方法論記事

マウスにおける多嚢胞性卵巣症候群の誘導のための改良技術

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DOI:

10.3791/66637

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2024年7月5日

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1Obstetrics and Gynecology Hospital, Institute of Reproduction and Development, Fudan University, 2Women's Hospital, Key Laboratory of Reproductive Genetics (Ministry of Education), Zhejiang University School of Medicine, 3International Institutes of Medicine, the Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 4Research Units of Embryo Original Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences (No. 2019RU056), 5State Key Laboratory of Cardiology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、ミニポンプを使用して制御されたレトロゾール放出を通じて、マウスに多嚢胞性卵巣症候群 (PCOS) モデルを誘導する技術を紹介します。十分な麻酔下でミニポンプを皮下に移植し、ミニポンプを一定時間放出した後、マウスにPCOSを成功裏に誘導しました。

要約

多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)は、女性の不妊症の主な原因の1つです。動物モデルは、PCOSの病因メカニズムの研究や関連する医薬品開発に広く使用されています。レトロゾール誘導マウスモデルは、PCOS患者の代謝および生殖表現型を再現します。PCOSマウスにおけるレトロゾール治療の従来の方法は、一定期間にわたって毎日投与する必要があり、これは労働集約的であり、マウスに大きなストレスを引き起こす可能性があります。この研究では、制御されたレトロゾール放出ミニポンプを埋め込むことにより、マウスにPCOSを誘導するための簡単で効果的な方法について説明します。定量的な量のレトロゾールを安定して連続的に放出できるミニポンプを作製し、麻酔下マウスに皮下移植しました。この研究では、マウスモデルがレトロゾールミニポンプ移植後のPCOSの特徴をうまく模倣したことが示されました。この研究で使用された材料と機器は、ほとんどのラボですぐに入手でき、特別なカスタマイズは必要ありません。まとめて、この記事では、マウスでPCOSを誘導するためのユニークで実行しやすい方法を提供します。

概要

多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)は、生殖年齢1の女性に最も一般的な疾患の1つです。これは、世界の女性の最大18%が罹患しており、世界中の女性の不妊の主な原因です2,3。PCOSは、ゴナドトロピン分泌障害、慢性無排卵、アンドロゲン産生の増加、多嚢胞性卵巣形態など、相互に関連する一連の生殖異常を特徴としています4。婦人科疾患に加えて、PCOSは心血管疾患のリスクも増加させます5,6。何十年にもわたる研究にもかかわらず、PCOSの病因は不明のままです7,8。

PCOSの病因についてより深い洞察を得て、新しい治療法を開発するためには、人間の生理学を厳密に模倣した動物モデルを作成することが非常に重要です9。現在報告されているPCOSのげっ歯類モデルには、テストステロン、レトロゾール、吉草酸エストラジオールなどの治療によって誘発されるモデルが含まれます。テストステロンは高アンドロゲン血症を誘発し、ラットのPCOS誘導剤としてより一般的に使用されています10。DHEAは、げっ歯類のPCOSを誘発するために使用され、テストステロンレベル、LH / FSH(黄体形成ホルモン/卵胞刺激ホルモン)比を増加させ、不規則な発情周期を引き起こします11。エストラジオール吉草酸エストーゲン(EV)は長時間作用型エストロゲンであり、この方法を使用した研究では、性ステロイドホルモンと性腺刺激ホルモンのレベルが投与されたEVの用量によって異なることが示されています12,13,14。レトロゾールは非ステロイド性アロマターゼ阻害剤です15。レトロゾール治療は、非周期的な発情を誘発し、卵巣の重量、体重を増加させ、脂肪細胞を拡大し、卵胞の発達を最大化し、ラットのテストステロンレベルを上昇させます16,17。レトロゾールで治療したマウスは、副鼻腔卵胞と出血性嚢胞の数が増加し、LH、FSH、エストラジオール、およびプロゲステロンの濃度が上昇します18,19。

