方法論記事

網膜を評価するためのラットおよびマウス眼球の組織学的スライドの調製と分析

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DOI：

10.3791/66663

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2024年8月23日

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1Chair and Department of Experimental and Clinical Physiology, Laboratory of Centre for Preclinical Research, Medical University of Warsaw, 2Department of Pathology, Medical University of Warsaw

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この記事について

サマリー

この原稿は、げっ歯類の眼球からのスライドの組織学的調製のためのプロトコルを提示します。提案手法により、内側の網膜を光学顕微鏡で容易に可視化し、評価することができる。この手順は、マウスとラットの眼球に提示されます。

要約

げっ歯類の眼球は、緑内障、高血圧性網膜症など、多くの眼科疾患の病態メカニズムを研究するための強力なツールです。前臨床試験により、研究者は新薬の有効性を調べたり、新しい治療法を開発したり、病気の発症や進行に関与する新しい病態メカニズムを探したりすることができます。組織学的検査は、実施された実験の影響を評価するために必要な多くの情報を提供し、変性、組織リモデリング、浸潤、およびその他の多くの病状を明らかにすることができます。臨床研究では、組織学的検査に適した眼組織が得られる可能性はほとんどないため、研究者はげっ歯類の眼球の検査によって提供される機会を利用する必要があります。この原稿は、げっ歯類の眼球切片の組織学的調製のためのプロトコルを提示します。この手順は、マウスおよびラットの眼球に対して提示され、(i)眼球の採取、(ii)さらなる分析のための眼球の保存、(iii)パラフィンでの組織の処理、(iv)スライドの調製、(v)ヘマトキシリンおよびエオシンによる染色、(vi)光学顕微鏡下での組織の評価。提案手法により、網膜を容易に可視化し、詳細に評価することができます。

概要

眼球は、視覚器官を構成する球体のような構造です。眼球の内部は、角膜、虹彩、毛様体、水晶体、前房、および後房を含む前眼部と、硝子体、網膜、脈絡膜、強膜、視神経乳頭を含む後眼部の2つのセグメントに分けることができます。前房は角膜と虹彩1,2の間に位置しています。虹彩は、瞳孔と呼ばれる中央に開口部がある円形の構造です。角膜と虹彩の接合部には、小柱の特殊なシステムが眼球から静脈系に房水を排出するドレナージ角度があります。後房は、虹彩、毛様体、水晶体、および水晶体を所定の位置に保持する懸垂靭帯によって結合されています。レンズの後ろには、眼球の最大の構造である硝子体が配置されています。硝子体は網膜に付着し、その位置を安定させます。網膜は脈絡膜と強膜に囲まれています1。眼球の解剖学的構造を図1にまとめます。

眼球壁は3つの層で構成されています。最も外側の層は強膜で、眼球を怪我から守り、その形状を保ちます。眼球の前極で、強膜は透明な角膜に変わります。強膜の下には、ブドウ膜と呼ばれる血管構造があり、その主な機能は目の構造に栄養を与えることです。ブドウ膜は脈絡膜を形成し、前極内では毛様体と虹彩を形成します1。最も内側の層は網膜であり、これはニューロン、グリア細胞、色素上皮細胞で構成される目の高度に特殊化された構造です。網膜ニューロンには、視細胞(桿体および錐体)、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、および網膜神経節細胞(RGC)が含まれます。これらの細胞は複雑な層に組織化されており、その役割は光刺激を受け取って処理することです2,3。網膜のグリア細胞は、網膜のすべての層に存在するミュラー細胞、星状細胞、およびミクログリアで構成されています。グリア細胞の多くの機能には、ニューロンの栄養、血液網膜関門のサポート、網膜の層状構造を維持するためのニューロンの構造的サポート、ニューロンの代謝の調節、ニューロンの機能、成長、生存を調節する生物学的に活性なタンパク質の分泌、および網膜内の免疫学的プロセスの調節が含まれます4.色素上皮細胞は網膜の最外層を構成し、脈絡膜と視細胞の間のバリアとして機能します。これらの細胞は、老廃物や栄養素の双方向輸送を調節するとともに、光エネルギーを吸収し、光で生成された活性酸素種を中和することで、網膜を過度の光による損傷から保護します5。

網膜は、(i)網膜色素上皮、(ii)視細胞セグメント層(桿体および錐体)、(iii)外部制限膜(ELM)、(iv)外部核層(ONL)、(v)外側網状層(OPL)、(vi)内部核層(INL)、(vii)内側網状層(IPL)、(viii)神経節細胞層(GCL)、(ix)網膜神経線維層(RNFL)、 (x)内部制限膜(ILM)2。網膜の核層には、ONL、INL、およびGCLが含まれ、細胞間のシナプス結合を有する層には、OPLおよびIPLが含まれます6。桿体と錐体の核はONLを形成し、それらの軸索はOPLに伸び、そこで双極細胞と水平細胞の樹状突起に接続します。INL内には、水平細胞、双極細胞、およびアマクリン細胞の核があります。IPL内では、バイポーラ細胞およびアマクリン細胞の軸索終末は、RGCの樹状突起とシナプスを形成します。GCL内では、RGCが細胞体の大部分を占めていますが、脱臼したアマクリン細胞もそこに見られます。RGCの軸索はRNFLを形成し、さらに視神経7,8,9を形成します。

