方法論記事

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

DOI：

10.3791/66653

⸱

2024年10月18日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, National Defense Medical College, 2Department of Pharmacology, National Defense Medical College, 3Department of Biochemistry, National Defense Medical College

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血液脳関門(BBB)の破壊による色素の血管外漏出を可視化する方法として、異なる時点のマウスに2種類の蛍光色素を投与することで可視化する方法を開発しました。グリセロールを凍結保護剤として使用すると、同じサンプルでの免疫組織化学が促進されました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛍光色素は、血液脳関門(BBB)の破壊によって発生する色素の血管外漏出の程度を決定するために使用されます。これらの色素による標識は、血液中の色素の濃度、脳血管の透過性、色素の血管外漏出の持続時間、劣化と拡散による組織内の色素濃度の低下など、いくつかの要因の影響を受ける複雑なプロセスです。軽度の外傷性脳損傷モデルでは、爆風誘発衝撃波(BSW)への曝露は、限られた時間枠内でBBBの破壊を引き起こします。BBBブレークダウンの正確な配列を決定するために、エバンスブルーとフルオレセインイソチオシアネート-デキストランを、BSW曝露に関連するさまざまな時点でマウスに血管内および心内に注射しました。次に、脳スライス中の色素蛍光の分布を記録しました。2つの色素間の分布と強度の違いにより、BBBブレークダウンの時空間配列が明らかになりました。脳切片の免疫染色により、アストロサイトおよびミクログリアの応答がBBB分解部位と相関していることが示されました。このプロトコルは、さまざまな BBB ブレークダウンモデルを含む研究に幅広く適用できる可能性を秘めています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血液脳関門(BBB)の破壊と機能障害は、全身性炎症、感染症、自己免疫疾患、傷害、神経変性疾患によって引き起こされます1。爆風衝撃波(BSW)への曝露に起因する軽度の外傷性脳損傷(mTBI)では、BSWの強度とBBBの分解による蛍光色素の漏出量との間に有意な相関が観察されています2,3,4。mTBIにおけるBBBの分解の注目すべき特徴の1つは、BSWへの曝露後すぐにまたは数時間以内に始まり、通常は遅延性の慢性神経障害が現れる前に約1週間続く一時的なプロセスであることです3,5,6,7。詳細は不明のままですが、BBB の分解は長期にわたる病理学的カスケードの一部であり、mTBI6 の予後因子としても役立つ可能性があります。したがって、脳内のBBB分解の空間的および時間的分布を理解することが重要です。

蛍光色素は、BBBの分解の程度を決定するために使用されます3,8。色素の血中濃度とBBB分解の程度は時間とともに変化するため、色素の血管外漏出の画像を解釈する際には注意が必要です。例えば、色素の血管外漏出がないからといって、必ずしもBBBの分解がないわけではありません。染料の血中濃度が上昇する前または後にBBBの分解が検出されない場合があります。.BBBの分解が発生した場所で色素が正常に蓄積したとしても、分解が止まった後に時間の経過とともに色素が失われている可能性があります。一般に、水溶性で生物学的に不活性な物質は、尿中にすぐに排泄されます9。したがって、BBBの分解が特定の時間に起こるかどうかを判断するためには、動物を固定する直前に蛍光色素を短時間血流に投与した場合に最も信頼性の高い結果が得られます。この方法では、特定の分子量を持つ市販のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランを使用する必要があります。.

エバンスブルーは、血清アルブミンに強い親和性を持つ広く認知されている青色のアゾ染料です。この色素は、生体システム2において緑色光によって励起されると赤色の蛍光を示す。その不活性な性質により、エバンスブルー-血清アルブミン複合体は最大2時間血液中に留まり、少なくともこの期間10,11でBBBが損なわれた領域を標識するための有用な69kDaトレーサーになります。したがって、Evans blue9の薬物動態と毒性を取り巻く潜在的な不確実性を考慮することが重要です。しかし、最近の研究では、エバンスブルーはBBBが存在しないか、または乱れている領域に蓄積し続けることが示されました7。この機能により、Evans BlueはBBBの内訳の履歴を記録することができ、FITC-dextranはBSW曝露後の特定の時点でのBBBの内訳を記録するために使用されました。Evans blueは静脈内投与または腹腔内投与が可能ですが10、時間的制約のある実験には静脈内投与が好ましい。この研究は、BSW への曝露後の BBB ブレークダウンの時空間分布を検出するために、Evans blue と FITC-dextran の使用を実証することを目的としています。