現在、レトロゾール誘発性PCOSモデリングの主な方法は、経口投与と皮下注射を含み、どちらも毎日繰り返し投与する必要があります20,21,22。これらの方法は時間と労力を要し、反復投与は動物に大きなストレスを与える可能性が高い23。一部の研究ではレトロゾールペレット24,25を使用していますが、これらの製品はカスタマイズする必要があり、高価です。本報告では、ミニポンプを用いてマウスにPCOSを誘導する技術について述べる。この方法はシンプルで時間を節約し、ほとんどの検査室ですぐに入手できる手術器具や機器を使用します。

プロトコル

この研究のすべての動物実験プロトコルは、復旦大学の動物倫理委員会によって承認されました。ここでは、4週齢の雌C57BL/6Jマウスを使用しました。この研究で使用された動物、試薬、および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.ミニポンプの準備

  1. 元の包装ボトルに保存されたレトロゾール粉末(50 mg)を取り、ボトル内のレトロゾール粉末を300 x g で5秒間(室温)遠心分離し、キャップを開けます。.
  2. レトロゾール粉末に625μLのDMSOをピペットでゆっくりと加え、よく混合して8 mg/100 μL、合計625 μLの濃度のストック溶液を得ます。
    注:異なるパッケージサイズのレトロゾール粉末を使用する場合は、ストックソリューションを構成するために事前にDMSOの必要量を計算してください。レトロゾール粉末、DMSO、およびその他の関連化合物は、滅菌グレードでなければなりません。ピペットの先端、チューブ、およびその他の関連アイテムは、使用前に滅菌または滅菌する必要があります。
  3. 実験計画に従って必要なマウスの数を数えます。
  4. 必要なマウスの数に応じて、必要なレトロゾール原液の総量をピペットで汲み上げ、ゆっくりと遠心チューブに注入します。
    注:8週間の曝露のための4週齢マウスは、PCOSマウスモデルを誘導するために選択されました。レトロゾールの総用量はマウス1匹につき8mgであり、これには2つの連続したポンプを移植する必要があります(1つのポンプは4週間放出されます)、つまり、ポンプごとに4mg / 4週間です。.ステップ1.2で述べたように、レトロゾール原液の濃度は8 mg/100 μLです。ポンプを調製するには、以下の計算で各ポンプに50 μLのストック溶液が必要です:合計4 mgのレトロゾールを8 mg / 100 μLで割った値。
  5. 等量のPEG300を吸い上げ、レトロゾール溶液に加え、よく混ぜます(適切にボルテックスできます)。
  6. 対照群用の制御ビヒクル溶液を調製します(レトロゾールを含まない各ポンプに対して50μLのDMSO+50μLのPEG300)。
  7. 必要なポンプの数に応じて、適切な数の滅菌遠心分離チューブを準備します。各ポンプに15 mLの遠心分離チューブを1本用意する必要があります。
  8. シリンジで生理食塩水を抜き、各遠心チューブに5mLの生理食塩水を加えます。次に、遠心分離チューブにキャップをして、さらに使用するためにチューブラックに置きます。
  9. 新しい滅菌手袋を着用し、ミニポンプを希望の量だけ取り出し、清潔で滅菌済みのカウンタートップまたは容器に置きます。
  10. ポンプ本体に合うキャップを親指と人差し指でそっとつまみ、もう一方の手でポンプ本体を持ちます。
  11. 細いチューブをキャップに取り付けた状態で、ポンプの充填ポートをゆっくりと数回突きます(図1B)。
    注:目詰まりが解消されていないと、充填後に液体がチューブ内を自由に流れない場合があります。
  12. ポンプと一致する針と1mLの滅菌シリンジを取ります。針をシリンジに取り付けてしっかりとします(図1C)。
  13. 上記で設定したレトロゾールの最終溶液を、新しく組み立てたシリンジで慎重にゆっくりと引き上げます(図1D)。
    注:レトロゾール溶液の吸引は、ゆっくりと均一に行う必要があります。.急速な吸引は気泡を発生させることがあり、その後の薬液注入に影響を与える可能性があります。
  14. レトロゾール溶液をミニポンプに注入します。
    1. ミニポンプを片手で慎重につまんで直立させ、もう一方の手で前述の1mLシリンジを持ってポンプの一番下にゆっくりと挿入します(図1E)。
      注:針がポンプの底に挿入されていない場合、ポンプ内の液体は注射中に簡単に泡立ち、ポンプのその後の薬物の放出に影響を与えます。
    2. 次に、構成された溶液をゆっくりと注入します。ポンプの開口部がわずかに泡立つと、注入に気付くことができます。
    3. 注入量が90μLに近づいたら、よりゆっくりと注入します。ポンプが完全に満たされたら(約100μL)、シリンジを引き出します。
    4. キャップをポンプ本体に慎重に挿入し、しっかりと締めます。このとき、少量の溶液がこぼれ落ちます。丁寧に拭き取ります。
  15. 薬物を装填したポンプを、出口を上に向けて(キャップのある端)、前に準備した遠心分離チューブを取り、ポンプを滅菌生理食塩水に完全に浸します(図1F)。次に、遠心分離チューブにキャップをして、チューブラックに置きます。
    注意: プロセス全体でポンプが汚染されないように注意してください。
  16. すべてのミニポンプが完成したら、すべての遠心分離管を37°Cのサーモスタットに48時間入れます。