網膜の神経変性疾患など、多くの眼科疾患は、不可逆的で不治の失明につながります10。視覚は最も重要な感覚の11つと考えられており11、永久的な失明は患者の生活の質を著しく低下させます。多くの疾患の病態メカニズムの理解をさらに進めるために、細胞培養や動物モデルを用いた前臨床研究が広く行われています。実験動物を用いた前臨床試験は、眼疾患の病態メカニズムを評価し、新たな治療戦略を開発する機会を提供します。眼疾患は、大型動物 (サル、ウシ、イヌ、ネコ) と小動物 (ウサギ、ラット、マウス、ゼブラフィッシュ) の両方でモデル化できます。より大きな動物を使用すると、そのサイズのために目へのアクセスが容易になります。一方、げっ歯類を用いて行われた実験は、その比較的急速な繁殖のために、特定の疾患に対する感受性を特徴とする近交系の繁殖を可能にする12,13。

動物モデルでは、眼球の組織病理学的検査を行い、疾患の発症中に眼の特定の構造に現れる軽度の病状を評価することで、眼球の詳細な組織病理学的検査を行うことが可能であり、これはヒトでは非常にまれにしか行われない検査である。病理組織学的評価は、眼疾患の病態メカニズムを研究する上で非常に貴重なツールです。発表された文献では、眼球の組織学的検査の方法論の説明は非常に限られており、ステップバイステップのガイドが不足しているため、初心者が再現することは困難です。この研究は、組織学的スライドを準備し、ラットとマウスの網膜を評価するためのシンプルで簡潔な方法を提供することを目的としています。

プロトコル

この研究は、機関のガイドラインに準拠して実施されました。この研究で使用された眼球は、ポーランドのワルシャワにあるワルシャワ生命科学大学の第2回地方 倫理委員会が発行した研究承認番号WAW2/122/2020に基づいて実施された実験に含まれる動物から採取されました。私たちのプロトコルは、11週齢と44週齢のマウス、および6週齢、12週齢、16週齢のラットを調べることによって開発されました。

1.マウスの眼球の調製

注:このプロトコルは、マウスの眼球の切片を調製する方法を示し、11週齢の雌C57Bl/6マウス(平均重量21g)、44週齢の雌C57Bl/6マウス(平均重量25g)、11週齢の雌DBA/2マウス(平均重量21.5g)、および緑内障の44週齢の雌DBA/2マウス(平均重量25g)から採取した眼球を使用して開発されました。