次に、この研究では、BBBブレークダウンの蛍光を観察した後、脳スライスを凍結し、免疫組織化学的手順に適した薄いスライスを調製する技術が提示されました。グリセロールを封入剤および凍結保護剤として使用すると、免疫組織化学プロセスが簡素化されます。BBBの分解の画像を免疫組織化学の画像と比較することにより、BBBの分解の時空間分布を同じサンプルの組織応答と相関させることができます。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての実験は、防衛医科大学(所沢市)が定めた動物実験に関する倫理指針に則って行われました。この研究プロトコルは、国防医科大学の動物研究委員会によって承認されました(承認番号23011-1)。この研究では、8週齢、体重19〜23 gの雄C57BL / 6Jマウスを使用しました。 図1に示すように、1回のBSW曝露に関連して、1回のEvansブルー注射とFITC-デキストラン灌流をさまざまな時点で実施しました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1.麻酔

注:これは、元のものと比較してメデトミジンの量を2.5倍に増加させる修正されたプロトコルです12。メデトミジン塩酸塩、ミダゾラム、ブトルファノールの投与量は、それぞれ0.75 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kgでした。

  1. 塩酸メデトミジン(75 μg/mL)、ミダゾラム(400 μg/mL)、ブトルファノール(500 μg/mL)を生理食塩水に混合して調製します。
  2. 混合物を腹腔内に投与して、マウスに麻酔をかけます(10μL / g)13。
  3. 約5〜10分後、テールピンチとペダル離脱反射の欠如を観察して、十分な麻酔を確認します。
  4. 麻酔の影響から回復するまで、マウスを暖かく保ちます。

2.BSW曝露

注:この研究では、社内のショックチューブが使用されました14。

  1. ステップ1の説明に従ってマウスに麻酔をかけます。
  2. マウスをショックチューブの出口端から5cm離して配置し、本体の軸がチューブの軸と平行であるが、位置が合っていないことを確認します。
  3. ピーク過圧25kPaで頭部に1回のBSW露光を行います。
    注意: 麻酔の影響から回復するまで、マウスを暖かく保ちます。治療したマウスの状態を定期的に監視します。摂食や飲酒の困難、猫背、回復の兆候がない長時間の異常な外観などの苦痛の兆候が観察された場合は、マウスを安楽死させ、実験を早期に終了してください。鎮痛薬の投与は、グリア反応に影響を与える可能性があるため、避けてください。.

3.尾静脈へのエバンスブルー注射

注:エバンスブルー溶液は麻酔なしで静脈内投与する必要があります。.麻酔の存在下では、染料はしばしば体に十分に浸透しませんが、これはおそらく血圧と体温の低下によるものです13。エバンスブルーは100 mg / kgの用量で投与されました。.

  1. エバンスブルー溶液(生理食塩水中4%w / v)をマイクロチューブに調製し、ボルテックスして暗闇で保管してから使用してください。
  2. 溶液を尾静脈(2.5μL / g)に注入します13。

4. FITC-デキストラン溶液による経心灌流と固定

  1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にヘパリンを添加して1 U/mLの濃度にした後、ヘパリン化したPBSにFITC-デキストランを添加して3 mg/mLの濃度にします。
  2. 使用前にFITCデキストランパウダーを完全に溶解してください。これを行うには、溶液を30分以上静かに振ってください。使用前に、未溶解のFITCデキストラン粉末がないか注意深く確認してください。残っている場合は、完全に溶けるまで振とうを続けます。
  3. ステップ1の説明に従ってマウスに麻酔をかけます。
  4. 蠕動ポンプ15,16を用いて標準的な灌流固定プロトコルを進める。まず、FITC-デキストランを含むヘパリン化PBSを4.0 mL/minの速度で2分間灌流します。次に、10%ホルマリン中性緩衝液または4%パラホルムアルデヒド-PBSで4.0 mL/minの速度で2分間灌流し、続いて3.5 mL/minの速度で8分間灌流します。
  5. 手術用ハサミとピンセット15,16を使用して脳を慎重に取り除きます。解剖後、同じ固定剤(すなわち、10%ホルマリン中性緩衝液または4%パラホルムアルデヒド-PBS)で脳を4°Cで一晩後固定します。
  6. 翌日、固定剤をPBSに交換します。