2.手術と麻酔の準備

  1. 手術当日には、鉗子、止血器、手術用ハサミ、ニードルホルダー、4-0吸収性外科用縫合糸など、必要なすべての器具を準備し、滅菌してください。
  2. イソフルラン麻酔器(図2B)を使用する前に、パイプラインの接続が正しいかどうかを注意深く確認し、パイプラインが無傷で漏れていないことを確認してください。
  3. 麻酔器の蒸発器にある充填シーリングキャップを緩め、麻酔薬をゆっくりと追加します。
  4. 麻酔器にラベル付けされた上限と下限の間の麻酔レベルを保ちます。
  5. 三方弁スイッチを変換して、麻酔器の蒸発器からの空気の流れが麻酔誘導ボックスに接続されていることを確認します。
  6. エアポンプとエバポレーターを開き、麻酔導入用のイソフルランの濃度を調整します(通常は3%〜4%)。
  7. 麻酔薬が誘導ボックスを満たすまで約1分間待ってから、マウスを誘導ボックスに入れて、完全な麻酔まで待ちます(このプロセスには約2〜3分かかります)。
  8. マウスが十分に麻酔されていることを確認して、ボックスをそっと傾けます。.マウスをひっくり返して横臥位に戻る兆候が見られない場合は、麻酔が誘発されます。