  1. 摘出
    1. 小さな鉗子を使ってまぶたを開きます。まぶたを押して眼球を脱出させます。
    2. 小さくて鋭いハサミで眼球の後ろの組織を切り取り、眼球をソケットから解剖します。眼球が眼窩から取り除かれたら、突き出た結合組織と眼周囲筋を切り取ります。
      1. たとえば、眼球の外側直筋の腱の切り株に小さな縫合糸を結び、眼球の側頭側をマークするなど、向きを良くするために眼球に印を付けます。
  2. 組織の固定
    1. 除核した眼球を1.5mLの微量遠心チューブに入れ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解したパラホルムアルデヒド(PFA)の4%溶液に24時間休ませます。
    2. これに続いて、眼球をスクロースの10%溶液で24時間処理し、次にスクロースの20%溶液で24時間取り出して置き、最後に、スクロースの30%溶液で24時間取り出して置きます。
      注意: プロセス全体を通して、眼球を4°Cの低温に保ちます。 スクロース浸潤のための針の穿刺は、眼球の損傷のリスクを最小限に抑えるために避けるべきです。
  3. ティッシュの凍結と保管
    1. ショ糖溶液から眼球を取り出し、ペーパータオルで軽くたたいて乾かします。
    2. 眼球を清潔な1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、将来の処理のために-80°Cで凍結します。
      注:-80°Cで保存した場合、眼球は将来の処理まで最大12か月間生存し続けることができます。
  4. スライドの準備
    1. 眼球を室温で解凍します。微量遠心チューブからカセットに移し、流水で20分間すすぎ、ショ糖を洗い流します。
    2. 眼球をヒュームフードの下に入れ、次に次の溶液から取り出します:エチルアルコール(EtOH)の70%溶液で10分間、EtOHの80%溶液で10分間、EtOHの96%溶液で10分間、EtOHの99.9%溶液で10分間、アセトンで5分間。
    3. ヒュームフードの下に5分間キシレンに入れて眼球をきれいにします。
    4. 固体パラフィンをビーカーに入れ、パラフィン製造業者が指定した融解温度(パラフィンの融解温度は46°C〜68°C)よりも高い温度に設定した実験室のインキュベーターに入れて、パラフィンを溶かします。パラフィンが完全に溶けた後(時間は使用済みパラフィンの量によって異なります)、眼球をパラフィンの入ったビーカーに移し、インキュベーター内で1時間保温します。パラフィンが組織に浸透してから1時間の間に、10〜15分ごとにパラフィンを攪拌します。
      注:このステップには、溶液を攪拌しながらパラフィン浸潤を可能にするティッシュプロセッサーを使用することができます。
    5. 以下で説明するように、眼球をパラフィンブロックに埋め込みます。
      1. カセットを開き、トップカバーを取り外します。金型を選び、型底を覆うように少量のパラフィンを注ぎます。鉗子でカセットから眼球を取り出し、型内のパラフィンに置きます。矢状面で確実に切断されるように、眼球を横に置きます。
        注意: 眼球を横に置くと(前極を片側に、後極を反対側に)、矢状面を切断できます。このようにして、角膜、虹彩、毛様体、瞳孔、末梢、および中心網膜を通る切片が得られます。
      2. -15°Cに設定された冷却プレートで型を短時間冷却し、パラフィンがわずかに固化して組織を所定の位置に固定します。組織をパラフィンで慎重に覆い、カセットの底をブロックを形成します。ブロックを冷却プレートの上に置いて、完全に固めます。次に、ブロックを金型から取り外し、パラフィンブロックを冷却プレートに戻し、少なくとも15分間冷ましてから切断します。
    6. ミクロトームにパラフィンブロックを固定します。ミクロトームをブロックから余分なパラフィンを切り取るようにセットし(15μmカットするように設定します)、眼球の中心まで切り取ります。ミクロトームの設定を変更して、より薄い切片を切断し(3.5μmを切断するように設定)、切片をスライド上に置きます。隣接するウォーターバスを備えたミクロトームを使用する場合は、湿ったティッシュでスライドから余分な水分を取り除きます。
      注:目標は、瞳孔を通して少なくとも3つの断面を取得することです。研究者の経験が浅いほど、瞳孔のレベルで切片化を確実にするために、より多くの切片を取得する必要があります。1 つのスライドにいくつかのセクションを配置します。また、経験の浅い研究者の場合は、組織を厚く、たとえば4 μmまたは5 μmの厚さに切断します。隣接するウォーターバスを備えたミクロトームを使用すると、ウォーターバスを使用しないミクロトームを使用する場合と比較して、組織切片をスライドに移すプロセスがはるかに容易になります。また、レンズが切り込みにくい場合もあるので注意が必要です。もろいレンズによる組織損傷のリスクを最小限に抑えるために、硬組織を切断するために指定された鋭利なミクロトームブレードのみを使用してください。ブレードの鈍化を最小限に抑えるために、1つのブレードをトリミングに使用し、もう1つのブレードをセクションの切断に使用することを検討してください。
    7. スライドを56°Cに設定した実験用インキュベーターに30分間入れます。
    8. インキュベーターからスライドを取り出し、スライドを次の溶液に順次入れたり取り出したりして、手動でヘマトキシリンとエオシン(H&E)による染色を開始します。7分間のキシレン、5分間のキシレン(きれいな溶液を含む別のビーカー)、および5分間のキシレン(クリーンな溶液を含む別のビーカー)から始めます。これに続いて、2分間の96%EtOH、1分間の96%EtOH(クリーンな溶液を含む別のビーカー)、1分間の96%EtOH(クリーンな溶液を含む別のビーカー)を使用します。
    9. 5分間の流水で洗い、次に2分間のメイヤーヘマトキシリン、2分間のメイヤーのヘマトキシリン(きれいな溶液を含む別のビーカー)、5分間の流水、5分間の流水(別のきれいなビーカー)で洗います。
    10. 1% Eosinを2分間添加し、続いて1 min 96% EtOH、30 s 96% EtOH(清浄な溶液を含む別のビーカー)、30 s 96% EtOH(清浄な溶液を含む別のビーカー)、2 分間キシレン、1 分間キシレン(清浄な溶液を含む別のビーカー)、2 分間キシレン(別のビーカーと清浄な溶液)を添加します。
      注:または、自動スライドステイナーを使用します。
    11. 自動スライドシーラーを使用してスライドをシールします。準備されたスライドは、光学顕微鏡で保管および評価する準備ができています。
      注:または、染色した組織にポリスチレンマウンタントの薄層を置き、ガラスカバースリップで覆うことにより、手動でスライドシールを実行します。
      注意: PFA、EtOH、アセトン、キシレンを含む手順は、実験室のヒュームフードの下で実行する必要があります。

2. ラット眼球切片の作製とスライド取付

注:このプロトコルは、ラットの眼球の切片を準備する方法を示し、以下から採取した眼球を使用して開発されました:6週齢の雄SHRラット(平均重量115.5g)、動脈性高血圧症の12週齢の雄SHRラット(平均重量262.5g)、6週齢の雄WKYラット(平均重量143.5g)、12週齢の雄WKYラット(平均重量265g)、 12週齢の雄ルイスラット(平均体重310g)、および糖尿病誘発性糖尿病を有する16週齢の雄ルイスラット(平均体重259g)。