5. 脳組織処理

注:灌流固定が完了していても、エバンスブルーとFITC-デキストランは緩衝液に分散する可能性があります。.したがって、ステップ6.8に至るまでの手順は、灌流固定後1週間以内に完了する必要があります。.また、サンプルを光にさらさないでください。

  1. 各ウェルに500 μLの20%グリセロールをリン酸緩衝液(PB;pH 7.4)溶かした24ウェルプレートを調製します。
  2. ブレインスライサーを使用して、脳を冠状に12スライスに切り、それぞれ1mmの厚さにします。
  3. 各スライスを24ウェルプレートの対応するウェルに移し、4°Cで少なくとも2時間保存します。
  4. 溶液を50%グリセロール-PBと交換し、4°Cで少なくとも2時間保存します。
  5. 最後に、溶液を100%グリセロールに置き換えます。顕微鏡ですぐに観察するには、スライスを室温で少なくとも2時間放置するか、4°Cで保存します。 これで、スライスは半透明になり、顕微鏡観察の準備が整います。

6. 色素の血管外漏出の蛍光測定

注:蛍光標識効率はマウスによって異なります。したがって、蛍光強度を正規化する必要があります。蛍光値は、巨大細胞網様体核(GRN)内の値と比較して相対的に表されます。これは、この領域がBSW処理の影響を最小限にするためです。

  1. 35 mmガラス底皿の底に500 μLのグリセロールを加えます。
  2. スライスをグリセロール溶液に移し、その表面をカバーガラスで覆います。
  3. カバーガラスの端から余分なグリセリンを取り除きます。
  4. 蛍光顕微鏡でスライスの蛍光強度を測定します。
  5. 顕微鏡での測定後、スライスをウェルに戻します。
  6. 12個のスライスすべてについて測定を繰り返します。
  7. 各ウェルに500 μLのPBを加え、24ウェルプレートを4°Cで一晩保存します。翌日、スライスは50%グリセロール-PBで飽和されます。
  8. 溶液を30%グリセロール-PBと交換し、4°Cで少なくとも2時間保存します。
  9. ステップ 7 の手順を数週間以内に実行します。

7. 凍結切片と免疫組織化学

  1. 等量の組織凍結培地と30%グリセロール-PBの混合物1000 μLをウェル1に加えて、24ウェルプレートを調製します。次に、1000 μLの組織凍結培地をウェル2に加えます。
  2. スライスをウェル1に移し、プレートを4°Cで1時間振とうします。
  3. スライスをウェル2に移し、プレートを4°Cで1時間振とうします。
  4. スライスを曲げないように注意しながら、ドライアイスを使用してイソペンタンでスライスをすばやく凍結します。スライスを凍結切片になるまで-80°Cで保存します。
  5. スライスを6μmの厚さに凍結切片します。顕微鏡スライドで乾燥させた後、切片を-80°Cで保存します。
  6. 抗原賦活化17では、切片を10 mMクエン酸ナトリウム(pH 6.0)に浸し、一度100°Cに加熱した後、98°Cで1時間維持します。
  7. 切片を蒸留水で広範囲に洗浄します。これで、切片は免疫組織化学染色の準備が整いました。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図1A は、BSWの発症に対する色素注入の時間経過を示しており、ピーク過圧は25 kPaです。「ポスト」プロトコルでは、エバンスブルー溶液をFITC-デキストラン灌流の2時間前に血管内投与し、BSW曝露の6時間後、1日後、3日後、および7日後に実施しました。「Pre」プロトコルでは、Evansブルー溶液をBSW曝露の直前に注入しました。「Post」プロトコルでは、Evans blueの濃度は灌流固定の約2時間前に最大に達すると予想されますが、「Pre」プロトコルでは、BSW曝露の頃に最大に達すると予想されます(図1B)。脳血管内のFITC-デキストランの濃度は、灌流中に2分間一定に保たれました。