3.レトロゾールミニポンプの埋め込み

  1. サージカルマスクと滅菌手袋を着用してください。
  2. 麻酔前のマウスを誘導ボックスから取り出し、脱毛クリームをマウスの背中に塗布し、1分間待ちます。脱毛クリームと髪を濡れたガーゼでやさしく拭き取ります。
  3. 同時に、三方弁スイッチを変更して、麻酔器の蒸発器からの空気の流れが麻酔マスクに接続されていることを確認し、メンテナンス濃度(通常は2%)を調整します。
  4. 脱毛後、利き手でマウスを持ち、頭/鼻を麻酔マスクに入れます。
  5. ペダル離脱反射をテストして、麻酔の深さを確認します。
    注:麻酔を含むすべての手順は、活性炭タブレットを取り付けたガスフィルターを使用して行う必要があり、手順はドラフト内で実行する必要があります。
  6. マウスを操作プレートの腹臥位に固定し、両目にアイ潤滑剤を塗布します。
  7. ポビドンヨードスワブを露出した皮膚に3回塗布します(図2C)。次に、メロキシカムを2 mg / kgの用量で皮下注射します。.
  8. つま先をつまんで麻酔の深さを再度確認します。次に、首の後ろの正中線で、無毛側の皮膚に有利になるように、鉗子で皮膚をつまみ、メスや手術用ハサミで横方向に約0.5cm切開します(図2D)。
  9. 次に、切開部の下の表皮を開き、止血器または針ホルダーでアクセスして皮膚を解放し、ミニポンプ(切開部から約2cm離れた場所)用のスペースを確保します(図2E)。
  10. 滅菌鉗子を使用して遠心分離管の生理食塩水からポンプを取り出し、ポンプの開放端を下に向けて、マウスにポンプを皮下挿入する準備をします(図2F)。
  11. 皮膚切開部の片側を鉗子で固定し、ポンプを皮下腔に押し込みます。ポンプに入るときに抵抗があってはなりません。中に入ったら、指を使ってポンプをできるだけ内側に少しゆっくりと押し込みます(図1G)。
  12. 4-0外科用縫合糸を使用して、切開部位を慎重に縫合します(図2H)。
    注意:縫合の際は、皮下ポンプ本体を傷つけないように注意してください。
  13. 縫合後、ヨードフォア綿棒で手術部位の皮膚を2回消毒します。

4. 動物の回復

  1. 手術後、麻酔中に使用したマットレスからマウスを乾燥した清潔なマットレスにそっと移します。マウスが暖かく静かな環境にいることを確認してください。
  2. マウスの呼吸の深さや頻度など、マウスの状態を注意深く監視します。
  3. マウスの可動性が戻り始めるときのマウスの行動を観察します。最後に、めまいや協調性のない動きなどの明らかな異常な行動なしに、立ったり歩いたりできることを確認してください。
  4. マウスが回復したら、事前に準備したケージにマウスを静かに移します。マウスが餌を食べられるように、滅菌ゼリーと餌をケージの底に置きます。
    注:手術部位を伸ばすと、術後早期にマウスが飲みやすく食べなくなる可能性があるため、ケージの底にゼリーと餌を置きます。
  5. メロキシカムを2 mg / kgの用量で皮下注射します(手術後最初の3日間は24時間ごと)。8週間のレトロゾール治療(すなわち、2回連続したミニポンプ移植)の後、マウスモデルをテストします。

結果

実験プロトコルといくつかの重要なステップを 図1 と 図2に示します。血清テストステロンレベルは 図3Aに示されています。レトロゾールミニポンプ処理マウス(以下、LTZマウス)は、雌の対照マウスと比較して、血清テストステロンレベルが有意に上昇しました。.一方、卵巣の組織学的解析では、LTZマウスは多嚢胞性卵巣を示し、黄体数が有意に減少し(図3B、C)、無排卵を示していることが示されました。また、LTZマウスは、雌の対照マウスと比較して有意な発情性非周期性を示しました(図3D)。体重の評価により、LTZマウスは対照マウスよりも重いことが明らかになりました(図3E)。耐糖能試験結果とAUC計算により、LTZマウスは対照マウスと比較して耐糖能異常を発症したことが示されました(図3F、G)。血清脂質アッセイは、LTZマウスが対照マウスと比較して血清脂質プロファイルの変化を示したことを示しました(図3H)。