  1. 摘出
    1. 小さな鉗子を使ってまぶたを開きます。まぶたを押して眼球を脱出させます。
    2. 小さくて鋭いハサミで眼球の後ろの組織を切り取り、眼球をソケットから解剖します。
      注:たとえば、眼球の外側直筋の腱の切り株に小さな縫合糸を結び、眼球の側頭側をマークすることにより、向きを良くするために眼球に印を付けます。
  2. 組織の固定
    1. 除核した眼球を1.5 mLの微量遠心チューブに入れ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解したパラホルムアルデヒド(PFA)の4%溶液に24時間休ませます。
    2. これに続いて、眼球を10%ショ糖溶液で24時間処理し、次に取り出して20%ショ糖溶液に24時間置き、最後に取り出してショ糖30%溶液に24時間置きます。
      注意: プロセス全体を通して、眼球を4°Cの低温に保ちます。 スクロース浸潤のための針の穿刺は、眼球の損傷のリスクを最小限に抑えるために避けるべきです。
  3. ティッシュの凍結と保管
    1. ショ糖溶液から眼球を取り出し、ペーパータオルで軽くたたいて乾かします。
    2. 眼球を清潔な1.5 mL微量遠心チューブに入れ、将来の処理のために-80°Cで凍結します。
      注:-80°Cで保存した場合、眼球は将来の処理まで最大12か月間生存し続けることができます。
  4. スライドの準備
    1. 眼球を冷凍庫と微量遠心チューブから取り出します。鋭いメスで矢状面に沿って眼球を半分に切ります。レンズを取り外して廃棄します。
      注:この手順は、冷凍庫から取り出したばかりの冷凍眼球で実行するのが最も簡単です。眼球の切断中、水晶体が周囲の組織を損傷する可能性があります。損傷のリスクを最小限に抑えるために、非常に鋭利なメスを使用し、注意を怠らないでください。
    2. 眼球を室温で解凍します。2つの半分をカセットに入れ、流水で20分間すすぎ、ショ糖を洗い流します。
    3. 眼球をヒュームフードの下に入れ、次に取り出して脱水します:70%エチルアルコール(EtOH)溶液15分間、80%EtOH溶液15分間、96%EtOH溶液15分間、99.9%EtOH溶液15分間、アセトン7分間。
    4. 眼球をキシレンに7分間入れて、ドラフトの下に置きます。
    5. 固体パラフィンをビーカーに入れ、パラフィン製造業者が指定した融解温度(パラフィンの融解温度は46°C〜68°C)よりも高い温度に設定した実験室のインキュベーターに入れて、パラフィンを溶かします。パラフィンが完全に溶けた後(時間は使用するパラフィンの量によって異なります)、眼球をパラフィンの入ったビーカーに移し、インキュベーター内で1時間保温します。パラフィンが組織に浸透してから1時間の間に、10〜15分ごとにパラフィンを攪拌します。
      注:このステップには、溶液を攪拌しながらパラフィン浸潤を可能にするティッシュプロセッサーを使用することができます。
    6. 以下で説明するように、眼球をパラフィンブロックに埋め込みます。
      1. カセットを開き、トップカバーを取り外します。金型を選び、型底を覆うように少量のパラフィンを注ぎます。鉗子でカセットから眼球を取り出し、型内のパラフィンに置きます。片方の眼球の半分をカップの底を上にして置き、もう片方を下にして置きます。
        注:眼球の半分をカップの底を上にして半分を上にし、もう半分を下にして配置すると、矢状面での組織切断が可能になります。このようにして、角膜、虹彩、毛様体、瞳孔、末梢、および中心網膜を通る切片が得られます。
      2. -15°Cに設定された冷却プレートで金型を短時間冷却し、パラフィンがわずかに固化して眼球を所定の位置に固定します。眼球をパラフィンで丁寧に覆い、カセットの底をブロック状にします。ブロックを冷却プレートの上に置いて、完全に固めます。次に、ブロックを金型から取り外し、パラフィンブロックを冷却プレートに戻し、少なくとも15分間冷ましてから切断します。
    7. ミクロトームにパラフィンブロックを固定します。ミクロトームをブロックから余分なパラフィンをトリミングするようにセットし(15μmカットするように設定)、眼球の中心に達するまでトリミングします。ミクロトームの設定を変更して、より薄い切片を切断し(3.5μmを切断するように設定)、切片をスライド上に置きます。隣接するウォーターバスを備えたミクロトームを使用している場合は、湿ったティッシュでスライドから余分な水分を取り除きます。
      注:目標は、瞳孔を通して少なくとも3つの断面を取得することです。研究者の経験が浅いほど、瞳孔のレベルで切片化を確実にするために、より多くの切片を取得する必要があります。1 つのスライドにいくつかのセクションを配置します。また、経験の浅い研究者の場合は、組織を厚く、たとえば4 μmまたは5 μmの厚さに切断します。隣接するウォーターバスを備えたミクロトームを使用すると、ウォーターバスを使用しないミクロトームを使用する場合と比較して、組織切片をスライドに移すプロセスがはるかに容易になります。
    8. スライドを取り外し、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)による染色を手動で開始するには、スライドを次の溶液に順次入れたり取り外したりします。7分間のキシレン、5分間のキシレン(きれいな溶液を含む別のビーカー)、および5分間のキシレン(クリーンな溶液を含む別のビーカー)から始めます。これに続いて、2分間の96%EtOH、1分間の96%EtOH(クリーンな溶液を含む別のビーカー)、1分間の96%EtOH(クリーンな溶液を含む別のビーカー)を使用します。
    9. 5分間の流水で洗い、次に2分間のメイヤーヘマトキシリン、2分間のメイヤーのヘマトキシリン(きれいな溶液を含む別のビーカー)、5分間の流水、5分間の流水(別のきれいなビーカー)で洗います。
    10. 1% Eosinを2分間添加し、続いて1 min 96% EtOH、30 s 96% EtOH(清浄な溶液を含む別のビーカー)、30 s 96% EtOH(清浄な溶液を含む別のビーカー)、2 分間キシレン、1 分間キシレン(清浄な溶液を含む別のビーカー)、2 分間キシレン(別のビーカーと清浄な溶液)を添加します。
      注:または、自動スライドステイナーを使用します。
    11. 自動スライドシーラーを使用してスライドをシールします。準備されたスライドは、光学顕微鏡で保管および評価する準備ができています。
      注:あるいは、染色された組織にポリスチレンマウンタンタントの薄層を置き、ガラスカバースリップで覆うことにより、手動でスライドシールを行います。
      注意: PFA、EtOH、アセトン、キシレンを含む手順は、実験室のヒュームフードの下で実行する必要があります。