Evansの青色のラベルは、BBBの分解が6時間以内に開始し、BSW曝露の7日後まで続いたことを示しました(図2A)。特に、「Pre」プロトコルでは3時間後にEvans青色色素の血管外漏出がなかったため、BSW曝露直後にはBBBの分解は起こらなかった(図2B)。驚くべきことに、Evansブルーによる長期標識は、「Pre」プロトコルでその累積的な性質を示しました（図2B）7。

2 つの異なる色素をそれぞれ 2 時間以上の間隔で導入することで、それらの分布を比較することにより、BBB の完全性の時間的変化を調べることができました。 図3 は、Evans blueとFITC-dextranの分布に有意な差を示したスライスの蛍光画像を示しています。

さまざまなサイズの多数の蛍光ホットスポットが観察されました。一部のホットスポットはピクセルの上位0.1%にランクインするほど明るく、多くは周囲の組織よりもわずかに明るいだけでした。染料間の不一致は、この間隔内で変化が起こったことを示唆しています。エバンスブルー蛍光のみを示すホットスポットは、エバンスブルー注射時に進行中のBBB分解を示し、これは後にFITC−デキストラン注射によって修復された。対照的に、FITC-デキストラン蛍光のみを示すホットスポットは、2つの色素注入間でBBBの破壊が発生したことを示唆しました。最後に、両方の色素から蛍光を示すホットスポットは、注入期間全体にわたって連続的なBBBの分解を示しました。

図4A は、エバンスブルー(エバンスブルーのみおよびエバンスブルー/FITC-デキストランダブルポジティブホットスポットの両方を含む)、FITC-デキストラン(FITCデキストランのみおよびエバンスブルー/FITC-デキストランダブルポジティブホットスポットの両方を含む)、または両方の色素(エバンスブルー/FITC-デキストランダブルポジティブホットスポットのみ)に陽性のホットスポットの数を示す。3時間の「Pre」プロトコルでは、多数のFITC-デキストランのみのホットスポットが観察されました。「Post」プロトコルの 6 時間 1 日で、Evans ブルーのみのホットスポットと FITC-デキストランのみのホットスポットの両方が検出されました。しかし、「Post」プロトコルの3日後と7日後には、ホットスポットは主に両方の色素に対して陽性でした。これらの知見は、BBBの破壊が3時間後に起こり、1日ごとに改造され、BSW曝露の7日後まで持続したことを示唆しています(図4B)。重要なことに、前述のように、BBBの分解の程度は7日間減少する傾向がありました。

色素血管外漏出実験の完了後、スライスの免疫組織化学的染色を実施した7。免疫組織化学画像スキャンは、色素血管外漏出の画像スキャンと一貫して比較され、蛍光物質のキャリーオーバー効果が実質的に無視できることが確認されました7。 図5に示すように、反応性アストロサイトのクラスターは、BBBの破壊部位と密接に関連していました。さらなる観察により、活性化されたアメーバ状のミクログリアが、BSW曝露の3日後に反応性アストロサイトとともに存在していたことが明らかになりました。