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図1:ミニポンプを準備するための材料と重要な手順。 (A)レトロゾールミニポンプの調製を示す概略図。(B)ミニポンプは、キャップに取り付けられた細いチューブによってブロックが解除されました。(C)ポンプに合わせた針を1mLシリンジの針先に取り付けました。(D)レトロゾール溶液をバブリングせずにゆっくりと吸引した。(E)レトロゾール溶液をポンプの一番下からゆっくりと注入した。(F)充填されたポンプは、キャップの端が上を向くように、キャップを食塩水にキャップして保存しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:PCOS誘導のためにマウスにポンプを埋め込むための材料と重要なステップ。 (A)レトロゾールミニポンプの埋め込みを示す模式図。(B)麻酔器具:エアポンプ、麻酔器、誘導ボックス、ガスフィルター。(C)麻酔マウスを固定し、滅菌した。(D)背側正中線付近に0.5cmの切り込み。(E)皮膚は、ミニポンプ挿入のためのスペースを作るために解放されました。(F)ミニポンプを生理食塩水から、清潔で滅菌済みの鉗子で切り取りました。(G)ミニポンプは、以前に解放された皮膚の下に埋め込まれました。(H) 皮膚を4-0縫合糸で閉じた。(I)移植されたマウスは回復を許された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:レトロゾールミニポンプ移植マウスモデルにおける生殖および代謝表現型の特性評価。 (A)LTZ治療マウスの血漿テストステロンレベルは、対照マウスの血漿テストステロンレベルよりも有意に高かった(グループあたりn = 9匹)。(B)卵巣の組織学的分析。矢印は黄体を示しています。スケールバー:1 mm.(C)示されたグループの黄体の数(n = グループあたり9匹)。(D)LTZマウスは、対照の雌マウスと比較して非周期性を示しました。(E)示されたグループの体重(グループあたりn = 10匹)。(F,G)耐糖能試験の結果は、指定されたグループ(グループあたりn = 8匹)です。(H)示されたグループの血清脂質レベル(n = グループあたり8匹)。データは平均±SEMで表され、AUCは曲線下の面積を示します。E、発情期;LDL-C、低密度リポタンパク質コレステロール;HDL-C、高密度リポタンパク質コレステロール;P、発情前期;M / D、metestrus/diestrusステージ;TC、総コレステロール;およびTG、トリグリセリド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この報告では、簡単に入手できる材料を使用してマウスにPCOSを誘導するための簡単なプロトコルを示しています。マウスPCOSモデルは、PCOSメカニズムの探索と薬物のスクリーニングに不可欠です26。マウスでPCOSモデルを誘導するために利用可能な方法の中で、レトロゾール誘導は最も一般的に使用される方法の1つです。レトロゾールの使用は、テストステロンのエストラジオールへの変換を阻害するか、またはテストステロン合成を増加させることにより、高アンドロゲン状態を発症および維持することができる27。レトロゾール誘導マウスモデルは、PCOS28の患者と代謝および生殖の類似性を示しています。しかし、マウスPCOSモデルにおけるレトロゾール治療の従来の技術では、マウスへのレトロゾール薬物の毎日の経口給餌または注射が21日以上必要です29,30。摂食または注射の時限投与による長期の連続的な薬物割り当ては、時間と労力がかかり、薬物の反復投与はマウスにとって悪名高いストレスとなる可能性があり、モデル結果に影響を与える非実験的要因を導入する可能性があります23,31。一部のラットおよびマウスPCOS研究では、埋め込み型レトロゾールペレット28,32を使用しているが、使用される製品はカスタマイズする必要があり、適時に入手できない可能性がある。現在の研究では、マウスにPCOSを誘導するためにレトロゾールミニポンプを埋め込む技術を提案しています。この方法はシンプルで時間を節約し、ほとんどの研究室ですぐに入手できる手術器具と機器を使用します。

重要な手順とトラブルシューティング
この方法を実践する際には、最適な結果を得るためにいくつかの重要なステップに注意することが重要です。まず、対応するキャップに取り付けられた細いチューブを使用してポンプの詰まりを取り除きます。これまでの経験から、ポンプが詰まっていると薬物のロードと放出が妨げられる可能性があることがわかっています。さらに、レトロゾール溶液を構成する各ステップは、最終溶液が正確に目的の濃度にあることを確認するために、慎重に実行する必要があります。ポンプの組み立てプロセス全体を通して、汚染を防ぐために注意を払う必要があります。さらに、実験マウスに十分な麻酔を確保し、手術マウスに対する麻酔の悪影響を最小限に抑えるために、麻酔前および麻酔中に慎重な調整が必要です。

