熟時の臨界期様可塑性の再開を可能にする可能性のある遺伝的および薬物的操作、およびシナプス糸球体の剪定を超えた嗅覚回路可塑性の他の側面を調査するためにも使用できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
臭気曝露用
ショウジョウバエバイアル	ジェネシーサイエンティフィック	32-110
酪酸エ	チル Sigma Aldrich	E15701
微量遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	05-408-129
鉱物油	シグマ アルドリッチ	M3516
臭気室	グラスロック
ペイント ブラシ	ウィンザー &ニュートン	シリーズ233
パラフィルム	サーモフィ	ッシャーS37440
金網	Scienceware378460000
脳解剖
エタノール、190プルーフ	デコンラボ	280170	%に希釈
鉗子	ファインサイエンスツール	11251-30	デュモン#5
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡科学	157-8	4%
シャーレ	フィッシャーサイエンティフィック	08-757-100B
リン酸緩衝生理食塩水	サーモフィッシャーサイエンティフィック	70011-044	1x
スクロー	ッシャーサイエンティフィックに希釈	BP220-1
シルガード	電子顕微鏡 Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 ヤギ抗ニワトリ	Invitrogen	A11039
546 ヤギ抗ラット	Invitrogen	A11081
ウシ血清アルブミン	シグマ アルドリッチ	A9647
チキン アンチ GFP	アブカム	13970
カバースリップ	アバンター	48366-067	25 x 25 mm
両面テープ	スコッチ	34-8724-5228-8
フルオロマウント-G	電子顕微鏡科学	17984-25
顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-544-2	75 x 25 mm
マニキュア	サリー・ハンセン	109	エクストリームウェア、目に見えない
正常なヤギ血清	シグマ・アルドリッチ	G9023
ラット抗CadN	発達研究 ハイブリドーマバンク	AB_528121
共焦点/分析
任意のコンピューター/ラップトップ
共焦点顕微鏡	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
フィジーソフトウェア	フィジー		バージョン2.14.0 / 1.54f