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図1:実験計画法 (A)実験の時間経過。Evans Blue 溶液は、BSW 曝露後 (「ポスト」プロトコル) または直前 (「プレ」プロトコル) に静脈内注射されましたが、FITC-デキストランは固定前に 2 分間経心灌流されました。(B) 「Post」および「Pre」プロトコルの血管内の Evans blue および FITC-dextran の予想濃度。BSW、爆風誘発衝撃波;FITC、フルオレセインイソチオシアネート。この図はNishii et al.7から引用しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:脳スライスの蛍光強度の比較。 脳内の最も明るい0.1%のピクセルの蛍光強度を12のスライスすべてで評価し、「ポスト」(A)条件と「プレ」(B)条件で比較しました。差の変動性と重要性が示されています。xxx は p < 0.001 を示します。xxxx は p < 0.0001 (F 検定の p 値) を示します。*p < 0.05;p < 0.0001 (ダネットの多重比較の事後検定による分散分析)。この図はNishii et al.7から引用しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:エバンスブルーとFITC-デキストランによる二重標識を使用して、さまざまな時点でBBBのブレークダウンが観察されました。 エバンスブルー(マゼンタ)、FITC-デキストラン(緑)、およびマージされた画像が表示されます。染料注入プロトコルは左側に示されています。一部のホットスポットでは、Evans blue(矢印)またはFITC-dextran(矢印)の優勢な蛍光が示されました。アスタリスクは、脈絡叢と関連する血管を示します。BBB、血液脳関門;FITC、フルオレセインイソチオシアネート;CVO、第3心室の心室周囲器官。スケールバー:1mm。この図はNishii et al.7から引用しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:蛍光ホットスポットの定量化。 (A)エバンスブルー(マゼンタ)、FITC-デキストラン(緑)、および両方の染料(灰色)に陽性のホットスポットの数。これらは、「Pre」プロトコルの3時間で得られた画像から、および「Post」プロトコルの6時間、1日、3日、および7日で得られた画像から収集されました。3時間から1日にかけて、蛍光ホットスポットのかなりの部分で色素間のミスマッチが示されましたが、3日から7日では、そのようなミスマッチはほとんど観察されませんでした。(B) BBB格の内訳の時間経過をまとめたスキーム。縦軸は、BBBの分解による染料の漏れの強度を概念的に表しています。3時間から1日にかけてのジグザグパターンは、この期間中、染料の漏れの位置と強度が不安定であることを示しています。FITC、フルオレセインイソチオシアネート;BBB、血液脳関門;BSW、爆風誘発衝撃波。この図はNishii et al.7から引用しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:GFAPとIba1のアストロサイトとミクログリアのマーカーとしての発現。 図の各列には、Evans blueまたはFITC-dextranによる色素血管外漏出の蛍光画像と、GFAPまたはIba1免疫組織化学画像が含まれています。カラーバーは、GRN内の蛍光強度を使用して、エバンスブルーとFITC-デキストランの正規化された蛍光強度を示しています。染料注入プロトコルは左側に示されています。「Pre」プロトコルの1日のスライスは、EvansブルーとFITC-デキストランの両方の蛍光を示していますが、「Pre」プロトコルの3日間のスライスは、Evansブルー(矢印)の蛍光のみを示しています。色素血管外漏出画像の矢印で示されている領域は、免疫組織化学画像と一致しています。矢印は反応性アストロサイトのクラスターを示しています。ポリクローナルGFAP抗体は、白質内およびその周辺、および軟膜に隣接する神経組織中のアストロサイトを標識しました。その結果、dcw内およびDCWに近いアストロサイトがこの図で標識されています。Iba1 列のフレームまたは矢印に対応する拡大画像は、挿入図に描かれています。スケールバー:色素の血管外漏出および免疫組織化学画像用にそれぞれ1 mmおよび200 μm。GFAP、グリア線維性酸性タンパク質;Iba1、イオン化カルシウム結合アダプター分子1;FITC、フルオレセインイソチオシアネート;BSW、爆風誘発衝撃波;DCW、深部脳白質。この図はNishii et al.7から引用しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エバンスブルーとFITC-デキストランを用いた新しい二重標識技術を用いて、単一の脳におけるBBBブレークダウンの正確な時空間分布を正確に可視化しました。低強度BSWモデルでは、検査した脳で色素の血管外漏出の程度、位置、および程度に顕著な変動が観察されました(図2 および 図3)。色素間のミスマッチにより、BBBの分解はBSW曝露の約3時間後に開始され、1日目までに大幅なリモデリングが起こり、7日目まで続くことが明らかになりました(図4)。重症例では、活性性ミクログリアがBBBの破壊部位に動員され、反応性アストロサイトのクラスターがこれらの領域と密接に関連していました(図5)。色素血管外漏出分析に使用したのと同じスライスで免疫組織化学を行うことにより、グリア反応と色素血管外漏出との間に正確な相関関係が確立されました。より詳細なデータや解析については、Nishii et al.7をご参照ください。