利点と制限事項
この研究で説明されている方法には、いくつかの利点があります:(1)時間を節約し、ポンプ注入後の継続的なレトロゾール放出を可能にします。(2)実験動物への薬物投与の繰り返しによるストレスを回避し、モデリング結果に対する非実験的要因の影響を最小限に抑えます。(3)必要な材料、手術器具、および機器は、ほとんどの研究所で一般的に入手可能です。(4)この方法は、マウスのPCOS表現型を効果的に誘導します。ただし、この方法には制限もあります:(1)ミニポンプの移植に必要な麻酔と外科的処置は、マウスに刺激を引き起こす可能性があり、皮膚の下にミニポンプが存在するとマウスの活動が妨げられる可能性があります。(2)このモデリング方法の有効性は、プロセス中にポンプ本体の汚染または損傷によって影響を受ける可能性があります。著者らの経験に基づいて、プロトコルステップを細心の注意を払って実行することで、PCOSマウスモデルの高い成功率につながる可能性があります。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、中国の国家重点研究開発プログラム(助成金2021YFC2700701)、中国国家自然科学基金会(助成金82088102、82071731、82171613、8227034、81601238)、中国医学院医学イノベーション基金(助成金2019-I2M-5-064)、上海市科学技術委員会(助成金21Y11907600)、上海市健康家族計画委員会(助成金20215Y0216)、 上海市衛生委員会の共同イノベーションプログラム(助成金2020CXJQ01)、上海病院開発センターの臨床研究計画(助成金SHDC2020CR1008A)、上海婦人科疾患臨床研究センター(助成金22MC1940200)、上海泌尿生殖器系疾患研究センター(助成金2022ZZ01012)、上海フロンティア生殖開発科学研究基地、曲州市科学技術委員会(助成金2022K54)、 浙江大学教育部生殖遺伝学重点研究室オープンファンドプロジェクト(助成金KY2022035)、および広東医科学院オープンファンドプロジェクト(助成金YKY-KF202202)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
シリンジBofeng BiotechBD3008411ML(滅菌)
遠心分離管生物学的希望1850-K15ML(滅菌)
ピペットエッペンドルフ3123000268-A100μL-1000μL(滅菌)
ピペットトップPette701010100810μL-100μL(無菌)
レトロゾール粉末シグマL6545-50MG一次作用薬(無菌)
PEG(ポリ(エチレングリコール))ソーラーバイオP8250溶解に使用(無菌)
菌生理食塩水バイオシャープBL158Aミニポンプ貯蔵
浸透圧ポンプALZET1004レトロゾール貯蔵および徐放性(無菌)
ジメチルスルホキシドバイオシャープBS087(滅菌)
小動物麻酔器RWD にR500IP麻酔用
イソフルラン RWDの20071302麻酔
の止血に使用される バイオシャープBS-HF-S-125手術器具
はさみバイオシャープBS-SOR-S-100P手術器具
ニードルホルダーShangHaiJZJ32010手術器具
鉗子RWD F12028手術器具
針と4-0吸収性縫合JINGHUANCR413手術器具
ポビドンヨードスワブSingleLadyGB26368-2010皮膚消毒
脱毛クリームZK-L2701 実験動物用脱毛剤
ニトリル手袋バイオシャープBC040-L無菌手術に使用
滅菌ガーゼZHENDEBA69087液体の拭き取りに使用
C57BL/6J マウス上海モデル生物センターN/A年齢:4週間
ペットアイ潤滑剤BAITESHF021153マウスアイ潤滑剤に使用
メロキシカム注射MEIDAJIAR21064-21マウスの鎮痛に使用(滅菌)
無溶解使用剤糸

参考文献

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