3. 眼球部分の評価

  1. スライドスキャン
    1. スライドを病理組織学的スライドスキャナーに入れ、スキャンモード(40倍)を使用して切片をスキャンします。画像を高解像度のデジタルファイルとして保存します。
  2. スライド解析
    1. 画像表示ソフトウェアを使用してスキャンしたファイルを開きます。瞳断面を求め、連続する3つのセクションを解析します。
    2. 網膜の最も厚い部分を見つけ、右上隅にある倍率ボックスを押して 20倍を選択することで、画像を20倍に拡大します。マウスを網膜の最も厚い部分のELMのレベルに移動し、マウスの右ボタンを押して、[ 注釈]と [定規]を選択します。
    3. マウスをILMの方に移動し、左側のボタンをクリックします。測定にRTというタイトルを付け、タイトルを表示し、長さを表示するチェックボックスをオンにします。このようにして、網膜の厚さ (RT) が測定され、測定値が μm で表示されます。代表的な結果を 図 2 と 図 3 に示します。
    4. 定規を使用して、ONL、OPL、INL、IPLなどの各網膜層の厚さを測定し、それらにラベルを付けます。代表的な結果を 図 4 と 図 5 に示します。
    5. GCL内の細胞の数を数えるには、網膜の所定の長さを確立します。例えば、マウスの網膜には500μm切片を1つ、ラットの網膜には100μm切片を5つ使用します。
    6. 定規を使用して、GCLに沿って選択した距離を測定します。マウスの右ボタンを押し、[ Annotate > Saved > 1x RBC]を選択します。網膜の所定の長さにわたってGCLに沿って、丸いヘマトキシリン染色体として識別された各細胞をクリックします。丸で囲まれたセルの数を数えます。代表的な結果を 図 6 と 図 7 に示します。
    7. 3つの連続するセクションを分析した後、すべての測定値の平均を描画します。

結果

提示されたプロトコルの使用により、眼球の特定の構造の解剖学的構造および形態を詳細に評価することができる。当チームでは、緑内障、糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症などの網膜疾患における神経変性の病態解明に取り組んでいます。網膜の神経変性の特徴を評価するために、RT(マウス眼球-図2、ラット眼球-図3)、ONL、OPL、INL、およびIPL(マウス眼球-図4、ラット眼球-図5)、およびGCLの細胞数(マウス眼球-図6、ラット眼球-図7)を評価しました。GCL の RT と細胞は、網膜中心で最も高く、末梢で最も低くなると予想されます。瞳孔のレベルで眼球を切断することにより、中央(眼球の後極)および末梢(毛様体に近い)網膜を通る断面が1つのスライドで達成されます。

GCL細胞のカウントは非常に客観的であると考えることができますが、偏った切片化によって引き起こされるバイアスは、特定の網膜層の測定結果に影響を与える可能性があります。バイアスを避けるために、測定値は、特定の層の厚さとRT値の比率(ONL/RT、OPL/RT、INL/RT、およびIPL/RT)として表すことができます。

ラベル付けされた部分を示す目の解剖学図:網膜、強膜、水晶体、角膜、視神経、黄斑。
図1:眼球の解剖学。 眼球の矢状断面とその最大構造のラベル付け。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

組織層を示す網膜断面の顕微鏡画像、厚さ測定125μm。
図2:マウスの網膜の厚さ。 緑色のバーでマークされた最も広い点で、外部制限膜から内部制限膜までの網膜厚さ(RT)の測定。マウス眼球(系統:C57Bl/6、生後:44週)。左隅のスケールバーは100μmの長さを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