FITC-デキストランは、灌流固定の直前に一定の濃度で同じ期間灌流されたため、色素の分布と強度は、灌流固定時のBBB分解の程度を正確に表している可能性があります。しかし、以前の報告では、FITC-デキストランの蛍光は低強度BSWモデル7で弱い傾向があることが実証されています。Evansブルーで長時間標識すると、BBBブレークダウンのより微妙な変化を検出できるという利点がありました(図2)。ただし、ラベリングの期間が長いため、エバンスブルーの蛍光画像を解釈する際には注意が必要な場合があります。エバンスブルーの血中濃度は注射直後で最も高く、数時間かけて徐々に減少しました(図1)11。ラベリングの強度は、BBBの破綻の重症度と期間、およびエバンスブルーの血中濃度と相関すると推測されています。ただし、修理すると指数関数的に減少します。これらの要因はすべて、時々、また実験ごとに異なります。したがって、色素の血管外漏出の単一の画像から結論を導き出すべきではなく、常に統計的な考慮が必要です。

実験の目的によっては、分子量や色素の組み合わせを変えるのも面白いかもしれません。この研究では、Evans BlueとFITC-デキストランの組み合わせを使用しました。血清アルブミンと結合した後、Evans blueは69 kDaトレーサーとして振る舞い、この研究で使用された40 kDaのFITC-デキストランは、Evans blueと同程度のBBB分解を示しました。BBBブレークダウンの時空間分布は、異なる蛍光を発する色素の組み合わせを用いて系統的に調査した7。エバンスブルーとフルオレセインナトリウム(376 Da)の組み合わせを利用した以前の研究では、フルオレセインナトリウムは、その小さな分子量のために、BSW曝露後のBBB分解のより広い範囲を標識することができました3。他の研究では、エバンスブルーと高分子量のFITC-デキストランの組み合わせを使用して、BBBのブレークダウン18,19の程度を比較しました。以前のすべての報告は、エバンスブルーとFITC-デキストランをほぼ同時に投与しました。.ここで紹介するプロトコールのユニークな側面は、2つの色素が異なる時点で導入されたため、BBBブレークダウンの時間的進行を調べることができることです。

エバンスブルーの累積的な性質は、さまざまなBBBブレークダウンモデルで有益であることが証明される可能性があります。BBBの内訳の病歴を記録するため、疾患の発症と進行の理解が促進される可能性があります。研究者は、染料のプラスとマイナスの特性を認識し、それらを最大限に活用する必要があります9。このプロトコルは、さまざまなBBBブレークダウンモデルに幅広いアプリケーションがあります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

渡辺真由美さんには、クライオセクショニング技術に感謝いたします。この研究は、防衛省の軍事医学に関する先端研究助成金の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10% ホルマリン中性緩衝液富士フイルム和光ケミカルズ062-01661
抗 GFAP, ウサギDAKO-AgilentIR524
抗 Iba1, ウサギ富士フイルム 和光ケミカルズ019-19741
ニワトリ抗マウス IgG (H+L) 交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 488サーモフィッシャーサイエンティフィックA-21200
クライオマウント武藤純薬33351組織凍結培
ドミターオリオン コーポレーションメデトミジン
ドンキー 抗ウサギ IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040
Evans BlueSigma-Aldrich E2129
Falcon 24ウェルポリスチレン透明平底未処理細胞培養プレート、蓋付き、個別包装、滅菌、50 /ケースコーニング351147
フルオレセインイソチオシアネート–デキストラン平均分子重量 40,000Sigma-Aldrich FD40SFITC-デキストラン
ガラスベースディッシュ 27mm (No.1 ガラス)AGC TECHNO GLASS3910-03535mm ガラス底皿
IX83 倒立顕微鏡オリンパス
MAS 親水性接着顕微鏡スライド松波ガラスMAS-04
松波 カバーガラス(No.1) 18 x 18mm松波ガラスC018181
ミダゾラム注射 10mg [SANDOZ]サンド
パラホルムアルデヒド EMPROVE ESSENTIAL DACMerck Millipore1.04005.1000
蠕動ポンプATTOSJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX
Adult Mouse, 30 g, Coronal ASI		INSTRUMENTSRBM-2000CBrain Slicer
VetorphaleMeiji アニマルヘルスVETLI5ブトルファノール
地

参考文献

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