網膜層を示す組織学的切片、厚さ53.4μm。顕微鏡画像、組織研究。
図3:ラットの網膜の厚さ。 緑色のバーでマークされた最も広い点で、外部制限膜から内部制限膜までの網膜厚さ(RT)の測定。ラットの眼球(系統:ルイス、生後:16週)。左隅のスケールバーは100μmの長さを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

網膜組織断面図;測定された層:IPL、INL、OPL、ONL;顕微鏡分析。
図4:マウスの網膜層。 個々の網膜層の厚さの測定:外側核層(ONL)、外側網状層(OPL)、内側核層(INL)、および内側網状層(IPL)は、緑色のバーでマークされています。マウス眼球(系統:C57Bl/6、生後:44週)。左隅のスケールバーは100μmの長さを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

標識層を含む網膜断面の顕微鏡画像:OPL、ONL、IPL、INL;スケールバー100μm。
図5:ラットの網膜層。 個々の網膜層の厚さの測定:外側核層(ONL)、外側網状層(OPL)、内側核層(INL)、および内側網状層(IPL)は、緑色のバーでマークされています。ラットの眼球(系統:ルイス、生後:16週)。左隅のスケールバーは100μmの長さを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

層状細胞構造を示す組織学セクション、顕微鏡画像、組織分析、500 μm スケール。
図6:マウスの神経節細胞層の細胞を数える。 網膜に沿って神経節細胞層(GCL)の細胞を500μmの長さでカウントする方法。単一細胞体は、神経節細胞層内に位置する丸いヘマトキシリン染色体として同定されました。セルは黒い円でマークされています。マウス眼球(系統:DBA/2、生後:44週)。左隅のスケールバーは100μmの長さを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

組織学スライド、網膜断面;組織層が見える。顕微鏡検査、100μmスケール。
図7:ラットの神経節細胞層の細胞を数える。 網膜に沿って神経節細胞層(GCL)の細胞を100μmの長さでカウントする方法。単一細胞体は、神経節細胞層内に位置するヘマトキシリン染色された丸い体として同定されました。セルは黒い円でマークされています。ラットの眼球(系統:ルイス、生後:16週)。左隅のスケールバーは100μmの長さを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

マウスとラットの眼球の組織学的検査は、実験眼科の分野で強力なツールです。眼科疾患の経過に伴う眼の構造の変化に関連する新しい情報を提供できますが、これは臨床現場では観察されません。記載されたプロトコルは、網膜の組織学的分析を行う簡単な方法を提示する。角膜などの前部組織を処理するために必要な手順の微妙な点については、ここでは説明しません。

提示された研究では、眼球以外の他の組織(血液、腎臓)が研究目的で採取されたため、動物を安楽死させた後に除核術が行われました。ただし、麻酔下で生きた動物に対しても核摘出を行うことができます。Wildingらは手順14を説明していますが、読者の皆様には、除核手順の写真を見ていただきたいと思います。

マウスとラットの眼球のスライド調製のプロトコルは似ていますが、スライドの調製中に考慮すべきマウスとラットの眼球の主な違いは、そのサイズです。ラットの眼球は、マウスと比較して8倍〜10倍大きい体積を持っていますが、マウスの眼球の平均軸方向の長さは約3.2 mmであり、ラットの眼球の軸方向の長さは通常、約6.91mm15,16振動します。これにより、処理中に組織への試薬の浸透を改善するために、ラットの眼球を半分に切断する必要性が容易になります。また、試薬がラット組織に浸透するのに必要な時間は、マウスの眼球よりも長くなります。ネズミの眼球を半分に切るときは、固くて凍ったレンズが障害になる可能性があるため、鋭利な刃を使用することが重要です。

議論する価値のあるもう一つのポイントは、動物から収穫した後の組織の固定です。提示されたプロトコルでは、眼球を、除核後、PFAで固定し、スクロースの溶液に浸した。スクロースは、凍結中に形成される氷の結晶による損傷から大きな組織の細胞を保護するため、凍結保護剤として機能します17。組織を凍結することで、研究者は組織をより長く保存することができ、ミクロトームによる組織病理学的解析(提示されているようなもの)、クライオトームによる組織病理学的解析、共焦点顕微鏡による評価のための免疫標識など、将来のさまざまな検査にも使用できます。例えば、ラットの眼球を半分に切断する場合(ステップ2.4.1)、切断が効率的かつ迅速に(5〜10秒以内に)行われ、眼球が解凍する時間がない場合、眼球の半分を組織病理学に使用し、もう半分を将来の免疫標識のために冷凍庫に戻すことができる。以前にパラフィンが浸潤した組織では、パラフィン固定後にタンパク質エピトープのコンフォメーションが変化する可能性があるため、免疫標識を行うことはお勧めしません。しかし、研究者グループがミクロトームを使用して組織病理学的解析を行うことを計画しているだけの場合は、パラフィン包埋のための組織を固定するより簡単で標準的な方法を使用できます-たとえば、マウスの場合はステップ1.2.1〜1.4.1、ラットの場合はステップ2.2.1〜2.4.2を実行する代わりに、組織をPFAの10%溶液に24時間入れます。 その後、処理されるまで4°CのPBSで保存します。その後、組織は凍結しないため、スクロースは凍結保護剤として必要ありません。この提案方法を使用すると、凍結プロセスが回避され、有益であることが証明され、より高品質のスライドが得られる可能性があります。眼球の凍結は、研究者が組織病理学的検査を行う時間を選択する際の自由度を高めますが、サンプルの品質を低下させ、網膜剥離につながる可能性のあるステップです。ただし、組織を4°Cで保存すると生物学的安定性が短くなり、組織は4週間以内に分析する必要があることを覚えておく必要があります。また、ラットの眼球で作業している間、ステップ2.4.1(眼球を半分に切断する)は、凍結していない眼球で実行するのがはるかに難しくなります。

提示された方法論は、Chai et al.18、Igarashi et al.19、Zhang et al.20、Dorfman et al.21によって記述された方法論に基づいて開発されたものであり、個人的な経験と試行錯誤の方法に基づいています。網膜の厚さと個々の層を測定する方法は、Chai et al.16 および Barber et al.18,22 によって提示された方法論に基づいて説明されています。網膜RGC計数法は、Chaiら16、Zhangら18、Steinleら19、およびDorfmanら18,20,21,23の研究のレビューから開発されました。全体として、眼球の組織病理学的スライドの調製は、眼球が球状であるため、取り扱い、切断、および切片化がより困難であるため、標準的なホルマリン固定パラフィン包埋組織スライド調製とは異なります。また、強膜は組織への試薬浸潤の障壁となります。眼球の組織学的スライドを準備する際には、眼球の内部の繊細な構造を傷つけないように注意しながら、より繊細かつ正確な方法で作業する必要があります。このプロトコルの変更は、パラフィン包埋の代わりにメタクリレート包埋技術の使用を含んでもよく、これにより報告されるより良い形態学的結果が得られる可能性がある。しかし、網膜の評価にこの方法を使用した研究者はほとんどいません24,25。

このプロトコルにはバイアスがないわけではありません。私たちのチームが苦労した最大の問題は、網膜の裂傷と網膜剥離でした。特に裂けやすいのはラットの眼球の網膜で、スライドの準備前に半分に切らなければならなかったため、網膜が損傷しやすかった。網膜剥離のため、このプロトコルは脈絡膜、網膜色素上皮、または視細胞セグメント層の評価には使用できません。ただし、私たちのチームは、このプロトコルを使用して内側の網膜 (ILM から ELM) を評価できると考えています。網膜の裂傷と剥離の量を最小限に抑えるために、プロトコルの各ステップは慎重に、ゆっくりと、正確な動きで実行する必要があります。

網膜の組織病理学的分析は、標準的なヒト診断の一部ではありませんが、前臨床研究で広く使用されている方法です。前臨床試験における網膜の病理組織学的評価の結果は、臨床現場で実施可能なin vivo検査中に網膜を通る断面を示す検査である光コヒーレント断層撮影法(OCT)26の結果と関連し、議論することができます。ただし、OCTはそれほど詳細ではない調査です。したがって、前臨床研究の一環として実施された組織学的研究から得られる情報は、医学知識の発展に不可欠であり、かけがえのないものです。

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

ラットを含むこの研究は、プロジェクトTIME 2 MUW - 2014-2020年の運用プログラム知識教育開発の下で欧州社会基金が共同出資したワルシャワ医科大学の発展の機会としての卓越性教育の一環として資金提供されました。協調融資契約の番号:POWR.03.05.00-00-Z040/18-00。マウスを含むこの研究は、2020年から2022年にかけて実施されたプロジェクトの一環として実施され、ワルシャワ医科大学が取得した科学への補助金によって資金提供されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトン ケムプール 
デュモンピンセット #5、11cm、0.05 x 0.01mm チップワールド精密機器14095小型、顕微手術用鉗子
EosinMar-Four4P.05.2001/L水溶液
エチルアルコール 96 %Chempur CH.ET。AL.96%CZDA。
エチルアルコール 99.9 %Chempur CH.エチル。ALK.99,9%BWEtOH氷河の70%および80%溶液を調製するために使用します
- 86 °C超低温冷凍庫NU-9483ENuAire13027D0034凍結温度-80°C;C
ガラススライドMar-FourMI.15.01673説明のための両面マットフィールドを備えたすりガラススライド
ライカ CV5030 全自動ガラスカバースリッパーライカバイオシステムズ 14,04,78,80,101自動スライドシーラー 
メイヤーのヘマトキシリンChempur 
メタルベースモールド 15 mm  x 15 mmライカバイオシステムズ 
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0ミクロトー
ム ミクロトーム カミソリ刃Mar-FourHI.N.35切削角度 35°
マイクロツイン生検カセットMar-FourLN.13874550
マイクロ波ハイブリッド組織プロセッサマイルストーン
マルチステイナー ライカ ST5020ライカ バイオシステムズ 自動スライドステイナー 
NanoZoomer 2.0-HT スライドスキャナー浜松C9600病理組織スライドスキャナー
NDP.view2 画像閲覧ソフト浜松U12388-01画像閲覧ソフト
パラフィンパトワックスプラスMar-Four4P.PWP.010融解温度 56 °C;C - 58 >C
パラホルムアルデヒドSigma - Aldrich441244-1KGPBS PBS 錠剤に 4% 溶液を調製
Merck Millipore524650-1EA製造元の指示に従って、リン酸緩衝生理食塩水の溶液を調製するために使用
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLThermo Scientific69715
Refrigerator-freezer EN14000AWElectrolux925032562-004°C;C
メス刃スワン・モートンT.OST.SKAL00.024
ショ糖ケムプール 
SuperCut スプリングハサミ 12.5cm 湾曲したワールド精密機器501925湾曲した小さな顕微手術ハサミ
自動シーラー用テープMar-FourKP-3020/SMRH001
キシレンケムプール CH.KSYL.5l.METAL.OP 
111024800CH1246874023803081冷蔵427720906

参考文献

  1. Kels, B. D., Grzybowski, A., Grant-Kels, J. M. Human ocular anatomy. Clin Dermatol. 33 (2), 140-146 (2015).
  2. Gupta, M. P., Herzlich, A. A., Sauer, T., Chan, C. C. Retinal anatomy and pathology. Dev Ophthalmol. 55, 7-17 (2016).
  3. Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  4. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  5. Boulton, M., Dayhaw-Barker, P. The role of the retinal pigment epithelium: Topographical variation and ageing changes. Eye (Lond). 15 (Pt 3), 384-389 (2001).
  6. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  7. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Chédotal, A. Development of retinal layers. C R Biol. 337 (3), 153-159 (2014).
  8. Adams, T., Chernoff, E., Wilson, J., Dharmarajan, S. Reactive muller glia as potential retinal progenitors. InTech. , (2013).
  9. Salman, A., Mcclements, M. E., Maclaren, R. E. Insights on the regeneration potential of müller glia in the mammalian retina. Cells. 10 (8), 1957(2021).
  10. Marchesi, N., Fahmideh, F., Boschi, F., Pascale, A., Barbieri, A. Ocular neurodegenerative diseases: Interconnection between retina and cortical areas. Cells. 10 (9), 2394(2021).
  11. Enoch, J., Mcdonald, L., Jones, L., Jones, P. R., Crabb, D. P. Evaluating whether sight is the most valued sense. JAMA Ophthalmol. 137 (11), 1317-1320 (2019).
  12. Struebing, F. L., Geisert, E. E. What animal models can tell us about glaucoma. Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 365-380 (2015).
  13. Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609(2012).
  14. Wilding, L. A., Uchihashi, M., Bergin, I. L., Nowland, M. H. Enucleation for treating rodent ocular disease. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (3), 328-332 (2015).
  15. Lin, C. H., et al. A protocol to inject ocular drug implants into mouse eyes. STAR Protoc. 3 (1), 101143(2022).
  16. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in sd-oct imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  17. Castro, G., Navajas, E., Farah, M. E., Maia, M., Rodrigues, E. B. Migration, integration, survival, and differentiation of stem cell-derived neural progenitors in the retina in a pharmacological model of retinal degeneration. ISRN Ophthalmol. 2013, 752161(2013).
  18. Chai, G. R., Liu, S., Yang, H. W., Chen, X. L. Quercetin protects against diabetic retinopathy in rats by inducing heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 16 (7), 1344-1350 (2021).
  19. Igarashi, T., et al. Tyrosine triple mutated aav2-bdnf gene therapy in a rat model of transient iop elevation. Mol Vis. 22, 816-826 (2016).
  20. Zhang, W., et al. Therapeutic efficacy of neural stem cells originating from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in diabetic retinopathy. Sci Rep. 7 (1), 408(2017).
  21. Dorfman, D., Aranda, M. L., Rosenstein, R. E. Enriched environment protects the optic nerve from early diabetes-induced damage in adult rats. PLoS One. 10 (8), e0136637(2015).
  22. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. J Clin Invest. 102 (4), 783-791 (1998).
  23. Steinle, J. J., Kern, T. S., Thomas, S. A., Mcfadyen-Ketchum, L. S., Smith, C. P. Increased basement membrane thickness, pericyte ghosts, and loss of retinal thickness and cells in dopamine beta hydroxylase knockout mice. Exp Eye Res. 88 (6), 1014-1019 (2009).
  24. Polley, E. H., Walsh, C. A technique for flat embedding and en face sectioning of the mammalian retina for autoradiography. J Neurosci Method. 12 (1), 57-64 (1984).
  25. Turner, K. W. Hematoxylin toluidine blue-phloxinate staining of glycol methacrylate sections of retina and other tissues. Stain Technol. 55 (4), 229-233 (1980).
  26. Cheng, J., et al. Correlation of optical coherence tomography and retinal histology in normal and pro23his retinal degeneration pig. Transl Vis Sci Technol. 7 (6), 18(2018).

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網膜を評価するためのラットおよびマウス眼球の組織学的スライドの調製と分析
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